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靶向CD19和CD20的双顺反子嵌合抗原受体及其用途

文献发布时间：2023-06-19 11:21:00

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2018年9月17日提交的共同未决的美国临时专利申请No.62/732,263的权益，其全部内容通过引用并入本文。关于联邦政府赞助的研究和开发的声明

本发明是在政府支持下由国立卫生研究院国家癌症研究所(NationalInstitutes of Health,National Cancer Institute)完成的，项目编号为Z01BC011417。政府享有本发明的某些权利。

以引用方式并入电子材料

将与本申请同时提交的计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表过引用以其整体并入本文，该序列表被如下识别：2019年9月13日的名为“744443_ST25.txt”的一个104,552字节ASCII(文本)文件。

发明背景

癌症是公众健康问题。尽管在诸如化疗的治疗方面取得了进展，但许多癌症(包括血液恶性肿瘤)的预后可能较差。因此，存在对癌症，特别是血液恶性肿瘤的额外治疗的未满足的需要。

发明简述

本发明的实施方案提供了包含编码嵌合抗原受体(CAR)构建体的核苷酸序列的核酸，所述构建体包含：(a)第一CAR，其包含第一抗原结合结构域，第一跨膜结构域和第一细胞内T细胞信号传导结构域；(b)包含第二抗原结合结构域、第二跨膜结构域和第二细胞内T细胞信号传导结构域的第二CAR；和(c)切割序列；其中切割序列位于第一和第二CAR之间，其中第一CAR的第一抗原结合结构域对CD19具有抗原特异性，并且其中第二CAR的第二抗原结合结构域对CD20具有抗原特异性。

本发明的其它实施方案提供了由核酸编码的相关多肽、重组表达载体、宿主细胞、细胞群和药物组合物。

本发明的其它实施方案提供了检测哺乳动物中癌症的存在以及治疗或预防癌症的相关方法。

附图的简要说明

图1A-1J是说明CARs的结构的示意图。图1A-1E示例了双顺反子CARs。图1A说明Hu1928-C2B8BB包括来自人CD8α的前导序列(SS)。在SS后是scFv，其从N端至C段由Hu抗CD19scFv(包括通过接头连接的Hu19的重链和轻链可变区)、人CD8α铰链和跨膜结构域，人CD28的细胞内T细胞信号传导结构域、人CD3的细胞内T细胞信号传导结构域、包括F2A核糖体跳跃和切割序列(本案中为口蹄疫病毒[F2A]氨基酸序列)的切割序列和C2B8抗CD20 scFv(包括通过接头连接的C2B8的重链和轻链可变区)组成。在scFv之后，存在CD8α铰链和跨膜结构域，随后是人4-1BB的细胞内T细胞信号传导结构域，随后是细胞内T细胞信号传导结构域CD3ζ。图1B说明Hu1928-11B8BB具有与Hu1928-C2B8BB相同的序列，除了11B8轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图1C说明Hu1928-8G6-5BB具有与Hu1928-C2B8BB相同的序列，除了用8G6轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图1D说明Hu1928-2.1.2BB具有与Hu1928-C2B8BB相同的序列，除了2.1.2轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图1E说明Hu1928-GA101BB具有与Hu1928-C2B8BB相同的序列，除了用GA101轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图1F-1J说明抗CD20 CARs。图1F说明C2B8-CD8BBZ包括来自人CD8α的前导序列(SS)。在SS后是scFv，其从N-末端到C-末端由以下组成：C2B8(包括通过接头连接的C2B8的重链和轻链可变区)、人CD8α铰链和跨膜结构域、CD8α铰链和跨膜结构域，随后是人4-1BB的细胞内T细胞信号传导结构域，随后是细胞内T细胞信号传导CD3ζ结构域。图1G说明11B8-5CD8BBZ具有与C2B8-CD8BBZ相同的序列，除了11B8轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图1H说明8G6-5CD8BBZ具有与C2B8-CD8BBZ相同的序列，除了用8G6轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图11说明2.1.2-5CD8BBZ具有与C2B8-CD8BBZ相同的序列，除了用2.1.2轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。图1J说明1GA101-5CD8BBZ具有与C2B8-CD8BBZ相同的序列，除了用GA101轻链和重链可变区取代C2B8轻链和重链可变区。

图2A-2D是显示CAR Hu1928-C2B8BB(图1A所示的CAR)的T细胞表达的一组图。用抗CD3单克隆抗体OKT3刺激外周血单核细胞。两天后，用编码CARsHu19-CD828Z(图2B),C2B8-CD828Z(图2C),Hu1928-C2B8BB(图2D)的γ-逆转录病毒载体转导细胞。转导后9天(整个培养的第11天)，细胞用CD3和抗CAR抗体染色。以活CD3+淋巴细胞设门作图。图2A是来自未转导的对照的图。图2B和2C分别是CARsHu19-CD828Z(抗CD19 CAR)和C2B8-CD828Z(抗CD20CAR)的图。

图3是显示表达CAR的CD8+T细胞以抗原特异性方式脱颗粒的一组图。T细胞未被转导或用Hu19-CD828Z,C2B8-CD828Z或Hu1928-C2B8BB转导。转导后8天，T细胞与CD19

图4是显示表达CAR的CD4

图5是显示CAR T细胞特异性识别CD19和/或CD20的一组图。将表达Hu1928-C2B8BB的CD8

图6是显示表达Hu1928-C2B8BB的T细胞有效杀伤淋巴瘤细胞系细胞的图。将T细胞保持未转导(UT，空心三角形指向上方)或用Hu19-CD828Z(空心三角形指向下方),C2B8-CD828Z(空心正方形)或Hu1928-C2B8BB(空心圆圈)转导。T细胞与CD19

图7A-7D是显示表达Hu1828-C2B8的T细胞响应CD19和CD20而增殖的一组图。用Hu19-CD828Z,C2B8-CD828Z或Hu1928-C2B8BB转导T细胞。11天后，用羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFSE,Invitrogen)标记表达CAR的T细胞，并与照射的CD19-K562细胞，CD20-K562细胞或阴性对照NGFR-K562细胞(下面有阴影的线)一起培养。T细胞和经照射的靶细胞的共培养持续4天，然后对细胞进行流式细胞术以评估CFSE稀释度作为增殖的量度。当暴露于表达其靶抗原的细胞(黑线)时，表达CAR的T细胞优先增殖。y轴上的细胞计数也表明，当CAR T细胞暴露于靶抗原时，在4天培养期结束时的T细胞数较高。图7A和7B是用Hu19-CD828Z转导的细胞的图，图7C和7D是用Hu19-CD828Z转导的细胞的图，图7E和7F是用Hu1928-C2B8BB转导的细胞的图。

图8A和8B显示CAR T细胞表面表达。转导后5天，评价4种不同CARs的表达(Hu19-CD828Z,C2B8-CD8BBZ,Hu1928-C2B8BB和Hu1928-11B8BB)。图8A显示用抗-Hu19抗体染色，其结合包括在Hu19-CD828Z中的接头。Hu19-CD828Z与用包括Hu19-CD828Z CAR的构建体转导的所有T细胞结合。图8B显示用结合C2B8的抗利妥昔单抗抗体染色。抗利妥昔单抗抗体与含有C2B8的CAR构建体结合。以活的CD3+淋巴细胞设门作图。

图9显示CD8

图10显示了以抗原特异性方式脱颗粒的CD4

图11A-E显示抗CD19 CARs在双顺反子构建体中的表达。用编码所示双顺反子CAR构建体的载体转导T细胞，或使其不被转导，用Kip-1抗体用流式细胞术评价抗CD19 CARHu19-CD828Z的表达。以活CD3

图12A-E显示抗CD20 CARs在双顺反子构建体中的表达。用编码所示双顺反子CAR构建体的载体转导T细胞或使其不被转导，用Kip-4抗体用流式细胞术评价由连字符后CAR名称的第二部分所示的抗CD20 CAR的表达。以活CD3

图13A和13B是显示CD4+CAR T细胞以CD19特异性方式脱颗粒的一组图。用所示双顺反子CAR构建体转导的T细胞与CD19-K562细胞或阴性对照NGFR-K562细胞一起培养4小时。通过CD107a脱颗粒评价脱颗粒。显示CD4+T细胞。以活的CD4

图14A和14B是显示CD4

图15A和15B是显示CD8

图16A和16B是显示CD8

图17是显示本发明的构建体可消除小鼠中的肿瘤的图。以mm

图18是显示用本发明的CARs治疗可以提高小鼠存活率的图。存活百分比是在y轴上，T细胞浸润后的天数是在x轴上。用未转导的(空心三角形)和SP6-CD828Z T(空心圆)细胞处理的小鼠在少于30天内显示出0％的存活率，而Hu1928-8G6-5BB(实心菱形)和Hu1928-2.1.2BB(空心正方形)被证明是有效的肿瘤治疗，在50天后具有100％的存活率。

图19是根据本发明的一个实施方案，通过存在2A部分引起的核糖体跳跃的机制，在转导的T细胞中产生2个分离的CAR RNA分子的示意图。

图20是显示用编码Hu1928-2.1.2BB CAR构建体的γ-逆转录病毒转导后5天，在T细胞表面上表达Hu19-CD828Z和Hu20-CD8BBZ的一组图。门控是在CD4

图21是显示来自图20所示相同培养物的T细胞的一组图，但用Kip-4抗体代替Kip-1抗体进行CAR染色。

图22是显示未转导(UT)T细胞，Hu1928-2.1.2BB T细胞，Hu19-CD828Z T细胞(Hu1928)和Hu20-CD8BZ T细胞(2.1.2BB)与靶细胞一起培养4小时后的代表性CD107a测定结果的一组图。所述T细胞特异性应答靶细胞而脱颗粒，其中Hu1928-2.1.2BB T细胞应答CD19

图23是显示来自图22所示的相同培养物的T细胞的一组图，但是CD4+T细胞而不是CD8+T细胞的脱颗粒。

图24是显示用Hu1928-2.1.2BB,Hu19-CD828Z或Hu20-CD8BBZ转导的T细胞进行CFSE增殖测定的结果的一组图。直方图的曲线下的面积与细胞的数目成比例。NGFR-K562,CD19-K562(上排)或CD20-K562(下排)的曲线下面积和它们的重叠如图24所示。

图25是显示细胞毒性测定的结果的图，所述细胞毒性测定将CD19

图26是显示细胞毒性测定结果的图，所述细胞毒性测定比较了未转导或用Hu1928-2.1.2BB转导或用阴性对照CAR SP6-CD828Z转导的T细胞的存活率。将人慢性淋巴细胞白血病细胞用作CD19

图27是显示剂量滴定研究的肿瘤体积结果的图。在CAR T细胞输注之前，经6天注射四百万个ST486细胞以建立可触知的皮内肿瘤。用单次输注分级剂量的Hu1928-2.1.2BBT细胞处理小鼠，如图27所示。

图28是显示图27的剂量滴定实验的存活率结果的图。

图29是显示使用ST486空(CD19-/-)细胞系的研究的肿瘤体积结果的图。在CAR T细胞输注之前，经6天注射四百万个ST486(CD19-/-)细胞以建立可触知的皮内肿瘤。用单次输注Hu1928-2.1.2BB T细胞，Hu1928 T细胞(Hu19-CD828Z)或2.1.2BB T细胞(2.1.2BB-CD8BBZ)处理小鼠，如图29所示。

图30是显示图29的研究的存活率结果的图。

图31是显示使用NALM6细胞系(CD19

图32是显示图31的研究的存活率结果的图。

图33是显示测量研究中使用的小鼠体重的研究结果的图。在NSG小鼠中建立ST486细胞的实体瘤，然后给小鼠输注未转导的T细胞或5×10

图34是显示永生化研究的代表性结果的图。在无外源性白细胞介素-2(IL-2)的培养基中观察用MSGV1-Hu1928-2.1.2BB转导的T细胞数目。在第0天将IL-2从培养物中洗出。

发明详述

CAR是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导或T细胞活化结构域连接的抗体的抗原结合结构域。CAR能够利用单克隆抗体的抗原结合特性以非MHC限制的方式将T细胞特异性和反应性重定向到选择的靶标。非MHC-限制性抗原结合使表达CARs的T细胞能够识别不依赖于抗原加工的抗原，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。此外，当在T细胞中表达时，CARs有利地不与内源性T细胞受体(TCR)α和β链二聚化。

第一CAR对CD19具有抗原特异性，第二CAR对CD20具有抗原特异性。本文所用的短语“具有抗原特异性”和“引发抗原特异性应答”是指CAR可以特异性结合并免疫性识别抗原，从而CAR与抗原的结合引发免疫应答。

CD19(也称为B淋巴细胞抗原CD19,B4和CVID3)是仅由造血系统的B淋巴细胞和滤泡树突细胞表达的细胞表面分子。它是最早表达的B系限制抗原，存在于大多数前B细胞和大多数非T细胞急性淋巴细胞白血病细胞和B细胞型慢性淋巴细胞白血病细胞上(Tedder和Isaacs,J.Immun.,143:712-717(1989)).

