具有侧基窄发射受体的聚合物串联染料

根据《美国法典》第35章第119节(e)的规定，本专利申请案主张于2018年8月7日提交的编号为62/715,737的美国临时专利申请案提交日期的优先权；该专利中的内容以引用方式并入本文中。

荧光染料是用其所吸收的波长的光辐照时会发射出(通常)不同波长的光的化合物。荧光染料可用于各种生物化学、生物学和医学应用中，例如，用于诊断试剂盒、显微镜检查或药物筛选中。荧光染料的特征在于有许多参数，以便用户根据预期用途来选择合适的染料。目的参数包括最大激发波长、最大发射波长、斯托克斯位移、消光系数、荧光量子产率和荧光寿命。例如，为了使激发辐射穿透生物样品、最大限度地减少背景荧光和/或获得高信噪比，可以根据目的应用来选择染料。

分子识别涉及两个分子的特异性结合。对靶标生物分子具有结合特异性的分子可用于各种研究和诊断应用中，例如，分析物标记和分离、流式细胞术、原位杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选和色谱分析。靶标生物分子可以通过用荧光染料标记来加以检测。

发明内容

本发明提供了窄发射荧光团染料以及包括所述窄发射荧光团染料的聚合物串联染料。所述聚合物串联染料包括窄发射荧光团，所述窄发射荧光团被配置为在能量接收时接近供体水溶剂化捕光多发色团的侧基受体。所述聚合物串联染料提供了适用于多路复用应用的各种窄发射光谱。本发明还提供了用于多色荧光信号生成的组合物，所述组合物包括两种或更多种聚合物串联染料。此外，本发明还提供了评估样品中靶标分析物存在情况的方法以及标记靶分子的方法，其中在所述方法中使用标的聚合染料。本发明还提供用于实施标的方法的系统和试剂盒。

附图说明

应当理解，下述附图仅用于说明之目的，无意以任何方式限制本发明传授内容的范围。

图1展示了示例性窄发射染料和各种市售BODIPY染料的半峰全宽(FWHM)与最大发射波长之间的关系。虽然在移至更长波长处时，所述市售BODIPY染料的发射峰会变得更宽，但峰宽与所述示例性染料基本相同。

图2A-2B展示了四种示例性窄发射BODIPY染料(表现出小斯托克斯位移)的吸收(图2A)和发射(图2B)光谱。

图3阐明了包括被水溶性基团取代的窄发射光谱受体荧光团的示例性聚合物串联染料(Violet-D2，有关光谱特征，请参见表2)的结构。G

图4展示了斯托克斯位移约为5nm的示例性受体荧光团(D6)的吸收和窄发射光谱。

图5A-5B展示了示例性受体荧光团D6本身(图5A)与聚合物串联染料(包括与所述受体荧光团D6连接的紫外线可激发的聚合物染料)(图5B)的吸收和窄发射光谱的比较。

图6A-6B展示了示例性受体荧光团D2本身(图6A)与聚合物串联染料(包括与所述受体荧光团D2连接的紫色光可激发的聚合物染料)(图6B)的吸收和窄发射光谱的比较。

图7A-7B展示了示例性受体荧光团D5本身(图7A)与聚合物串联染料(包括与所述受体荧光团D5连接的紫色光可激发的聚合物染料)(图7B)的吸收和窄发射光谱的比较。

图8A-8B展示了示例性受体荧光团D8本身(图8A)与聚合物串联染料(包括与所述受体荧光团D8连接的紫色光可激发的聚合物染料)(图8B)的吸收和窄发射光谱的比较。

图9展示了基于单种紫色光可激发的聚合物染料供体的多种聚合物串联染料的五种不同的窄发射曲线，每种聚合物串联染料分别具有不同的窄发射受体荧光团D2、D4、D5、D6或D8。