CD20(也称为B淋巴细胞抗原CD20)是在所有B细胞表面上表达的活化糖基化磷蛋白。在B细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、B细胞慢性淋巴细胞白血病、转化性性蕈样霉菌病和黑色素瘤癌干细胞上发现CD20。

本发明的双顺反子CAR构建体可以提供多种优点中的任何一种或多种。尽管已知CAR T细胞是成功的疗法，但已发现抗CD19CAR T细胞疗法后CD19表达的丧失是该疗法失败的机制(例如，已在急性淋巴样白血病和B细胞淋巴瘤中检测到CD19表达的丧失)。此外，一些B细胞淋巴瘤细胞缺乏CD19表达。在一些情况下，CD19阴性恶性肿瘤保留CD20表达。CD20表达的丧失也可能发生在恶性细胞中。本发明的双顺反子CAR构建体可靶向表达CD19,CD20或CD19和CD20两者的恶性肿瘤。如果CD19和CD20两种抗原之一的表达被保留，本发明的双顺反子CAR构建体可以允许治疗失去CD19或CD20表达的恶性肿瘤。通过靶向两种抗原CD19和CD20，本发明的CAR构建体有利地提供了治疗癌症的替代策略。

此外，本发明的核酸只需要一个基因治疗载体来工程化患者的T细胞以表达两个CAR：表达CD19的第一个CAR和表达CD20的另一个CAR。单个T细胞可同时表达两种CARs。

第一CAR包含第一抗原结合结构域。第一抗原结合结构域识别并结合CD19。CAR的抗原结合结构域可包含抗CD19抗体的抗原结合结构域。

第二CAR包含第二抗原结合结构域。第二抗原结合结构域识别并结合CD20。CAR的抗原结合结构域可以包含抗CD20抗体的抗原结合结构域。

第一和第二抗原结合结构域可以分别包含抗CD19或抗CD20抗体的任何抗原结合部分。例如，抗原结合结构域可以是Fab片段(Fab),F(ab')2片段，双价抗体，三价抗体，四价抗体，单链可变区片段(scFv)或二硫键稳定的可变区片段(dsFv)。在一个优选的实施方案中，抗原结合结构域是scFv。scFv是截短的Fab片段，其包括通过合成肽与抗体轻链的V结构域连接的抗体重链的可变(V)结构域，其可以使用常规重组DNA技术产生。然而，在本发明的CARs中使用的抗CD19或抗CD20抗原结合结构域不限于这些示例性类型的抗体片段。

第一抗原结合结构域可包含抗CD19抗体的轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的一个实施方案中，第一抗原结合结构域的重链可变区包含抗CD19抗体的重链互补决定区(CDR)1，重链CDR2和重链CDR3。在本发明的一个实施方案中，第一抗原结合结构域的轻链可变区可以包含抗CD19抗体的轻链CDR1，轻链CDR2和轻链CDR3。在优选的实施方案中，第一抗原结合结构域包含抗CD19抗体的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的全部。

第二抗原结合结构域可包含抗CD20抗体的轻链可变区和/或重链可变区。在本发明的一个实施方案中，第二抗原结合结构域的重链可变区包含抗CD20抗体的重链CDR1，重链CDR2和重链CDR3。在本发明的一个实施方案中，第二抗原结合结构域的轻链可变区可以包含抗CD20抗体的轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。在优选的实施方案中，第二抗原结合结构域包含抗CD20抗体的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的全部。

在本发明的一个实施方案中，CAR的第一抗原结合结构域是scFv Hu19的抗原结合结构域。Hu19的抗原结合结构域特异性结合CD19。Hu19 scFv描述于Alabanza et al.,Molecular Ther.,25:2452-2465(2017)中。本发明的第一CAR可以包含Hu19的所有轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。

在本发明的一个实施方案中，CAR的第二抗原结合结构域是抗体C2B8的抗原结合结构域。C2B8的抗原结合结构域特异性结合CD20。C2B8抗体描述于U.S.5,736,137中，其全文以引用的方式并入本文中。本发明的第二CAR可以包括C2B8的轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的全部。

在本发明的一个实施方案中，CAR的第二抗原结合结构域是抗体11B8的抗原结合结构域。11B8的抗原结合结构域特异性结合CD20。在美国专利申请2004/0167319中描述了11B8抗体，该专利申请全文引入本文作为参考。本发明的第二CAR可以包括11B8的所有轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。

在本发明的一个实施方案中，CAR的第二抗原结合结构域是抗体8G6-5的抗原结合结构域。8G6-5的抗原结合结构域特异性结合CD20。8G6-5抗体在美国专利申请2009/0035322中有所描述，其全文以引用的方式并入本文中。本发明的第二CAR可以包括抗体8G6-5的所有轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。

在本发明的一个实施方案中，CAR的第二抗原结合结构域是抗体2.1.2的抗原结合结构域。2.1.2的抗原结合结构域特异性结合CD20。在WO2006/130458中描述了2.1.2抗体，其全文并入本文。本发明的第二CAR可以包括抗体2.1.2的所有轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。

在本发明的一个实施方案中，CAR的第二抗原结合结构域是抗体GA101的抗原结合结构域。GA101的抗原结合结构域特异性结合CD20。GA101抗体描述于美国专利9,539,251中，其全文以引用的方式并入本文中。本发明的第二CAR可以包括抗体GA101的所有轻链CDR1、轻链CDR2、轻链CDR3、重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3。

在本发明的一个实施方案中，Hu19抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。Hu19抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。Hu19抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。因此，在本发明的一个实施方案中，Hu19抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，Hu19抗原结合结构域包含SEQ ID NO:6和4的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，C2B8抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。C2B8抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列，由SEQ IDNO:18的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。C2B8抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:17的氨基酸序列组成。因此，在本发明的一个实施方案中，C2B8抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，C2B8抗原结合结构域包含SEQ ID NOs:17和18的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，11B8抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。11B8抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，由SEQ IDNO:13的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:13的氨基酸序列组成。11B8抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列，由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。因此，在本发明的一个实施方案中，11B8抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，11B8抗原结合结构域包含SEQ ID NOs:12和13的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，8G6-5抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。8G6-5抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列，由SEQ IDNO:26的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:26的氨基酸序列组成。8G6-5抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列，由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成。因此，在本发明的一个实施方案中，8G6-5抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，8G6-5抗原结合结构域包含SEQ ID NOs:25和26的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，2.1.2抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。2.1.2抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列，由SEQ IDNO:22的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成。2.1.2抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列，由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成。因此，在本发明的一个实施方案中，2.1.2抗原结合结构域包含包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，2.1.2抗原结合结构域包含SEQ ID NO:21和22的氨基酸序列。

在本发明的一个实施方案中，GA101抗原结合结构域包含重链可变区和轻链可变区。GA101抗原结合结构域的重链可变区可以包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，由SEQ IDNO:30的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:30的氨基酸序列组成。GA101抗原结合结构域的轻链可变区可以包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列，由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成。因此，在本发明的一个实施方案中，GA101抗原结合结构域包含含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的重链可变区和/或含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，GA101抗原结合结构域包含SEQ ID NOs:29和30的氨基酸序列。

本发明的第二CAR可以包含11B8抗原结合结构域，其包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3的一个或多个，所述轻链CDR1包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:37的氨基酸序列组成；所述轻链CDR2包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列，由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:38的氨基酸序列组成；以及所述轻链CDR3包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列，由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:39的氨基酸序列组成。优选地，11B8轻链包含所有SEQID NOs:37-39的氨基酸序列。

本发明的第二CAR可包含11B8抗原结合结构域，其包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3的一个或多个，所述重链CDR1包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列，由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:40的氨基酸序列组成；所述重链CDR2包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列，由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成；和所述重链CDR3包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列，由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成。优选地，11B8重链包含所有SEQ IDNOs:40-42的氨基酸序列。

在一个实施方案中，11B8抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:37-42的氨基酸序列。

本发明的第二CAR可以包含GA101抗原结合结构域，所述GA101抗原结合结构域包含轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3中的一个或多个，所述轻链CDR1包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列，由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:43的氨基酸序列组成；所述轻链CDR2包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列，由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成；以及所述轻链CDR3包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列，由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:45的氨基酸序列组成。优选地，GA101轻链包含所有SEQ ID NOs:43-45的氨基酸序列。

本发明的第二CAR可以包含GA101抗原结合结构域，所述GA101抗原结合结构域包含重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3中的一个或多个，所述重链CDR1包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列，由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:46的氨基酸序列组成；所述重链CDR2包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列，由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:47的氨基酸序列组成；和所述重链CDR3包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列，由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成，或基本上由SEQ ID NO:48的氨基酸序列组成。优选地，GA101重链包含所有SEQ ID NOs:46-48的氨基酸序列。

在一个实施方案中，GA101抗原结合结构域包含所有SEQ ID NO:43-48的氨基酸序列。

CDR序列可以由本领域技术人员通过常规技术手段来确定。这种方法和可用资源是本领域已知的，例如参见Wu,et al.,J.Exp.Med.,132:211-250(1970),IMGTTM,theinternational ImMunoGeneTics information system(国际免疫遗传学信息系统)，以及可免费获得的Paratome web服务器。

在本发明的一个实施方案中，轻链可变区和重链可变区可以通过抗原结合结构域接头肽连接。抗原结合结构域接头肽可以是任何长度，并且许多包含任何氨基酸序列。例如，抗原结合结构域接头肽可以包含以下或由以下组成：甘氨酸，丝氨酸，赖氨酸，脯氨酸，谷氨酸和苏氨酸中的任何一种或多种，具有或不具有其它氨基酸残基。在本发明的一个实施方案中，抗原结合结构域接头肽可具有约5至约100个氨基酸残基、约8至约75个氨基酸残基、约8至约50个氨基酸残基、约10至约25个氨基酸残基、约8至约30个氨基酸残基、约8至约40个氨基酸残基、约8至约50个氨基酸残基、或约12至约20个氨基酸残基的长度。在本发明的一个实施方案中，抗原结合结构域接头肽具有任何前述长度，并且由独立地选自甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基组成。在一个实施方案中，抗原结合结构域接头肽可以包含或由四个甘氨酸和一个丝氨酸(G4S)的重复组成，例如(G4S)

在另一个实施方案中，第一和第二CARs中的每一个都包含前导序列(也称为信号序列)。前导序列可以位于第一和第二抗原结合结构域的一个或两个的氨基末端(例如，抗CD19抗体和抗CD20抗体的轻链可变区中的一个或两个)。前导序列可以是人前导序列。前导序列可以包含任何合适的氨基酸序列。在一个实施方案中，前导序列是人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)受体前导序列或人CD8α前导序列。例如，抗原结合结构域可以包含人CD8α前导序列，该序列包含SEQ ID NO:3，由SEQ ID NO:3组成，或基本上由SEQ ID NO:3组成。在本发明的一个实施方案中，尽管前导序列可以促进细胞表面上的第一和第二CARs中的一个或两个的表达，但是为了使CAR发挥功能，前导序列在第一和第二表达的CARs中的一个或两个中的存在可能不是必需的。在本发明的一个实施方案中，当第一和第二CARs中的一个或两个在细胞表面上表达时，前导序列的全部或一部分可以从第一和第二CARs中的一个或两个上切割下来。因此，在本发明的一个实施方案中，第一和第二CARs中的一个或两个缺少前导序列。

在本发明的一个实施方案中，第一和第二CARs中的一个或两个包括铰链域。本领域普通技术人员将理解铰链结构域是促进抗体柔性的氨基酸的短序列(参见，例如Woof etal.,Nat.Rev.Immunol.,4(2):89-99(2004))。铰链结构域可以位于第一和第二CARs之一或两者的抗原结合结构域和TM结构域之间。优选地，铰链结构域是人铰链结构域。铰链结构域可包含人CD8α或人CD28的铰链结构域。例如，人铰链结构域可以包括序列，该序列包括人CD8α的铰链结构域，由人CD8α的铰链结构域组成，或基本上由人CD8α的铰链结构域组成。

CAR可以包括跨膜(TM)结构域。TM结构域可以是衍生自或从本领域已知的任何分子获得的任何TM结构域。优选地，TM结构域是人TM结构域。例如，TM结构域可以包含人CD8α分子或人CD28分子的TM结构域。CD8是一种用作TCR共受体的TM糖蛋白，主要在细胞毒性T细胞的表面表达。CD8最常见的形式是由CD8α和CD8β链组成的二聚体。CD28在T细胞上表达并提供T细胞活化的共刺激信号。CD28是CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的受体。例如，人TM结构域可包含包含人CD8α的TM结构域，由人CD8α的TM结构域组成，或基本上由人CD8α的TM结构域组成的序列。

人CD8α铰链结构域和人CD8α跨膜结构域可以包含，例如，包含SEQ ID NO:7，由SEQID NO:7组成，或基本上由SEQ ID NO:7组成的序列。

第一和第二CARs中的一个或两个可以包含细胞内(即，细胞质)T-细胞信号传导结构域。细胞内T-细胞信号传导结构域可以从CD28分子，CD3ζ(ζ)分子，Fc受体γ(FcR)链，CD27分子，OX40分子，4-1BB分子，诱导性T-细胞共刺激蛋白(ICOS)，或本领域已知的其它细胞内信号传导分子，或任何前述的修饰形式获得或衍生。如上所述，CD28是涉及T细胞共刺激的T细胞标志物。人CD28的细胞内T细胞信号传导结构域可包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成。CD3ζ与TCR结合以产生信号且含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。人CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域可包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。4-1BB，也称为CD137，将有效的共刺激信号传递给T细胞，促进T淋巴细胞的分化和增强T淋巴细胞的长期存活。人4-1BB的细胞内T细胞信号传导结构域可包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，由或基本上由SEQ ID NO:14的氨基酸序列组成。ICOS是在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激分子。在优选的实施方案中，CD28,CD3ζ,FcRγ,ICOS,4-1BB,OX40和CD27是人的。

第一和第二CARs中的一个或两个可以包含任意组合的任意一个或多个上述TM结构域和任意一个或多个上述细胞内T-细胞信号传导结构域。例如，本发明的第一CAR可以包含CD8α铰链和TM结构域以及CD28和CD3ζ的细胞内T-细胞信号传导结构域。或者，例如，本发明的第二CAR可以包含CD8α铰链和TM结构域以及4-1BB和CD3ζ的细胞内T-细胞信号传导结构域。

在一个实施方案中，本发明的CAR构建体从氨基末端到羧基末端编码CD8α前导序列，抗CD19 scFv，人CD8α铰链和跨膜结构域，人CD28的细胞内T细胞信号传导结构域，人CD3ζ分子的细胞内T细胞信号传导结构域，切割序列，CD8α前导序列，抗CD20 scFv，人CD8α铰链和跨膜结构域，4-1BB细胞内T细胞信号传导结构域和人CD3ζ分子的细胞内T细胞信号传导结构域。

双顺反子CAR构建体的组分列于下表1-5中。

在一个实施方案中，本发明的第一CAR从氨基末端到羧基末端包含前导序列、抗CD19 scFv、人CD8α铰链和跨膜结构域、人CD28的细胞内T细胞信号传导结构域和人CD3ζ分子的细胞内T细胞信号传导结构域。

在另一个实施方案中，本发明的第二CAR从氨基末端到羧基末端包含前导序列，抗CD20 scFv，人CD8α铰链和跨膜结构域，4-1BB细胞内T细胞信号传导结构域和人CD3ζ分子的细胞内T细胞信号传导结构域。

包括在本发明范围内的是本文所述的本发明的CARs的功能部分。术语“功能部分”当用于CAR时是指本发明的CAR的任何部分或片段，该部分或片段保留产生该部分的CAR(亲本TCR)的生物活性。功能部分包括，例如，CAR的那些部分，其保留识别靶细胞，或检测、治疗或预防疾病的能力，达到与亲本CAR相似的程度，相同的程度，或达到更高的程度。关于亲本CAR，功能部分可以包含例如亲本CAR的约10％，约25％，约30％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％，约95％或更多。

功能部分可以在该部分的氨基或羧基末端或在两个末端包含另外的氨基酸，该另外的氨基酸在亲本CAR的氨基酸序列中没有发现。理想地，另外的氨基酸不干扰功能部分的生物功能，例如识别靶细胞，检测癌症、治疗或预防癌症等。更理想的是，与亲本CAR的生物活性相比，其它氨基酸增强了生物活性。

包括在本发明范围内的是本文所述的本发明CARs的功能变体。本文所用的术语“功能性变体”是指与亲本CAR具有实质或显著序列同一性或相似性的CAR，多肽或蛋白质，该功能性变体保留产生该变体的CAR的生物活性。功能变体包括，例如，本文所述的CAR(亲本CAR)的那些变体，其保持识别靶细胞的能力达到与亲本CAR相似的程度，相同的程度，或更高程度。关于亲本CAR，功能变体在氨基酸序列上可以例如与亲本CAR至少约30％，约50％，约75％，约80％，约90％，约98％或更多一致性。

功能性变体可以例如包含具有至少一个保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。或者或另外地，功能变体可包含具有至少一个非保守氨基酸取代的亲本CAR的氨基酸序列。在这种情况下，优选非保守氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物活性。非保守性氨基酸取代可增强功能变体的生物活性，使得功能变体的生物活性与亲本CAR相比增加。

本发明CARs的氨基酸取代优选是保守氨基酸取代。保守性氨基酸取代是本领域已知的，并且包括其中具有某些物理和/或化学性质的一个氨基酸与具有相同或相似的化学或物理性质的另一个氨基酸交换的氨基酸取代。例如，保守氨基酸取代可以是用酸性/带负电荷的极性氨基酸取代另一酸性/带负电荷的极性氨基酸(例如Asp或Glu)，用非极性侧链取代另一具有非极性侧链的氨基酸(例如Ala,Gly,Val,Ile,Leu,Met,Phe,Pro,Trp,Cys,Val等)。碱性/带正电的极性氨基酸取代另一碱性/带正电的极性氨基酸(例如Lys,His,Arg等)，具有极性侧链的不带电的氨基酸取代具有极性侧链的另一不带电的氨基酸(例如Asn,Gln,Ser,Thr,Tyr等)，具有β-支链的侧链的氨基酸取代具有β-支链的侧链的另一氨基酸(例如Ile、Thr和Val)，具有芳族侧链的氨基酸取代具有芳族侧链的另一个氨基酸(例如His、Phe、Trp和Tyr)等。

CAR可以基本上由本文所述的特定氨基酸序列组成，使得其它组分，例如其它氨基酸，不会实质上改变功能变体的生物活性。

本发明的实施方案的CARs(包括功能部分和功能变体)可以是任何长度，即可以包含任何数目的氨基酸，条件是CARs(或其功能部分或功能变体)保留它们的生物活性，例如特异性结合抗原，检测哺乳动物中的病变细胞，或治疗或预防哺乳动物中的疾病等的能力。例如，CAR的长度可以是约50至约1000个氨基酸，例如50个，70个，75个，100个，125个，150个，175个，200个，300个，400个，500个，600个，700个，800个，900个，1000个或更多个氨基酸。

本发明的实施方案(包括本发明的功能性部分和功能性变体)的CARs可以包含合成的氨基酸代替一个或多个天然存在的氨基酸。这样的合成氨基酸是本领域已知的，并且包括例如氨基环己烷羧酸，正亮氨酸，α-氨基正癸酸，高丝氨酸，S-乙酰氨基甲基-半胱氨酸，反式-3-和反式-4-羟基脯氨酸，4-氨基苯基丙氨酸，4-硝基苯基丙氨酸，4-氯苯基丙氨酸，4-羧基苯基丙氨酸，β-苯基丝氨酸β-羟基苯基丙氨酸，苯基甘氨酸，α-萘基丙氨酸，环己基丙氨酸，环己基甘氨酸，二氢吲哚-2-羧酸，1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸，氨基丙二酸，氨基丙二酸单酰胺，N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸，N',N'-二苄基-赖氨酸，6-羟基赖氨酸，鸟氨酸，α-氨基环戊烷羧酸，α-氨基环己烷羧酸，α-氨基环庚烷羧酸，α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸，N,N-二氨基丁酸，N,N-二氨基丙酸，高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。

本发明的实施方案的CARs(包括功能部分和功能变体)可以是糖基化的，酰胺化的，羧化的，磷酸化的，酯化的，N-酰化的，通过例如二硫键环化的，或转化成酸加成盐和/或任选地二聚的或聚合的，或缀合的。

本发明实施方案的CARs(包括其功能部分和功能变体)可以通过本领域已知的方法获得。CARs可以通过任何合适的制备多肽或蛋白质的方法制备。例如，CARs可以使用本文所述的核酸使用标准重组方法重组产生。参见，例如，Green and Sambrook,MolecularCloning:A Laboratory Manual,4th ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold SpringHarbor,NY(2012)。或者，本文所述的CARs(包括其功能部分和功能变体)可由公司商业合成，例如Synpep(Dublin，CA)，Peptide Technologies Corp.(Gaithersburg,MD)，和Multiple Peptide Systems(San Diego,Ca)。在这方面，本发明的CARs可以是合成的，重组的，分离的和/或纯化的。

本发明的一个实施方案还提供了包含编码本文所述的任何CARs(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列的核酸。本发明的核酸可包含编码本文所述的前导结构域，铰链结构域，抗原结合结构域，切割序列，TM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域中的任一个的核苷酸序列。因此，本发明的实施方案提供了包含核酸的核酸，所述核酸包含编码CAR构建体的核苷酸序列，所述CAR构建体包含(a)包含第一抗原结合结构域，第一跨膜结构域和第一细胞内T细胞信号传导结构域的第一CAR,(b)包含第二抗原结合结构域，第二跨膜结构域和第二细胞内T细胞信号传导结构域的第二CAR，和(c)切割序列，其中所述切割序列位于所述第一和第二CAR之间，其中所述第一CAR的第一抗原结合结构域对CD19具有抗原特异性，并且其中所述第二CAR的第二抗原结合结构域对CD20具有抗原特异性。

在本发明的实施方案中，第一和/或第二CAR可以与能够调节表达CAR的宿主细胞的抗CD19和/或抗CD19活性的调节元件组合提供。调节元件可以调节表达CAR的宿主细胞的抗CD19和/或抗CD20活性。因此，本发明的实施方案提供了一种系统，其包含：(a)编码第一CAR的核苷酸序列，其中所述第一CAR包含第一抗原结合结构域、TM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域，并且其中所述第一CAR对CD19具有抗原特异性；(b)编码第二CAR的核苷酸序列，其中所述第二CAR包含第二抗原结合结构域、TM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域，并且其中所述第二CAR对CD20具有抗原特异性；(c)切割序列，和(d)能够调节表达CAR的宿主细胞的抗CD19和/或抗CD20活性的调节元件。调节元件可以调节表达第一和/或第二CAR的宿主细胞的抗CD19和/或抗CD20活性。例如，调节元件可以充当“开”或“关”开关。

在本发明的一个实施方案中，调节元件下调表达第一和/或第二CAR的宿主细胞的抗CD19和/或抗CD20活性。例如，调节元件杀伤表达第一和/或第二CAR的宿主细胞。在这方面，调节元件是自杀基因。在本发明的一个实施方案中，调节元件是可诱导的二聚化杀伤开关。诱导型二聚化杀伤开关的实例是IC9自杀基因。诱导型二聚化杀伤开关的另一个实例是提供Fas的细胞内信号传导结构域的小分子诱导的二聚化的元件，其通过半胱天冬酶-8依赖性途径诱导细胞凋亡。这种方法可用于使用通过融合药物钙调磷酸酶的两个分子制备的小分子来诱导细胞凋亡(Spencer et al.,Curr.Biol.,6:839–47(1996)；Belshaw et al.,Chem.Biol.,3:731–38(1996))或本文所述的FKBP/AP1903二聚体系(Thomis et al.,Blood,97:1249–57(2001))。

在本发明的一个实施方案中，调节元件是细胞表面标志物。细胞表面标志物可以与第一和/或第二CAR共表达。施用靶向细胞表面标志物的抗体可减少或消除第一和/或第二CAR表达宿主细胞。这种细胞表面标志物可用作体内消耗CAR阳性细胞的安全机制。体内耗竭可通过调理细胞的补体介导的裂解和抗体介导的细胞依赖性细胞毒性中的一种或两种发生。例如，用细胞表面标志物转导的细胞可以用利妥昔单抗耗尽，所述细胞表面标志物是具有两个利妥昔单抗(抗-CD20)拟表位的CD8α茎(Philip et al.,Blood,124:1277-87(2014))。可针对抗体耗竭的细胞表面标志物的其它实例包括CD20(Griffioen等人，Haematologica，94：1316-20(2009))，c-myc表位标签(Kieback等人，PNAS，105：623-28(2008))和截短形式的人表皮生长因子受体。截短的表皮生长因子受体可能缺少配体结合和细胞内信号传导结构域中的一个或两个，但保留了西妥昔单抗结合的表位(Wang等人，Blood，118：1255-63(2011))。

调节元件可以是抑制性受体。例如，抗原特异性抑制嵌合抗原受体(iCARs)可优先抑制T细胞应答。这种iCARi可以选择性地限制通过内源性T细胞受体或活化嵌合受体诱导的细胞因子分泌、细胞毒性和增殖(Fedorov et al.,Sci.Transl.Med.,5:215ra172(2013))。

在本发明的一个实施方案中，调节元件上调宿主细胞的抗CD19和/或抗CD20活性。在这点上，调节元件可以作为“开”开关以控制第一和/或第二CAR的表达或活性发生在需要的空间和时间。

例如，调节元件可以是赋予细胞存活或活性对小分子配体的依赖性的元件。这种元件的实例可以是与生长细胞因子靶标连接以控制细胞(例如T细胞)增殖的药物响应性、基于核酶的调节装置(Chen等人，PNAS，107(19)：8531-6(2010))。另一个实例可以是设计CAR的抗原结合和细胞内信号传导组分，以仅在异源二聚化小分子的存在下组装(Wu等人，Science，350(6258)：aab4077(2015))。

其它潜在的调节元件可以包括控制转基因整合位置的元件(Schumann等，,PNAS,112(33):10437-42(2015))或产生营养缺陷型细胞(例如T细胞)的遗传缺失。

在本发明的另一个实施方案中，编码第一和/或第二CAR的核苷酸序列是RNA。将CAR mRNA导入细胞可导致CAR的瞬时表达。利用这种方法，mRNA可能持续几天，但是可有具有最小的靶标毒性的抗肿瘤作用(Beatty et al.,Cancer Immunol.Res.,2(2):112-20(2014))。

在本发明的一个实施方案中，第一和/或第二CAR与自杀基因组合提供。自杀基因的产物可有利地提供抗CD19和/或抗CD20活性CAR表达细胞的按需减少或消除。

如本文所用，术语“自杀基因”是指使表达自杀基因的细胞死亡的基因。自杀基因可以是对于表达该基因的细胞赋予对药剂(例如药物)敏感性的基因，并且当细胞与药剂接触或暴露于药剂时引起细胞死亡。自杀基因是本领域已知的，包括，例如，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶、诱导型半胱天冬酶9(IC9)基因、嘌呤核苷磷酸化酶和硝基还原酶。

自杀基因可以是IC9基因。IC9基因的产物含有与衍生自人FK-506结合蛋白(FKBP12组分)的结合结构域融合的促凋亡蛋白人半胱天冬酶9(“半胱天冬酶9组分”)的部分。IC9的半胱天冬酶9结构域的活化依赖于IC9蛋白的二聚化，当小分子药物利rimiducid(AP1903)与IC9的FKBP12部分结合时发生所述二聚化。在半胱天冬酶9被激活后，携带IC9基因的细胞经历细胞凋亡。