如上所述，本发明提供了窄发射荧光团染料以及包括所述窄发射荧光团染料的聚合物串联染料。所述聚合物串联染料包括窄发射荧光团，所述窄发射荧光团被配置为在能量接收时接近供体水溶剂化捕光多发色团的侧基受体。所述聚合物串联染料提供了适用于多路复用应用的各种窄发射光谱。本发明还提供了用于多色荧光信号生成的组合物，所述组合物包括两种或更多种聚合物串联染料。此外，本发明还提供了评估样品中靶标分析物存在情况的方法以及标记靶分子的方法，其中在所述方法中使用标的聚合染料。本发明还提供用于实施标的方法的系统和试剂盒。

在更加详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。

在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的任何其他规定值或中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。

本文中提出的某些范围在数值前带有术语“大约”。本文中使用术语“大约”的目的是为其后的精确数字以及与该术语之后数字接近或近似的数字提供文字支持。在确定某一数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近或近似的未列举数字在其出现的上下文中可以是基本上等同于所具体列举数字的数字。

除非另有定义，否则本专利所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了具有代表性的示例性方法和材料。

在本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用方式并入本文中，犹如每一单独出版物或专利被具体地和单独地表明通过引用方式并入，且通过引用并入本文的目的是公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用均是针对其在申请日之前公开的内容，并且不应将其解释为承认由于之前的发明使得本发明无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。

需要注意的是，如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。

在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，本文所描述和列出的每个单独的实施例都具有分层的组分和特征，这些组分和特征可在不脱离本发明的范围和精神的情况下与其他几个实施例中任一实施例的特征进行快速分解或合并。可按陈述的事件顺序或逻辑上可能的任何其他顺序实施任何陈述的方法。

尽管为了语法的流畅性已经或将要描述该设备和方法，并进行功能上的说明，但应明确理解，除非《美国法典》第35章有明确规定，否则任何情况下都不得将权利要求解释为必须受“方式”或“步骤”的限制，而应按照等效物的司法原则与权利要求中所述定义的含义和等效物的完整范围相符，当明确按照《美国法典》第35章第112节的规定编写权利要求时，权利要求应与《美国法典》第35章第112节中的法定等效物完全相符。

在进一步描述本发明时，还描述了用于与目的分子偶联的窄发射荧光团染料。接下来，更为详细地描述了包括此类作为侧基的窄发射受体荧光团的聚合物串联染料。接下来，描述了包括标的聚合染料的已标记的特异性结合成员。然后，描述了采用两种或更多种聚合物串联染料实现的多色荧光信号生成。还综述了在其中使用标的聚合染料的目的方法。此外，还描述了可用于实施本发明所述的方法的系统和试剂盒。

窄发射荧光团染料

荧光检测依赖于激发源和信号检测器。如果所述检测器收集到来自所述激发源的某些光，则可能会产生错误信号。当所述发射信号为激光诱导荧光时，所述激发光源的强度能使其在所述检测器处引入背景信号，所述背景信号明显高于来自所述荧光团本身的荧光发射信号。适用于激光诱导系统(例如光电倍增管)的检测器由于其高灵敏度，可能会在受到激光源照射时出现损坏。因此，在激光诱导检测系统中，所述激发波长相对于所述检测器收集发射光的波长移动最小光谱空间。例如，在流式细胞术中，激发波长与发射波长检测值之间的最小差异可以是10nm或更大。

如上所述，本发明提供了窄发射荧光团以及包括作为侧基受体基团的所述窄发射受体荧光团的聚合物串联染料。在一些情况下，窄发射光谱是具有半峰全宽(FWHM)为35nm或更小，例如25nm或更小、20nm或更小、15nm或更小、12nm或更小、10nm或更小的发射峰的发射光谱，例如，在乙醇或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中测得的光谱。

标的窄发射荧光染料可能具有小斯托克斯位移。斯托克斯位移是特定荧光染料的最大吸收量与最大发射量之间的波长或频率差异。小斯托克斯位移约为10nm或更小，例如10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm或甚至更小。由于吸收极大值与发射极大值之间的差异较小，可能难以有效激发染料并收集荧光。