在本发明的一个实施方案中，核酸包含编码位于第一和第二CARs之间的切割序列的核苷酸序列。在本发明的一个实施方案中，切割序列是可切割的。在这方面，可以切割本发明核酸编码的氨基酸序列，从而产生两种蛋白质：第一种蛋白质，其由编码第一CAR的核苷酸序列编码，第二种蛋白质，其由编码第二CAR的核苷酸序列编码。

在一个实施方案中，可切割的切割序列包括“自切割”序列。在一个实施方案中，“自切割”序列是“自切割”2A肽。例如，“自切割”2A肽描述于Liu et al.,Sci.Rep.,7(1):2193(2017),and Szymczak et al.,Nature Biotechnol.,22(5):589-594(2004)。2A肽是在真核细胞中翻译期间介导多肽切割的病毒寡肽。名称“2A”是指病毒基因组的特定区域。不受特定理论或机制的束缚，据信2A介导的“自我切割”的机制是在2A肽的C-末端的甘氨酰-脯氨酰肽键的形成的核糖体跳跃。不同的2A肽可以在C末端包含GDVEX

在一个实施方案中，可切割的切割序列包括酶可切割的序列。在一个实施方案中，酶可切割的序列是弗林蛋白酶可切割的序列。在Duckert等人的文献(Duckert et al.,Protein Engineering,Design&Selection,17(1):107-112(2004))和美国专利8,871,906中描述了示例性的弗林蛋白酶可切割的序列，其各自通过引用并入本文。在本发明的一个实施方案中，弗林蛋白酶可切割序列由式P4-P3-P2-P1(式I)表示，其中P4是氨基末端的氨基酸残基，P1是羧基末端的氨基酸残基，P1是精氨酸或赖氨酸残基，并且该序列可在P1的羧基末端被弗林蛋白酶切割。在本发明的另一个实施方案中，式I的呋喃蛋白可切割序列(i)进一步包含在氨基端由P6-P5表示的氨基酸残基，(ii)进一步包含在羧基端由P1'-P2'表示的氨基酸残基，(iii)其中如果P1是精氨酸或赖氨酸残基，P2'是色氨酸，且P4是精氨酸、缬氨酸或赖氨酸，条件是如果P4不是精氨酸，则P6和P2是碱性残基，和(iv)该序列在P1的羧基端可被弗林蛋白酶切割。在本发明的一个实施方案中，所述弗林蛋白酶可切割序列包含R-X

在本发明的一个实施方案中，切割序列包括酶可切割序列和任何“自切割”序列。在本发明的一个实施方案中，切割序列包含酶可切割序列(例如，弗林蛋白酶可切割序列)，间隔区(例如，SGSG[SEQ ID NO:50])和“自切割”序列(例如，F2A)。在本发明的一个实施方案中，切割序列是包含(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列、由(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列组成、或基本上由(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列组成的氨基酸序列。

在一个实施方案中，核酸序列可以包含SEQ ID NO:1(Hu1928-11B8BB)、SEQ IDNO:15(Hu1928-C2B8BB),SEQ ID NO:19(Hu1928-2.1.2BB)、SEQ ID NO:23(Hu1928-8G6BB)或SEQ ID NO:27(Hu1928-GA101BB)中的任一个的核苷酸序列，或由其组成，或基本上由其组成。

在一个实施方案中，核酸序列可以编码包含以下、由以下组成或基本上由以下组成：SEQ ID NO:2(Hu1928-11B8BB),SEQ ID NO:16(Hu1928-C2B8BB),SEQ ID NO:20(Hu1928-2.1.2BB),SEQ ID NO:24(Hu1928-8G6BB)或SEQ ID NO:28(Hu1928-GA101BB)。本发明的另一个实施方案提供了包含编码抗CD19 CAR的核苷酸序列的核酸，所述抗CD19 CAR包含抗原结合结构域，TM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域对CD19具有抗原特异性。抗CD19 CAR可以如本文关于本发明的其它方面所述。

本发明的另一个实施方案提供了包含编码抗CD20 CAR的核苷酸序列的核酸，所述抗CD20 CAR包含抗原结合结构域，TM结构域和细胞内T细胞信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域对CD20具有抗原特异性。抗CD20 CAR可以如本文关于本发明的其它方面所述。

本发明的另一个实施方案提供了核酸，其中CAR构建体恰好包含两个分别为第一和第二CAR的CAR。

本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，可以从天然来源合成或获得(例如，分离和/或纯化)，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间连接，例如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，而不是在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。在一些实施方案中，核酸不包含任何插入，缺失，倒位和/或取代。然而，如本文所讨论的，核酸包含一个或多个插入，缺失，倒位和/或取代在某些情况下可以是合适的。

本发明实施方案的核酸可以是重组的。如本文所用，术语“重组的”是指(i)通过将天然或合成的核酸片段与可在活细胞中复制的核酸分子连接而在活细胞外构建的分子，或(ii)由上述(i)中所述的那些的复制产生的分子。对于本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。

重组核酸可以是具有非天然存在的序列或具有通过两个另外分离的序列片段的人工组合产生的序列的核酸。这种人工组合通常通过化学合成来完成，或者更通常地，通过人工操作分离的核酸片段来完成，例如通过基因工程技术，如上文在Green和Sambrook中描述的那些。核酸可以使用本领域已知的方法基于化学合成和/或酶连接反应构建。参见，例如，Green和Sambrook，同上。例如，可以使用天然存在的核苷酸或设计用于增加分子的生物稳定性或增加杂交时形成的双链体的物理稳定性的各种修饰的核苷酸(例如，硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)化学合成核酸。可用于产生核酸的修饰核苷酸的实例包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，4-乙酰基胞嘧啶，5-(羧羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫苷，5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，β-D-半乳糖基季胺，肌苷，N

核酸可以包含编码任何CARs或其功能部分或功能变体的任何分离的或纯化的核苷酸序列。或者，核苷酸序列可包含与任一序列简并的核苷酸序列或简并序列的组合。

本发明的一个实施方案还提供了分离的或纯化的核酸，其包含与本文所述的任何核酸的核苷酸序列互补的核苷酸序列或在严格条件下与本文所述的任何核酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。

在严格条件下杂交的核苷酸序列可以在高严格条件下杂交。“高严格条件”是指核苷酸序列与靶序列(本文所述的任何核酸的核苷酸序列)特异性杂交，可检测的杂交的量比非特异性杂交强。高度严格条件包括将区分具有精确互补序列的多核苷酸，或仅含有少量分散错配的多核苷酸与碰巧具有少量与核苷酸序列匹配的小区域(例如，3-10个碱基)的随机序列的条件。这种互补的小区域比14-17个或更多碱基的全长互补更容易熔融，并且高度严格杂交使得它们容易区分。相对高严格条件将包括例如低盐和/或高温条件，例如由约0.02-0.1M NaCl或等同物在约50-70℃的温度下提供。这种高严格条件几乎不耐受(如果有的话)核苷酸序列和模板或靶链之间的错配，并且特别适于检测任何本发明的CARs的表达(单独或与自杀基因组合)。通常可以理解的是，通过加入增加量的甲酰胺可以使条件更加严格。

本发明还提供了包含与本文所述的任何核酸至少约70％或更多，例如约80％，约90％，约91％，约92％，约93％，约94％，约95％，约96％，约97％，约98％或约99％相同的核苷酸序列的核酸。

在一个实施方案中，可将本发明的核酸掺入重组表达载体中。在这方面，本发明的实施方案提供了包含本发明的任何核酸的重组表达载体。出于本文的目的，术语“重组表达载体”是指当构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列并且载体在足以使mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下与细胞接触时，允许宿主细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽的遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体。本发明的载体整体上不是天然存在的。然而，载体的部分可以是天然存在的。本发明的重组表达载体可以包含任何类型的核苷酸，包括但不限于DNA和RNA，其可以是单链或双链的，合成的或部分从天然来源获得的，并且其可以含有天然的，非天然的或改变的核苷酸。重组表达载体可以包含天然存在的或非天然存在的核苷酸间连接，或两种类型的连接。优选地，非天然存在的或改变的核苷酸或核苷酸间连接不会阻碍载体的转录或复制。

在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主细胞。合适的载体包括为增殖和扩增或表达或两者设计的载体，如质粒和病毒。载体可以选自pUC系列(Fermentas Life Sciences,GlenBurnie,MD),pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA),pET系列(Novagen,Madison,WI),pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)以及pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。也可以使用噬菌体载体，例如λGT10,λGT11,λZapII(Stratagene),λEMBL4和λNM1149。植物表达载体的实例包括pBI01,pBI101.2,pBI101.3,pBI121和pBIN19(Clontech)。动物表达载体的实例包括PEUK-Cl,pMAM和pMAMneo(Clontech)。重组表达载体可以是病毒载体，例如逆转录病毒载体(例如γ-逆转录病毒载体)或慢病毒载体。

在一个实施方案中，本发明的重组表达载体可以使用标准重组DNA技术制备，所述技术描述于例如Sambrook和Green，同上。可以制备环状或线性的表达载体的构建体，以含有在原核或真核宿主细胞中有功能的复制系统。复制系统可以衍生自例如ColE1、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头瘤病毒等。

重组表达载体可以包含调节序列，例如转录和翻译起始和终止密码子，其对于载体要被引入的宿主细胞(例如细菌，真菌，植物或动物)的类型是特异性的，并且视情况考虑载体是基于DNA还是基于RNA的。重组表达载体可以包含限制位点以促进克隆。除了编码CARs的本发明核酸序列(单独地或与自杀基因组合)之外，重组表达载体优选包含表达控制序列，例如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等，其提供核酸序列在宿主细胞中的表达。

重组表达载体可以包括一个或多个标志物基因，其允许选择转化的或转染的宿主细胞。标志物基因包括抗微生物剂抗性，例如对抗生素、重金属等的抗性；在营养缺陷型宿主中的互补以提供原养型等。用于本发明表达载体的合适标志物基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因。

重组表达载体可以包含可操作地连接到编码CARs的核苷酸序列(包括其功能部分和功能变体)(单独地或与自杀基因组合)，或连接到与编码CARs的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列(单独地或与自杀基因组合)的天然或非天然启动子。启动子的选择，例如，强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性，在本领域普通技术人员的能力范围内。类似地，核苷酸序列与启动子的组合也在本领域技术人员的能力范围内。启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子或在鼠干细胞病毒的长末端重复中发现的启动子。

本发明的重组表达载体可以被设计用于瞬时表达、稳定表达或两者。而且，可以制备重组表达载体用于组成型表达或用于诱导型表达。

本发明的一个实施方案还提供了包含本文所述的任何重组表达载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可含有本发明重组表达载体的任何类型的细胞。宿主细胞可以是真核细胞，例如植物、动物、真菌或藻类，或者可以是原核细胞，例如细菌或原生动物。宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体，例如人中分离的。宿主细胞可以是贴壁细胞或悬浮细胞，即在悬浮液中生长的细胞。合适的宿主细胞是本领域已知的，包括例如DH5α大肠杆菌细胞、中国仓鼠卵巢细胞、猴VERO细胞、COS细胞、HEK293细胞等。为了扩增或复制重组表达载体，宿主细胞可以是原核细胞，例如DH5α细胞。为了产生重组CAR，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。宿主细胞可以是人细胞。宿主细胞可以是任何细胞类型，可以源自任何类型的组织，并且可以是任何发育阶段。宿主细胞可以是外周血淋巴细胞(PBL)或外周血单核细胞(PBMC)。

在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是T细胞。出于本文的目的，T细胞可以是任何T细胞，例如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或从哺乳动物获得的T细胞。如果从哺乳动物获得，T细胞可以从多种来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。T细胞也可以富集或纯化。T细胞可以是人T细胞。T细胞可以是分离自人的T细胞。T细胞可以是任何类型的T细胞并且可以是任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞，CD4

在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是天然杀伤(NK)细胞。NK细胞是一种在先天免疫系统中起作用的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞被定义为大颗粒淋巴细胞，并构成从也产生B和T淋巴细胞的共同淋巴祖细胞分化的第三种细胞(参见，例如Immunobiology，第9版,Janeway等人编辑,Garland Publishing,New York,NY(2016))。NK细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化和成熟。成熟后，NK细胞进入循环，作为具有不同细胞毒性颗粒的大淋巴细胞。NK细胞能够识别和杀死一些异常细胞，例如一些肿瘤细胞和病毒感染的细胞，并且被认为在抵抗细胞内病原体的先天免疫防御中是重要的。如上文关于T-细胞所述，NK细胞可以是任何NK细胞，例如培养的NK细胞，例如初级NK细胞，或来自培养的NK细胞系的NK细胞，或从哺乳动物获得的NK细胞。如果从哺乳动物获得，NK细胞可以从多种来源获得，包括但不限于血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其它组织或液体。NK细胞也可以富集或纯化。NK细胞优选是人NK细胞(例如，从人中分离)。NK细胞系可从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得，包括例如NK-92细胞(ATCC CRL-2407),NK92MI细胞(ATCC CRL-2408)及其衍生物。

本发明的一个实施方案还提供了包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群。细胞群可以是包含宿主细胞的异质群，所述宿主细胞除了包含至少一种其它细胞(例如，宿主细胞(例如，T细胞)，其不包含任何重组表达载体)或T细胞以外的细胞(例如，B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、红细胞、肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、肌细胞，脑细胞等)之外，还包含所述的任何重组表达载体。或者，细胞群可以是基本上均匀的群，其中该群主要包含包含重组表达载体的宿主细胞(例如，基本上由其组成)。所述群体也可以是细胞的克隆群体，其中所述群体的所有细胞都是包含重组表达载体的单个宿主细胞的克隆，使得所述群体的所有细胞都包含所述重组表达载体。在本发明的一个实施方案中，所述细胞群是包含宿主细胞的克隆群，所述宿主细胞包含本文所述的重组表达载体。

编码CARs的本发明重组表达载体可以通过“转染”,“转化”或“转导”导入细胞。本文所用的“转染”,“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源多核苷酸导入宿主细胞。许多转染技术是本领域已知的，包括，例如，磷酸钙DNA共沉淀；DEAE-葡聚糖；电穿孔；阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击；和磷酸锶DNA共沉淀。噬菌体或病毒载体可以在合适的包装细胞中生长感染性颗粒后导入宿主细胞，其中许多是可商购的。

包括在本发明范围内的是缀合物，例如生物缀合物，其包含任何本发明的CARs(包括其任何功能部分或变体)、核酸、重组表达载体、宿主细胞或宿主细胞群。缀合物以及通常合成缀合物的方法是本领域已知的。

CAR(包括其功能部分及其变体)(单独地或与自杀基因产物组合)、核酸、系统、由核酸编码的蛋白质和蛋白质组合、重组表达载体和宿主细胞(包括其群体)，所有这些在下文中统称为“本发明的CAR材料”，可以被分离和/或纯化。本文所用的术语“分离的”是指已经从其天然环境中移除。本文所用术语“纯化的”或“分离的”不需要绝对的纯度或分离；相反，它是一个相对的术语。因此，例如，纯化的(或分离的)宿主细胞制剂是这样的制剂，其中宿主细胞比其体内天然环境中的细胞更纯。这种宿主细胞可以例如通过标准纯化技术产生。在一些实施方案中，纯化宿主细胞的制剂，使得宿主细胞占制剂的总细胞含量的至少约50％，例如至少约70％。例如，纯度可以是至少约50％，可以是大于约60％，约70％或约80％，或可以是约100％。

本发明的CAR材料可以配制成组合物，例如药物组合物。在这方面，本发明的一个实施方案提供了包含任何本发明的CAR材料和药学上可接受的载体的药物组合物。含有任何本发明的CAR材料的本发明的药物组合物可以包含多于一种本发明的CAR材料，例如CAR和核酸，或两种或更多种不同的CAR。或者，药物组合物可包含本发明的CAR材料与其它药学活性剂或药物的组合，所述药学活性剂或药物诸如化疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、阿霉素、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含本发明的宿主细胞或其群体。

优选地，载体是药学上可接受的载体。关于药物组合物，载体可以是常规用于所考虑的特定的本发明CAR材料的那些载体中的任一种。这样的药学上可接受的载体是本领域技术人员熟知的并且容易为公众所获得。优选药学上可接受的载体是在使用条件下没有有害副作用或毒性的载体。

载体的选择将部分地由特定的本发明CAR材料以及用于施用本发明CAR材料的特定方法决定。在优选的实施方案中，CARs由宿主细胞表达，所述宿主细胞优选是T细胞或NK细胞，并且将表达CARs的宿主细胞施用于患者。这些细胞可以是与细胞受体相关的自体的或同种异体的。编码CARs的核酸可通过多种遗传修饰方法中的任一种导入细胞，所述方法包括但不限于用γ-逆转录病毒、慢病毒或转座子系统转导。存在本发明的药物组合物的多种合适的制剂。合适的制剂可包括用于肠胃外，皮下，静脉内，肌内，肿瘤内，动脉内，鞘内或腹腔内给药的那些制剂中的任一种。可以使用一种以上的途径来施用本发明的CAR材料，并且在某些情况下，特定的途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的响应。

优选地，本发明的CAR材料通过注射给药，例如静脉内给药。当本发明的CAR材料是表达本发明的CAR(或其功能变体)的宿主细胞时，用于注射的细胞的药学上可接受的载体可以包括任何等渗载体，例如生理盐水(约0.90％w/v的NaCl水溶液，约300mOsm/L NaCl水溶液，或约9.0g NaCl/升水),Normosol R电解质溶液(Abbott,Chicago,IL),PLASMA-LYTEA(Baxter,Deerfield,IL)，约5％右旋糖水溶液或Ringer's乳酸盐。在一个实施方案中，药学上可接受的载体补充有人血清蛋白。

该组合物可以采用时间释放，延迟释放和持续释放递送系统，使得本发明组合物的递送发生在待治疗部位致敏之前，并具有足够的时间致敏。许多类型的释放递送系统是可获得的并且是本领域普通技术人员已知的。这样的系统可以避免重复施用组合物，从而增加对受试者和医师的便利性，并且可以特别适用于本发明的某些组合物实施方案。

不受特定理论或机制的束缚，认为通过引发针对CD19和/或CD20的抗原特异性应答，第一和/或第二CARs提供以下一种或多种：靶向和破坏表达CD19和/或CD20的癌细胞，减少或消除癌细胞，促进免疫细胞浸润到肿瘤部位，以及增强/延长抗癌反应。

预期第一和/或第二CARs材料可用于治疗或预防疾病(例如癌症)的方法中。在不受特定理论或机制束缚的情况下，第一和/或第二CAR具有生物活性，例如识别抗原(例如CD19和/或CD20)的能力，使得第一和/或第二CAR在由细胞表达时能够介导针对表达抗原(例如CD19和/或CD20)的细胞的免疫应答，其中第一和/或第二CAR对所述抗原是特异性的。在这方面，本发明的一个实施方案提供了治疗或预防哺乳动物中癌症的方法，包括以有效治疗或预防哺乳动物中癌症的量向哺乳动物施用本发明的任何CAR(包括其功能部分和变体)(单独地或与自杀基因产物组合)、核酸、系统、由核酸编码的蛋白质(包括蛋白质的组合)、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和/或药物组合物。在一个优选的实施方案中，该方法包括用本发明的CAR构建体转导的宿主细胞输注给哺乳动物。

表达本文所述的第一和/或第二CARs的一种或多种分离的宿主细胞可以与离体、体内或体外表达CD19和/或CD20的癌细胞群接触。“离体”是指在生物体外部的人工环境中的细胞或组织内或其上实施的方法，其中自然条件的变化最小。相反，术语“体内”是指在正常，完整状态的活体内实施的方法，而“体外”方法是使用从其通常的生物环境中分离的生物体的组分实施的。本发明的方法优选包括离体和体内组分。在这方面，例如，上述分离的宿主细胞可以在表达第一和/或第二CARs的条件下离体培养，然后直接转移到受CD19和/或CD20-阳性癌症(例如淋巴瘤)影响的哺乳动物(优选人)中。这种细胞转移方法在本领域中称为“过继细胞转移(ACT)”，其中将免疫衍生细胞转移到受体中以将免疫衍生细胞的功能转移到宿主。免疫衍生的细胞可以来源于受体或来源于另一个个体。过继细胞转移方法可用于治疗各种类型的癌症，包括血液癌症如骨髓瘤。

一旦将包含表达本发明的第一和第二编码CAR的核酸序列的宿主细胞的组合物，或包含本发明的第一和第二编码CAR的核酸序列的载体施用于哺乳动物(例如人)，第一和/或第二CAR的生物活性可以通过本领域已知的任何合适的方法测量。根据本发明的方法，第一CAR结合CD19和/或第二CAR结合癌症上的CD20，并且癌细胞被破坏。癌细胞表面上的第一CAR与CD19和/或第二CAR与CD20的结合可以使用本领域已知的任何合适的方法进行测定，包括例如ELISA(酶联免疫吸附测定)和流式细胞术。CARs破坏细胞的能力可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量，例如在Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009),和Herman et al.J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。第一和/或第二CAR的生物活性也可以通过测定某些细胞因子如CD107a,IFN,IL-2和TNF的表达来测定。

本发明的一个实施方案还包括在施用本发明的CAR材料之前清除哺乳动物的淋巴细胞。淋巴清除的实例包括但不限于非清髓性淋巴清除化疗、清髓性淋巴清除化疗、全身照射等。例如，可以在将本发明的CAR材料施用于哺乳动物之前将淋巴细胞清除化疗方案施用于哺乳动物。在一个实施方案中，环磷酰胺和/或氟达拉滨在施用本发明的CAR材料之前施用于哺乳动物。在一个实施方案中，在施用本发明的CAR材料之前，将环磷酰胺和/或氟达拉滨连续施用至哺乳动物持续三天。在另一个实施方案中，环磷酰胺以约1至约100mg/m

对于本发明的方法，其中施用宿主细胞或细胞群，所述细胞可以是与哺乳动物同种异体的或自体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物自体的。

“有效量”或“有效治疗的量”是指足以预防或治疗个体中的癌症的剂量。有效用于治疗或预防用途的量将取决于例如所治疗的疾病或病症的阶段和严重程度、患者的年龄、体重和一般健康状态，以及处方医师的判断。剂量的大小还将由所选择的特定CAR材料、给药方法、给药时间和频率、可能伴随特定CAR材料的给药的任何不良副作用的存在、性质和程度以及所需的生理效应来确定。本领域技术人员将理解，各种疾病或病症(例如，癌症)可能需要涉及多次施用的延长的治疗，可能在每轮或多轮施用中使用本发明的CAR材料。通过实施例的方式且不打算限制本发明，本发明CAR材料的剂量可以是约0.001至约1000mg/kg被治疗受试者体重/天，约0.01至约10mg/kg体重/天，约0.01mg/kg体重/天至约1mg/kg体重/天。在本发明的一个实施方案中，剂量可以是约1×10

为了本发明的目的，施用的本发明CAR材料的量或剂量应足以在合理的时间范围内在受试者或动物中实现治疗或预防反应。例如，本发明的CAR材料的剂量应足以与抗原结合，或在从给药时起约2小时或更长，例如约12至约24小时或更长的时间内检测、治疗或预防疾病，例如癌症。在某些实施例中，该时间段甚至可以更长。剂量将通过特定的本发明CAR材料的功效和动物(例如人)的状况以及待治疗的动物(例如人)的体重来确定。

为了本发明的目的，以下测定方法可以被用于确定施用于哺乳动物的起始剂量，所述测定方法包括例如在每个都给予了不同剂量的T细胞的一组哺乳动物中比较将给定剂量的所述T细胞施用于哺乳动物后靶细胞被裂解和/或IFNγ被表达第一和/或第二CAR的T细胞分泌的程度。通过本领域已知的方法可以测定在施用一定剂量后靶细胞裂解和/或分泌IFNγ的程度。

当本发明的CAR材料与一种或多种另外的治疗剂一起施用时，一种或多种另外的治疗剂可以共同施用于哺乳动物。“共同施用”是指施用一种或多种另外的治疗剂，并且本发明的CAR材料在时间上足够接近，使得本发明的CAR材料可以增强一种或多种另外的治疗剂的效果，或者反之亦然。在这方面，本发明的CAR材料可以首先施用，并且一种或多种另外的治疗剂可以随后施用，或者反之亦然。或者，本发明的CAR材料和一种或多种另外的治疗剂可以同时给药。可以与CAR材料共同施用的示例性治疗剂是IL-2。认为IL-2增强了本发明CAR材料的治疗效果。不受特定理论或机制的束缚，认为IL-2通过增强表达第一和/或第二CARs的细胞数量的体内扩增来增强治疗。

本文所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物。本文所用的术语“哺乳动物”是指任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目(例如小鼠和仓鼠)的哺乳动物和Logomorpha目(例如兔)的哺乳动物。哺乳动物可以来自食肉纲，包括猫(猫)和犬(狗)。哺乳动物可以来自偶蹄目包括牛(母牛)和猪(猪)、或奇蹄目，包括Equines(马)。哺乳动物可以是灵长类、Ceboids或Simoids(猴)或类人目(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。

关于本发明的方法，癌症可以是任何癌症。在本发明的一个实施方案中，癌症是表达CD19和/或CD20的癌症。在本发明的一个实施方案中，癌症是白血病和/或淋巴瘤。

本文所用的术语“治疗(treat)”和“预防(prevention)”以及由其衍生的词语不一定意味着100％或完全的治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为其具有潜在的益处或治疗效果。在这方面，本发明的方法可以提供任何量的哺乳动物中癌症的任何水平的治疗或预防。此外，由本发明方法提供的治疗或预防可以包括治疗或预防所治疗或预防的疾病例如癌症的一种或多种病症或症状。此外，出于本文的目的，“预防”可涵盖延迟疾病(例如癌症)或其症状或病状的发作或预防疾病(例如癌症)的复发。

本发明的另一个实施方案提供第一和/或第二CAR(包括其功能部分和变体)(单独地或与自杀基因产物组合)、核酸、系统、由核酸编码的蛋白质(包括蛋白质的组合)、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和/或本文关于本发明的其它方面描述的药物组合物中的任一种，用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的方法。本发明的另一个实施方案提供了第一和/或第二CAR(包括其功能部分和变体)(单独地或与自杀基因产物组合)、核酸、系统、由核酸编码的蛋白质(包括蛋白质的组合)、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和/或本文关于本发明的其它方面描述的药物组合物中的任一种在制备用于治疗或预防哺乳动物中的癌症的药物中的用途。癌症可以是本文所述的任何癌症。

本发明的另一个实施方案提供了一种或多种由本发明核酸编码的多肽。

本发明的另一个实施方案提供了检测哺乳动物中存在癌症的方法，其包括(a)使包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与本发明的核酸、由所述核酸编码的蛋白质(包括蛋白质的组合)、重组表达载体、宿主细胞(包括其群体)和/或药物组合物接触，从而形成复合物，和(b)检测所述复合物，其中复合物的检测指示哺乳动物中存在癌症。