本发明的方面包括窄发射荧光染料以及包括所述发射荧光染料的聚合物串联染料。标的窄发射荧光染料具有窄发射光谱，所述光谱以多路复用信号格式使用时，可以提供重要优势。由于所述窄发射光谱，相较于基于广谱发射器的多路复用系统，可以在相同的光谱范围内同时组合并使用更多数量的染料。通过使适用于每种染料的检测窗口保持较小尺寸，可以在多重分析中包括多个较小的发射范围，从而使在给定系统中观察到的独立荧光信号数量增加。

示例性窄发射荧光染料的吸收光谱和发射光谱请见图4。所述染料的窄发射使其适合在窄检测窗口中进行有效的信号收集，因此可以进行多重分析，但小斯托克斯位移可能使具有良好信号通量、可实现最大程度的激发和检测的染料变得难以激发和检测。请注意，在图4所示的发射光谱中，未收集位于发射极大值的蓝色侧的发射数据。这是因为检测器波长接近光源的激发波长。此问题的示例是在激光诱导荧光中用作流式细胞术的信号。由于在一些情况下，激发与发射之间的最小安全差异为10nm，因此，如果染料在其吸收极大值条件下被激发，则不会收集到许多来自具有小斯托克斯位移(例如，如本文所定义)的窄发射染料的信号。

标的窄发射荧光染料可以用作具有供体的FRET受体，其吸收波长与所述受体染料的最大发射波长相差较大，从而提供了能够进行离散激发和发射检测以及最大信号收集的系统。在保持此类串联染料的窄发射光谱的同时，可以实现数十纳米至数百纳米的有效斯托克斯位移。具有小斯托克斯位移并与作为供体的聚合物捕光多发色团相应串联的示例性窄发射受体染料的光谱请见图5A-5B。单独的窄发射受体染料在PBS中表现出8nm的斯托克斯位移。包括所述窄发射受体染料供体的所述聚合物串联染料从最大吸收波长至最大发射波长表现出至少150nm的位移。本发明提供了许多不同的窄发射串联染料，所述染料均具有较大的有效斯托克斯位移。

具有窄发射光谱的任何适宜的荧光团染料都可用于本发明的串联染料中。目的窄发射受体荧光团包括但不限于荧光半导体纳米晶体、量子点和小分子荧光团。用于本发明的方面的窄发射荧光团的光谱的半峰全宽(FWHM)可以为35nm或更小，例如30nm或更小、25nm或更小、20nm或更小、15nm或更小或10nm或更小。在某些情况下，窄发射荧光团的所述FWHM为25nm或更小。在某些情况下，直接激发所述荧光团时，可测量所述窄发射荧光团的所述FWHM。在一些情况下，诸如通过聚合物供体染料间接激发所述荧光团时，可测量所述窄发射荧光团的所述FWHM。

在一些情况下，具有窄发射光谱的所述小分子荧光团是BODIPY染料。在一些情况下，BODIPY染料是一类具有适用于多路复用应用的窄发射光谱的染料。但是此类染料的小斯托克斯位移可以抵消窄发射的优势，并降低此类染料的实用性。本发明提供了介于聚合物供体染料和窄发射染料之间的串联染料，所述串联染料在窄光谱发射窗口内具有较大的有效斯托克斯位移和较高的信号通量。在一些情况下，常规BODIPY染料的溶解度较低，这使其不适合用作受体，例如，与常规蛋白结合使用。任何适宜的BODIPY染料都可适用于标的染料和聚合物串联染料。目的BODIPY染料包括但不限于以下出版物中所述的染料：Loudet和Burgess(“BODIPY染料及其衍生物：合成和光谱性质，”化学评论，2007，107，4891–4932)；或Suzuki等人，第8,193,350号美国专利；Ulrich等人，第8,476,461号美国专利；以及Ulrich等人，第7,897,786号美国专利，所述出版物中的内容以引用方式全文并入本文中。