以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

以下包括本发明的某些方面。

1.包含编码嵌合抗原受体(CAR)构建体的核苷酸序列的核酸，所述构建体包含：

(a)第一CAR，其包括

第一抗原结合结构域，

第一跨膜结构域

第一细胞内T细胞信号传导结构域；

(b)第二CAR，其包含

第二抗原结合结构域，

第二跨膜结构域

第二细胞内T细胞信号传导结构域；和

(c)切割序列；

其中所述切割序列位于所述第一和第二CAR之间，

其中第一CAR的第一抗原结合结构域对CD19具有抗原特异性，以及

其中第二CAR的第二抗原结合结构域对CD20具有抗原特异性。

2.根据方面1所述的核酸，其中所述切割序列包含以下任一项：猪捷申病毒-1 2A(P2A)氨基酸序列、马鼻炎A病毒(E2A)氨基酸序列、明脉扁刺蛾β四体病毒2A(T2A)氨基酸序列、口蹄疫病毒(F2A)氨基酸序列、或弗林蛋白酶可切割的氨基酸序列、前述任一项的变型，或前述的任何组合。

3.根据方面1或2所述的核酸，其中所述切割序列包含口蹄疫病毒(F2A)氨基酸序列。

4.根据方面1-3中任一项所述的核酸，其中所述切割序列包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:10。

5.根据方面1-4中任一项所述的核酸，其中所述第一抗原结合结构域包含Hu19的六个CDR。

6.根据方面1-5中任一项所述的核酸，其中所述第一抗原结合结构域包含包含SEQID NO:4的氨基酸序列的第一可变区和包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的第二可变区。

7.根据方面1-6中任一项所述的核酸，其中所述第一抗原结合结构域包含单链可变片段Hu19。

8.根据方面1-7中任一项所述的核酸，其中所述第二抗原结合结构域包含11B8、C2B8、2.1.2、8G6或GA101的六个CDR。

9.根据方面1-7中任一项所述的核酸，其中所述第二抗原结合结构域包含抗体C2B、11B8、8G6、2.1.2或GA101的抗原结合结构域。

10.根据方面1-9中任一项所述的核酸，其中所述第一和第二跨膜结构域之一或两者包含CD8跨膜结构域。

11.根据方面1-10中任一项所述的核酸，其中所述第一和第二CAR之一或两者包含铰链结构域。

12.根据方面1-11中任一项所述的核酸，其中所述第一和第二细胞内T细胞信号传导结构域之一或两者包含以下的任一种：人CD28蛋白，人CD3-ζ蛋白，人Fcγ蛋白，CD27蛋白，OX40蛋白，人4-1BB蛋白，人诱导性T细胞共刺激蛋白(ICOS)，前述任一种的变型，或前述的任何组合。

13.根据方面1-12中任一项所述的核酸，其中所述第一和第二细胞内T细胞信号传导结构域之一或两者包含CD28细胞内T细胞信号传导序列。

14.根据方面13的核酸，其中所述CD28细胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

15.根据方面1-14中任一项所述的核酸，其中所述第一和第二细胞内T细胞信号传导结构域之一或两者包含CD3 zeta(ζ)细胞内T细胞信号传导序列。

16.根据方面15的核酸，其中所述CD3ζ细胞内T细胞信号传导序列包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

17.根据方面1-16中任一项所述的核酸，其中所述CAR构建体包含CD8前导结构域。

18.根据方面17所述的核酸，其中所述CD8前导结构域序列包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

19.根据方面1-18中任一项所述的核酸，其中所述CAR构建体恰好包含分别为第一和第二CAR的两个CAR。

20.方面1-19中任一项的核酸，其编码包含SEQ ID NO:2,16,20,24或29中任一项的氨基酸序列的CAR构建体。

21.由方面1-20中任一项的核酸编码的一种或多种多肽。

22.一种重组表达载体，其包含方面1-20中任一项的核酸。

23.一种分离的宿主细胞，其包含方面22的重组表达载体。

24.包含至少一种方面23的宿主细胞的细胞群。

25.一种药物组合物，其包含方面1-20中任一项的核酸、方面21的一种或多种多肽、方面22的重组表达载体、方面23的宿主细胞或方面24的细胞群，以及药学上可接受的载体。

26.一种检测哺乳动物中癌症的存在的方法，包括：

(a)使包含来自哺乳动物的一种或多种细胞的样品与方面1-20中任一项的核酸、方面21的一种或多种多肽、方面22的重组表达载体、方面23的宿主细胞、方面24的细胞群或方面25的药物组合物接触，从而形成复合物，以及

(b)检测所述复合物，其中所述复合物的检出指示所述哺乳动物中存在癌症。

27.方面1-20中任一项的核酸、方面21的一种或多种多肽、方面22的重组表达载体、方面23的宿主细胞、方面24的细胞群或方面25的药物组合物，其用于治疗或预防哺乳动物中的癌症。

28.方面23的宿主细胞或方面24的细胞群，其用于方面27的用途。

29.方面23的宿主细胞或方面24的细胞群，其用于方面27或28的用途，其中所述宿主细胞或细胞群相对于哺乳动物是自体的。

30.方面23的宿主细胞或方面24的细胞群，其用于方面27或28的用途，其中所述宿主细胞或细胞群相对于哺乳动物是同种异体的。

31.方面1-20中任一项的核酸、方面21的一种或多种多肽，方面22的重组表达载体、方面23的宿主细胞、方面24的细胞群或方面25的药物组合物，其用于方面27-30中任一项的用途，其中所述癌症是血液恶性肿瘤。

以下实施例进一步说明本发明，但当然不应解释为以任何方式限制其范围。

实施例

在实施例1-18中描述的实验中采用以下材料和方法。

细胞系

转导K562细胞以表达CD19(CD19-K562)或低亲和力神经生长因子(NFGR-K562)(Kochenderfer et al.,J.Immunother.,32(7):689-702(2009))。K562细胞也被转导以表达CD20。用MSGV1γ-逆转录病毒载体通过标准方法进行K562转导(Hughes,et al.,HumanGene Therapy,16(4):457-472(2005))。NGFR-K562细胞作为CD19阴性对照细胞。CCRF-CEM细胞(ATCC)也用作阴性对照细胞。CD19

CAR构建

设计了5个双顺反子抗CD19/抗CD20 CAR构建体。每个CAR的序列遵循从N-末端到C-末端的这种模式：前导序列(SS)(例如，来自人CD8α，抗-CD19抗原结合结构域(例如scFv，其从N-末端到C-末端由包含通过接头序列连接的抗-CD19抗体的重链和轻链的抗-CD19scFv组成)、人CD8α铰链和跨膜结构域、人CD28的细胞内T细胞信号传导结构域、人CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域、包括F2A核糖体跳跃序列和口蹄疫病毒(F2A)氨基酸序列的切割序列、抗CD20抗原结合结构域(例如scFv，其从N-末端至C-末端由包含通过接头序列连接的抗CD20抗体的重链和轻链的抗CD20 scFv组成)、CD8α铰链和跨膜结构域、人4-1BB的细胞内T细胞信号传导结构域和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导结构域。CAR是相同的，除了CD20抗原结合结构域是从不同的scFv产生的。使用来自抗体11B8、C2B8、8G6-5、2.1.2和GA101的scFv。合成的CAR构建体的每种组分的特定序列示在下表1-5中。

表1.Hu1928-11B8BB

表2.Hu1928-C2B8BB

表3.Hu1928-2.1.2BB

表4.Hu1928-8G6-5BB

表5.Hu1928-GA101BB

使用抗CD19 CAR,Hu19-CD828Z，其含有完全人抗体的可变区序列、CD28共刺激结构域和CD3ζT-细胞活化结构域(Alabanza,et al.,Molecular Therapy,25(11):2452-2465(2017))。设计了命名为Hu19的scFv，其含有轻链可变区(SEQ ID NO:4)、接头肽(GSTSGSGKPGSGEGSTKG[SEQ ID NO:5])和重链可变区(SEQ ID NO:6)。scFv还包括人CD8α前导序列(SEQ ID NO:3)。设计了编码CAR的DNA序列，所述CAR从5'至3'具有以下组分：Hu19scFv、人CD8α分子的铰链区和跨膜区的一部分(SEQ ID NO:7)、人CD28的细胞内T细胞信号传导结构域(SEQ ID NO:8)和人CD3ζ分子的细胞内T细胞信号传导结构域(SEQ ID NO:9)。使用Invitrogen GENEART

为了形成具有识别CD19和CD20的能力的构建体，将Hu19-CD828Z掺入双顺反子构建体中，该构建体也编码靶向CD20的单独CAR。制备5个抗CD20 CAR构建体。第一个构建体包括CD8α前导序列，随后是如上所述的Hu19-CD828Z CAR序列。接着，加入含F2A的核糖体跳跃切割序列，然后加入5个抗-CD20 CARs中的一个。抗CD20 CARs中的一个被命名为C2B8-CD8BBZ。该CAR包含CD8α前导序列，随后是由C2B8重链和轻链可变区组成的scFv，所述重链和轻链可变区通过由4个甘氨酸和1个丝氨酸(G4S)

如上所述，设计并合成了4个以上的CAR构建体。用于产生scFv区域的这些可变区来自3种完全人抗体11B8、2.1.2或8G6-5中的一种，并且一种CAR具有来自人源化抗体GA101的可变区。抗CD20 CARs被命名为11B8BB、8G6-5BB、2.1.2BB和GA101BB。这些CARs除了具有不同的scFv外都具有相同的序列。在每种情况下，可变区通过(G4S)

通过使用相同的方法合成四种双顺反子CAR构建体，Hu1928-11B8BB,Hu1928-2.1.2BB,Hu1928-8G6-5BB,Hu1928-GA101BB(参见表2-5)。通过Invitrogen GENEART

在实验中产生了5个具有抗-CD20C2B8 scFv的抗-CD20CARs作为对照。C2B8-CD828Z含有CD28共刺激结构域。其它抗CD20CARs含有4-1BB共刺激结构域，这些CARs也都包括CD8α前导序列和CD3ζT-细胞活化结构域。这些CAR是上述双顺反子CAR构建体的所有组分，并且如上所述设计和构建它们。这些CARs具有以下5个scFv中的一个：C2B8、11B8、8G6-5、2.1.2和GA101。含有这些CARs中每一个的CARs是C2B8-CD8BBZ、11B8-CD8BBZ、8G6-5-CD8BBZ、2.1.2-CD8BBZ和GA101-CD8BZ。

T细胞培养物

将PBMC解冻并在含有AIM V

γ-逆转录病毒转导

为了产生无复制能力的γ-逆转录病毒，用编码CARs的质粒以及编码RD114包膜蛋白的质粒转染包装细胞(参见Kochenderfer et al.,J.Immunother.,32(7):689-702(2009))。T细胞的γ逆转录病毒转导在T细胞培养物开始后2天进行。

对T细胞进行CAR检测

特异性结合Hu19-CD828Z CAR的接头组分的命名为Kip-1的APC标记的抗体用于检测该CAR和C2B8-CD828Z。使用市售的抗利妥昔单抗抗体检测C2B8-CD828Z以外的含C2B8的CARs。命名为Kip-4的PE-标记的抗体用于检测抗CD20 CARs。Kip-4结合(G4S)

干扰素-γ和肿瘤坏死因子αELISA

将十万个BCMA

CD107a测定

对于每个测试的T细胞培养物，准备两个管。一个管含有BCMA-K562细胞，另一个管含有NGFR-K562细胞。两个管都含有CAR转导的T细胞、1ml AIM V

增殖试验

在24孔板中建立共培养物。包括在共培养物中的靶细胞是0.5×10

细胞毒性测定

如前所述进行细胞毒性测定(参见Kochenderfer et al.,J.Immunother.,32(7):689-702(2009))。通过比较BMCA

实施例1

该实施例举例说明了分别编码靶向CD19和CD20的第一和第二CARs的双顺反子构建体的制备。

如上所述构建双顺反子构建体(也参见图1A-1J和19)。用γ-逆转录病毒载体表达CAR构建体。图2D显示CAR Hu1928-C2B8BB(图1A所示的CAR)的T细胞表达。图2A是来自未转导对照的图。图2B和2C分别是CARsHu19-CD828Z(抗CD19 CAR)和C2B8-CD828Z(抗CD20 CAR)的图。

图8A和8B显示Hu19-CD828Z,C2B8-CD8BBZ,Hu1928-C2B8BB和Hu1928-11B8BB的CART-细胞表面表达。图8A显示用抗-Hu19抗体染色，其结合包括在Hu19-CD828Z中的接头。Hu19-CD828Z与用包括Hu19-CD828Z CAR的构建体转导的所有T细胞结合。图8B显示用结合C2B8的抗利妥昔单抗抗体染色。抗利妥昔单抗抗体与含有C2B8的CAR构建体结合。

实施例2

该实施例证明由双顺反子构建体编码的第一和第二CAR分别特异性识别CD19和CD20。

分析实施例1中所述的CAR，发现它们成功地引发细胞因子的抗原特异性释放，如下表6-9所示。该表显示所示的CAR在CAR T细胞的表面上表达。表6、8和9显示当CAR T细胞与靶细胞一起培养时产生高水平的IFNγ，并且当CAR T细胞与BAMC阴性靶细胞一起培养时产生非常低水平的IFNγ。单独培养的表达CAR的T细胞产生非常低水平的IFNγ。类似地，表7显示当CAR T细胞与靶细胞一起培养时产生高水平的IL-2，并且当CAR T细胞与BAMC阴性靶细胞一起培养时产生非常低水平的IL-2。

表6.与靶细胞共培养过夜后抗原特异性IFNγ的产生

表7.与靶细胞共培养过夜后抗原特异性IL-2的产生(患者1)

表8.与靶细胞共培养过夜后抗原特异性IFNγ的产生(患者2)

表9.与靶细胞共培养过夜后抗原特异性IFNγ的产生

实施例3

该实施例证实了由双顺反子构建体编码的第一和第二CARs经历CD19和CD20特异性脱颗粒。

评估CAR T细胞或未转导的T细胞的CD107a上调，这是脱颗粒的标记。将用所示双顺反子CAR构建体转导的T细胞与CD20-K562细胞、CD19-K562细胞或阴性对照NGFR-K562细胞培养4小时。

图3显示表达CAR的CD8

实施例4

本实施例证实了表达抗CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体的T细胞成功杀死淋巴瘤细胞。

T细胞未转导或用Hu19-CD828Z、C2B8-CD828Z或Hu1928-C2B8BB转导。T细胞与CD19

如图6所示，表达Hu1928-C2B8BB的T细胞有效地杀伤淋巴瘤细胞系细胞。

实施例5

该实施例说明表达CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体的T细胞的细胞毒性和增殖。

抗CD19/抗CD20 CAR构建体转导的T细胞的细胞毒性评估揭示，当暴露于表达其靶抗原的细胞时，表达CAR的T细胞优先增殖。如图7A-7D所示，y轴上的细胞计数表明，当CAR T细胞暴露于靶抗原时，培养期结束时的T细胞数量较高。图7A和7B是用Hu19-CD828Z转导的细胞的图，图7C和7D是用Hu19-CD828Z转导的细胞的图，图7E和7F是用Hu1928-C2B8BB转导的细胞的图。

实施例6

该实施例说明CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体在原代人T细胞上表达。

使用命名为Kip-1和Kip-4的APC标记的抗体来检测CARs。图11B显示来自用Hu1928-2.1.2BB转导的细胞的图。图11C显示来自用Hu1928-8G6-5BB转导的细胞的图。图11D显示来自用Hu1928-GA101BB转导的细胞的图。图11E显示来自用Hu1928-C2B8BB转导的细胞的图。图12B显示了来自当评估2.1.2BB的表达时的图。图12C显示了来自当评估8G6的表达时的图。图12D显示了来自当评估GA101BB时的图。图12E显示了当评价C2B8时的图。

实施例7

该实施例说明CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体在治疗癌症方面是有效的。

在免疫受损的NOD scidγ小鼠(NSG小鼠，Jackson Laboratory)中建立ST486(ATCC)肿瘤(B淋巴细胞，伯基特氏淋巴瘤)。使4百万肿瘤细胞生长6天，然后将4百万CAR T细胞注射到小鼠中。

图17显示本发明的构建体在小鼠中消除肿瘤。如图17所示，未转导的(空心三角形)和SP6-CD828Z(空心圆形)转导的T细胞使肿瘤体积增加，而Hu1928-8G6-5BB(实心菱形)和Hu1928-2.1.2BB(空心正方形)被证明是有效的肿瘤疗法。图18显示用本发明的CARs治疗可以提高小鼠的存活率。如图18所示，用未转导的(空心三角形)和SP6-CD828Z(空心圆形)T细胞处理的小鼠在少于30天内显示出0％的存活率，而Hu1928-8G6-5BB(实心菱形)和Hu1928-2.1.2BB(空心正方形)被证明是有效的肿瘤疗法，在50天后具有100％的存活率。

实施例8

该实施例说明CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体在转导后在T细胞的细胞表面上表达。

用2种单克隆抗体对用MSGV1-Hu1928-2.1.2BB转导的T细胞进行染色。这些抗体之一Kip-1结合包括在Hu19-CD828Z的Hu19scFv中的接头，而另一抗体Kip-4结合包括在Hu20-CD8BZ的Hu20scFv中的接头。

图20显示转导后5天，Hu19-CD828Z和Hu20-CD8BBZ在T细胞表面的表达。在该研究中，在第0天，通过用含IL-2的培养基中的抗CD3单克隆抗体刺激，开始未选择的PBMC的培养。开始培养2天后进行转导，6天后评价T细胞的CAR表达，此时细胞总共培养8天。图20和21中的图以CD4

如图20和21所示，在用这些CARs转导后，Hu19-CD828Z和Hu20-CD8BBZ都存在于T细胞的表面。

实施例9

该实施例说明CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体的CD20结合特异性。

转染HEK293细胞以表达5,647种人质膜蛋白。这允许针对这些人蛋白筛选与基于抗体的试剂的反应性(筛选由第三方进行，Retrogenix

Hu20-CD8BBZ T细胞和未转导T细胞之间结合的唯一差异是CD20，这对于这种抗CD20 CAR和CD27是预期的。CD27结合非常弱并且不一致，但是，293T细胞被转导，并且在IFN-γELISA中评估针对Hu20-CD8BBZ T细胞的反应性。

当Hu20-CD8BBZ T细胞暴露于CD27

实施例10

该实施例说明表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞的特异性脱颗粒。

T细胞的脱颗粒是穿孔素和颗粒酶介导的细胞毒性的先决条件。为每个测试的T细胞培养物准备5个试管。上述管含有如下的靶细胞：CD19和CD20阴性的NGFR-K562细胞，CD19

图22和23显示了代表性的CD107a试验，其中未转导(UT)的T细胞、Hu1928-2.1.2BBT细胞、Hu19-CD828Z T细胞(Hu1928)和Hu20-CD8BBZ T细胞(2.1.2BB)与靶细胞一起培养4小时。所述T细胞响应靶细胞而特异性脱颗粒，，其中Hu1928-2.1.2BB T细胞响应CD19

如上所述，该研究显示表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞响应CD19

实施例11

该实施例说明表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞的体外增殖。

在24孔板中建立共培养物。包含在共培养物中的靶细胞是0.5x10

图24显示该CFSE增殖测定的结果。直方图的曲线下的面积与细胞的数目成比例。标记直方图以指示T细胞是否用CD19-K562细胞、CD20-K562细胞或NGFR-K562刺激。

该研究显示，当与CD19

实施例12

该实施例说明表达抗CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体的T细胞的细胞毒性。

通过将CD19

如图25所示，表达Hu1928-2.1.2BB、Hu19-CD828Z或Hu20-CD8BBZ的T细胞杀伤表达CD19和CD20的人淋巴瘤细胞系靶细胞。

实施例13

该实施例说明抗-CD19/抗-CD20双顺反子CAR构建体的体外CD20结合特异性。

将来自同一患者的表达CAR的T细胞或未转导的T细胞与靶细胞一起培养过夜，然后进行标准IFNγ酶联免疫吸附测定(ELISA)。然后当T细胞与靶细胞一起培养时(参见下表10-12)，评估T细胞以观察它们是否被活化，如IFNγ释放所示。CAR T细胞特异性地与表达CD19和/或CD20的靶细胞反应，这通过当T细胞与表达CD19和/或CD20的靶细胞一起培养时，与当T细胞与既不表达CD19也不表达CD20的靶细胞一起培养时相比，IFNγ释放的水平高得多来指示。

转导K562细胞以表达CD19(CD19-K562)，低亲和力神经生长因子(NFGR-K562)或CD20。用MSGVγ-逆转录病毒载体通过标准方法将所有这些基因转移到K562细胞中。NGFR-K562细胞作为CD19阴性对照细胞。使用NALM6和ST486细胞系以及以下CD19阴性细胞系：黑色素瘤细胞系624、白血病细胞系NGFR-K562、T细胞白血病细胞系CCRF-CEM；A549(肺癌细胞系)；MDA-MB231(乳腺癌细胞系),TC71(尤文肉瘤细胞系),COLO205(结肠癌细胞系),U251(成胶质细胞瘤细胞系),Panc10.05(胰腺癌细胞系),HepG2(肝细胞癌)和A431-H9(用间皮素基因转导的表皮样(皮肤)癌细胞系)。还评价了CAR T细胞与人原代细胞的反应性(表12)。下列原代人细胞获自Lonza：肾近端肾小管上皮细胞，骨骼肌细胞，肝细胞，肾皮质上皮细胞和乳腺上皮细胞。在每个实验中，还给出了单独培养的效应T细胞的结果。

对来自T细胞加上表达CD19和/或CD20的靶细胞或CD19和CD20均阴性的靶细胞的过夜共培养物的培养物上清液进行ELISA测定。在表10所示的数据中，来自患者的T细胞未被转导或被编码Hu1928-2.1.2BB,Hu19-CD828Z或Hu20-CD8BZ的基因转导。

表11显示当Hu1928-2.1.2BB CAR T细胞或未转导的T细胞与CD19-K562,CD20-K562或一组CD19和CD20均阴性的人细胞系培养过夜时，这些T细胞的IFNγ释放。

表12显示了当一组原代人细胞与来自患者的T细胞一起培养时的IFNγ释放，所述T细胞未被转导或用编码Hu1928-2.1.2BB、Hu19-CD828Z或Hu20-CD8BZ的基因转导。

表达每种CAR的T细胞的百分比列于以下各表的最右栏。通过用Kip-1抗体或Kip-4抗体染色CAR转导的T细胞和未转导的T细胞来确定该数目。通过流式细胞术分析细胞，从用Kip-1或Kip-4染色的CAR转导的T细胞的百分比中减去用适当抗体染色的未转导的T细胞的百分比，以获得CAR

用抗CD19和/或抗CD20 CARs转导的T细胞在与表达合适的靶抗原的细胞系一起培养过夜时产生大量的IFNγ。Hu1928-2.1.2BB T细胞没有响应CD19和CD20均为阴性的细胞系而释放IFNγ(参见表10-12)。表10-12中的所有细胞因子值都是以皮克/mL为单位的IFNγ水平。

使用抗CD20 CARs的一个潜在问题是患者先前可能已经接受的血清抗CD20抗体的可能阻断。抗CD20单克隆抗体，例如利妥昔单抗，可能阻断CAR T细胞与淋巴瘤细胞的结合。先前的报道已经评估了患者血清中的利妥昔单抗水平，并且发现在过去4个月接受利妥昔单抗的患者中利妥昔单抗中值血清浓度为38.3μg/mL(Rufener等人,Cancer ImmunologyResearch,4:509-519(2016))。

鉴于此，可溶性利妥昔单抗对抗CD20 CAR T细胞的影响通过形成ELISA测定来获得，其中将Hu1928-2.1.2BB CAR T细胞，CD20

表10

除了最后一列以外，所有的值都是以pg/ml为单位的IFNγ，这是通过流式细胞术的表达所示CAR的每种培养物的百分比。

将T细胞与指定的靶细胞一起培养过夜，并进行IFNγELISA。

CD19-K562表达CD19,CD20-K562表达CD20；列出的所有其它靶标都缺乏CD19和CD20。

表11

表12

除了最后一列以外，所有的值都是以pg/ml为单位的IFNγ，这是通过流式细胞术的表达所示CAR的每种培养物的百分比。

将T细胞与所示的原代人靶细胞一起培养过夜，并进行IFNγELISA。

CD19-K562表达CD19,CD20-K562表达CD20；列出的所有其它靶标都缺乏CD19和CD20。

表13

当与表达CD19或CD20的细胞系培养过夜时，用Hu1928-2.1.2BB转导的T细胞产生大量的IFNγ，但是当用缺乏CD19和CD20表达的人细胞系或原代人细胞培养时，仅产生少量的IFNγ。结果显示Hu1928-2.1.2BB CAR T细胞特异性识别表达CD19或CD20或表达CD19和CD20两者的靶细胞。Hu1928-2.1.2BB T细胞不特异性识别缺乏CD19和CD20表达的多种细胞系和原代细胞中的任何一种。此外，Hu1928-2.1.2BB构建体的组成CARs是抗CD19 CARHu19-CD828Z和抗CD20 CAR Hu20-CD8BBZ。Hu19-CD828Z特异性识别CD19

在培养基中存在利妥昔单抗以及CAR T细胞和表达CD20的靶细胞确实部分阻断了IFN-γ从Hu1928-2.1.2BB T细胞中的释放，但是在所有利妥昔单抗浓度下(包括与患者临床接受利妥昔单抗后在患者血液中发现的利妥昔单抗的浓度等同的浓度下)都释放了大量的IFN-γ。这一研究的这些结果可能暗示利妥昔单抗可以部分阻断Hu1928-2.1.2BB T细胞对淋巴瘤细胞的识别。

实施例14

该实施例说明抗-CD19/抗-CD20双顺反子CAR构建体在体外杀伤原代白血病细胞。

在如上述实施例12所述的细胞毒性测定中评价未转导或用Hu1928-2.1.2BB转导或用阴性对照CAR SP6-CD828Z转导的T细胞，不同之处在于原代人慢性淋巴细胞白血病细胞用作CD19

图26显示表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞能够特异性杀伤原代慢性淋巴细胞白血病细胞。

实施例15

该实施例说明抗-CD19/抗-CD20双顺反子CAR构建体在消除肿瘤方面是有效的。

本研究评价了表达Hu1928-2.1.2BB的人T细胞的抗肿瘤功效和毒性，以及表达Hu1928-2.1.2BB的CAR T细胞在小鼠体内的剂量-反应曲线。

使用来自Jackson实验室小鼠的免疫受损的Nod-Scid共用γ-链敲除(NSG,NOD.Cg-Prkdc

来自剂量滴定实验的结果示于图27和28中。在该研究中，在CAR T细胞输注前6天注射4百万个ST486细胞以建立可触知的皮内肿瘤。然后用单次输注分级剂量的Hu1928-2.1.2BB T细胞处理小鼠，如图27和28所示。肿瘤消除是剂量依赖性的，并且2和4百万个CART细胞的剂量具有清楚的抗肿瘤活性。

将表达Hu1928-2.1.2BB及其组成CARs的T细胞的抗肿瘤活性与ST486空的(CD19-/-，CD19表达被CRISPR/Cas9消除)进行比较。在CAR T细胞输注之前6天注射四百万个ST486(CD19-/-)细胞以在CAR T细胞输注之前建立可触知的皮内肿瘤。在该模型中，Hu1928-2.1.2BB和Hu20-CD8BBZ比Hu19-CD828Z有效得多，这是预期的，因为ST486(CD19-/-)表达CD20，但具有非常低水平的CD19表达。Hu19-CD828Z的适度抗肿瘤活性可能是由Hu19-CD828Z T细胞与ST486(CD19-/-)细胞上表达的一些残留CD19反应引起的，尽管试图消除CD19。该研究的结果示于图29和30中。

还针对NALM6细胞系NALM6的肿瘤测试Hu1928-2.1.2BB CAR T细胞是CD19

在这些实验中，接受Hu1928-2.1.2BB T细胞的小鼠都没有表现出中毒迹象。小鼠没有表现出发皱的毛皮或降低的活性，并且小鼠仅在实验结束时处死时或在大的肿瘤出现后处死时死亡。

这些研究表明表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞对已建立的人肿瘤细胞系的肿瘤具有剂量依赖性活性。表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞对缺乏CD19或CD20表达的细胞具有强抗肿瘤活性。小鼠在CAR

实施例16

该实施例说明抗-CD19/抗-CD20双顺反子CAR构建体是无毒的。

在NSG小鼠中建立ST486实体瘤，然后给小鼠灌注未转导的T细胞或5×10

当用Hu1928-2.1.2BB处理具有ST486细胞的实体瘤的小鼠时，该研究没有提供在这些小鼠中有任何毒性或高水平的IFN-γ的证据。

表14

实施例17

该实施例说明抗-CD19/抗-CD20双顺反子CAR构建体不引起T细胞永生化。

在没有外源IL-2的培养基中观察用MSGV1-Hu1928-2.1.2BB转导的T细胞。对来自2名患者的样品进行研究。来自代表性样品的数据显示在图34中。图34显示转导的T细胞不是永生化的，因为在第0天将IL-2从培养物中洗出后，它们的数目稳定地减少。

实施例18

该实施例说明抗-CD19/抗-CD20双顺反子CAR构建体可以与化疗联合施用。

在该研究中，环磷酰胺500mg/m

给予调理化疗(conditioning chemotherapy)方案将允许观测到调理方案之后表达Hu1928-2.1.2BB的T细胞的增强效果。施用化疗或放疗可以通过多种机制增强抗CD19/抗CD20双顺反子CAR构建体的过继T-细胞治疗，所述机制包括调节性T细胞的耗竭和T细胞刺激血清细胞因子(包括白细胞介素-15(IL-15)和白细胞介素-7(IL-7))的升高，以及骨髓抑制细胞的可能耗竭和其它机制。通过消耗内源性T细胞和天然杀伤细胞来去除内源性“细胞因子汇(cytokine sinks)”引起重要的T细胞刺激细胞因子如IL-15和IL-7的血清水平增加，并且T细胞功能和抗肿瘤活性的增加依赖于IL-15和IL-7(参见，例如，Gattinoni等人，Journal of Experimental Medicine，202：907-912(2005))。在鼠异种移植模型中的实验显示调节性T细胞可损害抗CD19 CAR T细胞的抗肿瘤功效(Lee等人，Cancer Research，71：2871-2881(2011))。已经显示骨髓抑制细胞抑制抗肿瘤应答(Dumitru等人,CancerImmunology,61:1155-1167(2012))。用同基因鼠模型的实验表明，T细胞治疗淋巴瘤需要在输注抗CD19-CAR转导的T细胞之前施用耗竭淋巴细胞的全身辐射(TBI)。在这些实验中，一些小鼠接受TBI，而其它小鼠没有接受TBI。然后用淋巴瘤攻击所有小鼠，以及用同基因抗CD19-CAR T细胞处理小鼠。接受TBI的小鼠具有100％的治愈率，而未接受TBI的小鼠具有0％的治愈率(参见Kochenderfer等人，Blood，116：3875-3886(2010)。

先前的研究已经提供了强有力的暗示证据，证明过继转移的T细胞在人体中的活性增强。在没有淋巴细胞消耗化疗的情况下施用抗CD19-CAR T细胞的临床试验中，几乎没有发生临床反应，并且几乎没有产生体内活性的证据。相反，在临床试验中已经出现许多淋巴瘤的持久缓解和长期B细胞耗竭的证据，其中患者在淋巴细胞耗竭化疗后接受抗CD19-CAR T细胞。最佳增加表达CAR的T细胞的抗恶性肿瘤功效的化疗方案是未知的，但是最令人信服地与过继转移的T细胞的持久性和体内活性相关的化疗方案包括环磷酰胺和氟达拉滨。环磷酰胺和氟达拉滨在耗竭淋巴细胞方面都是高度有效的。一种充分表征和通常使用的方案是以下组合：每日施用300-500mg/m

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过引用并入，其程度如同每篇参考文献被单独和具体地指出通过引用并入本文一样，并且在本文以其整体阐述。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一个/一种”和“所述”和“至少一种/一个”以及类似的指示物(特别是在以下权利要求的上下文中)应被解释为涵盖单数和复数两者，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“至少一种/一个”之后一项或多项列举(例如，“A和B中的至少一种/一个”)的使用应被解释为意指选自列出的项中的一项(A或B)或者两个或更多个列出的项的任意组合(A和B)，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被解释为开放式的术语(即意指“包括，但不限于”)，除非另外指明。本文数值的范围的描述仅旨在用作分别提及属于范围内的每个单独数值的速记法，除非本文另外指出，并且将每个单独数值并入说明书，如同其在本文中被独立描述一样。本文描述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾。本文提供的任何和所有的实例或示例性语言(如“诸如”)的使用仅仅旨在更好地阐明本发明，不会对本发明的范围构成限制，除非以另外方式进行保护。不应将本说明书中的语言解释为表明任何未要求保护的组分对实施本发明是必要的。

本发明的优选实施方案在本文中描述，包括发明人已知的实施该发明的最佳模式。对本领域的普通技术人员来说，阅读上述说明书后这些优选的实施方案的变型可以是显而易见的。发明人期望本领域技术人员酌情利用这些变型，并且发明人有意以不同于本文具体描述的方式实施该发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括在所附的权利要求中所述主题的所有变化和等同物。而且，在其所有可能的变型中上述要素的任何组合包括于本发明中，除非本文另外说明或与上下文明显矛盾。

序列表

<110> 美国卫生和人力服务部

<120> 靶向CD19和CD20的双顺反子嵌合抗原受体及其用途

<130> 744443

<150> US 62/732,263

<151> 2018-09-17

<160> 50

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 1

atggccctgc ctgtgacagc tctgctgctg cccctggccc tgctgctgca tgccgccaga 60

cctgagatcg tgctgaccca gtctcccggc accctgtctc tcagcccagg agagagagcc 120

accctgagct gcagagccag ccagagcgtg tccagcagct acctggcctg gtatcagcag 180

aagcccggac aggcccccag actgctgatc tacggcgcca gctctagagc caccggcatc 240

cccgacagat tcagcggcag cggcagtggc accgacttca ccctgaccat cagcagactg 300

gaacccgagg acttcgccgt gtactactgc cagcagtacg gcagcagccg gttcaccttc 360

ggccctggca ccaaggtgga catcaagggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggctct 420

ggcgagggct ctaccaaggg ccaggtgcag ctggtgcagt ctggcgccga agtgaagaaa 480

cccggctcta gcgtgaaggt gtcctgcaag gacagcggcg gcaccttcag cagctacgcc 540

atcagctggg tgcgccaggc cccaggacag gggctggaat ggatgggcgg catcatcccc 600

atcttcggca ccaccaacta cgcccagcag ttccagggca gagtgaccat caccgccgac 660

gagagcacca gcaccgccta catggaactg agcagcctgc ggagcgagga cacagccgtg 720

tattactgtg cccgcgaggc cgtggccgcc gactggctgg atccttgggg acagggcacc 780

ctggtgacag tgtccagctt cgtgcctgtg tttctgcctg ccaagcccac cacaacccct 840

gcccctagac ctcctacacc cgcccctaca atcgccagcc agcctctgtc tctgaggccc 900

gaggcttgta gacctgctgc tggcggagcc gtgcacacca gaggactgga tttcgcctgc 960

gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acatgtggcg tgctgctgct gagcctcgtg 1020

atcaccctgt actgcaacca ccggaacaga agcaagcgga gccggctgct gcacagcgac 1080

tacatgaaca tgacccccag acggcctggc cccaccagaa agcactacca gccttacgcc 1140

cctcccagag acttcgccgc ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagaag cgccgacgcc 1200

cctgcctatc agcagggcca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa 1260

gagtacgatg tgctggacaa aagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1320

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1380

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1440

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1500

cctcgccggg ccaagagaag cggcagcgga gcccccgtga agcagaccct gaacttcgac 1560

ctgctgaaac tggccggcga cgtggagagc aaccctggcc ccatggccct gcctgtgaca 1620

gctctgctgc tgcccctggc cctgctgctg catgccgcca gacctgaaat cgtgcttaca 1680

caatcacctg cgacactttc tctttccccc ggtgaaagag caaccctgtc ttgtagagca 1740

agtcaaagcg ttagcagtta tctcgcatgg taccaacaga agcccggtca ggcgcctcgc 1800

ctgttgatat acgacgctag taaccgagca accggaatcc ctgctagatt cagtgggtct 1860

ggaagcggca ctgatttcac tcttactatc tcttctttgg agcctgagga ctttgcagtt 1920

tattactgtc agcagagatc agattggccc ctcactttcg gtggaggcac aaaggttgaa 1980

ataaaggggg gcggaggttc aggcggcgga ggaagcggcg gggggggctc cgaggttcaa 2040

cttgtccaaa gtggaggggg actggtccat ccgggaggta gcttgcggct ctcttgtaca 2100

ggcagtggat tcacgttttc ttaccacgca atgcattggg tgagacaagc acccggtaag 2160

ggcttggagt gggtatccat cattggcact ggcggagtca cctattatgc ggacagtgtt 2220

aagggccgct ttactatcag ccgcgacaac gttaagaatt ctctgtattt gcagatgaat 2280

tcactgaggg cggaagacat ggccgtttac tattgcgcca gagactacta tggggctggt 2340

tccttctacg acggtttgta tggtatggat gtctggggcc agggcacgac ggtaaccgtg 2400

tcaagtttcg ttccggtttt tctgcctgca aagcctacaa ctacccccgc accccggccc 2460

ccaactcccg ctccaacgat cgcatcacaa ccactttcac tccgaccaga ggcttgtaga 2520

ccggctgcgg gaggcgcggt acacacgcgg gggctcgatt ttgcttgcga tatttacatc 2580

tgggctcctc ttgccggcac atgcggtgtc ttgctcctgt ccctcgtcat tactctgtat 2640

tgcaaccata ggaacaagcg gggcagaaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc 2700

atgcggcccg tgcagaccac ccaggaagag gacggctgct cctgcagatt ccccgaggaa 2760

gaagaaggcg gctgcgagct gagagtaaaa ttttccaggt ccgcagatgc acccgcttat 2820

cagcagggcc aaaaccaact gtataatgag ttgaacttgg ggaggcgaga agagtatgac 2880

gttttggata aaagacgggg acgagacccc gagatgggtg gaaagccacg gcgcaagaac 2940

ccgcaagaag ggctctataa tgaacttcaa aaagacaaga tggccgaagc ctactcagaa 3000

attggcatga aaggtgagag gaggcgcggg aaaggccatg acgggcttta tcaggggttg 3060

tcaacggcca ctaaggatac gtatgacgct ctccacatgc aagcgttgcc cccccgctaa 3120

<210> 2

<211> 1039

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

20 25 30

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

50 55 60

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

65 70 75 80

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

100 105 110

Tyr Gly Ser Ser Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile

115 120 125

Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

145 150 155 160

Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Asp Ser Gly Gly Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala

195 200 205

Gln Gln Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro Trp

245 250 255

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu

260 265 270

Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg

290 295 300

Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys

305 310 315 320

Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu

325 330 335

Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys

340 345 350

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

355 360 365

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

370 375 380

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

385 390 395 400

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

405 410 415

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

420 425 430

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

435 440 445

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

450 455 460

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

465 470 475 480

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

485 490 495

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro

500 505 510

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

515 520 525

Glu Ser Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

530 535 540

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Leu Thr

545 550 555 560

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu

565 570 575

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln

580 585 590

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn

595 600 605

Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

610 615 620

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val

625 630 635 640

Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly

645 650 655

Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

660 665 670

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu

675 680 685

Val His Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe

690 695 700

Thr Phe Ser Tyr His Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

705 710 715 720

Gly Leu Glu Trp Val Ser Ile Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr

725 730 735

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys

740 745 750

Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala

755 760 765

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp

770 775 780

Gly Leu Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

785 790 795 800

Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro

805 810 815

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

820 825 830

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

835 840 845

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

850 855 860

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

865 870 875 880

Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

885 890 895

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

900 905 910

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg

915 920 925

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

930 935 940

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

945 950 955 960

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

965 970 975

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

980 985 990

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

995 1000 1005

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

1010 1015 1020

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

1025 1030 1035

Arg

<210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Arg

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 5

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 6

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 6

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Asp Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Gln Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 7

<211> 83

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro

1 5 10 15

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

35 40 45

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

50 55 60

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn

65 70 75 80

His Arg Asn

<210> 8

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 9

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 10

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 10

Arg Ala Lys Arg Ser Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn

1 5 10 15

Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25 30

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 12

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 13

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr His

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ile Ile Gly Thr Gly Gly Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Tyr Tyr Gly Ala Gly Ser Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 14

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 15

<211> 3102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成的

<400> 15