本发明的方面包括适于与目的分子连接的BODIPY染料(包括水溶性基团、BODIPY染料前体和BODIPY染料试剂)；以及包括所述BODIPY染料的聚合物串联染料。在一些情况下，标的BODIPY染料被基团或取代基取代，所述基团或取代基包括促使所述BODIPY染料与诸如聚合物供体染料等目的分子共轭的化学选择性官能团。应当理解，对于本文所述的任何BODIPY染料(例如，式(I)-(IXa)所示的染料)，本发明包括不与聚合染料骨架共轭的新型BODIPY染料及其BODIPY染料试剂衍生物(包括化学选择性官能团)。此类染料和染料试剂可用于各种环境中。目的BODIPY染料试剂可与任何适宜的目的分子(例如，适用于诸如聚合染料等第二染料的生物分子)共轭。因此，本发明还包括聚合物串联染料，其包括本文所述的已连接的BODIPY染料(例如，包括式(I)-(IXa)中其中一项所示染料的聚合物串联染料)。

在某些实施例中，所述BODIPY染料的结构式如式(I)所示：

其中：

Q是C或N；

R

任选地，选自R

L

Z

Y

其中Y

在式(I)中，所述取代基对R

其中：

Z

每个“i”均独立地为0-3；以及

每个R

在式(IIa)-(IIb)的某些实施例中，Z

其中：

X是O或S；

Y是O、S或NR，其中R是H、烷基、被取代的烷基或针对式(IIa)-(IIb)中的R

R

在式(IIb)的某些情况下，Z

在式(IIb)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

在式(IIa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构式如式(IIIa)或式(IIIb)所示：

其中：

X是O或S；以及

R

在式(IIIa)或(IIIb)的某些情况下，R

在式(I)或(IIb)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构式如式(IVa)或(IVb)所示：

其中：

每个X均是O或S；以及

R

在式(I)-(IVb)的某些实施例中，所述BOBIPY染料包括已连接的化学选择性官能团或目的分子，例如，捕光多发色团(例如，–L

在一些情况下，R

在式(I)-(IVb)的某些情况下，R

在式(I)的某些情况下，所述BODIPY染料的结构式如式(V)所示：

其中：

L

R

每个R

在式(V)的某些情况下，所述BODIPY染料的结构式如式(Va)所示：

其中：R

在式(V)的某些情况下，所述BODIPY染料的结构式如式(VIa)或(VIb)所示：

其中：

*是键合所述捕光多发色团的重复单元或化学选择性官能团的键合点；以及

Y

在式(I)的某些情况下，所述BODIPY染料的结构式如式(VIIa)或(VIIb)所示：

其中：n是0-12，Z

在式(VIIa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

在式(IIIa)的某些情况下，所述BODIPY染料的结构式如式(VIII)所示：

其中：L

其中：L2是连接子(例如，L

在式(IVa)的某些情况下，所述BODIPY染料的结构式如式(IX)所示：

其中：R

其中：L2是连接子(例如，L

在本文所述的式(I)-(IXa)的任一实施例中，所述BODIPY染料可以包括以下实施例中其中一项所述的特定–L

L

Z

在式(IXa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

在式(I)-(IVb)中的-L

在式(I)-(IXa)的一些实施例中，L

其中：

R

L

t是0-4；以及每个R

其中：

L

t是0-4；以及每个R

其中：

L

R

L

t是0-4；以及每个R

在本文所述的式(I)-(IXa)的任一实施例中，所述BODIPY染料可以包括以下实施例中其中一项所述的特定Y

在式(I)-(IXa)的一些情况下，Y

其中：

s是1至12；

q是0至50；以及

R

在式(I)和(VIIa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

其中Z

在式(V)和(Va)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

其中Z

在式(VIII)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

其中Z

在式(IX)-(IXa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

其中Z

在式(IIIa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

在式(IVa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如下：

在式(IXa)的某些实施例中，所述BODIPY染料的结构如以下结构中其中一项所示：

本文中使用的术语“水增溶性基团”、“水溶性基团”和WSG可互换使用，是指在水相环境中(例如，在生理条件下)有效溶剂化且能使其所附接的分子的水溶性提高的基团或取代基。在一些实施例中，与无WSG的对照多发色团相比，WSG可提高多发色团在主要水溶液中的溶解度。水溶性基团可以是在水相环境中有效溶剂化的任何适宜的亲水基团。

水溶性基团可以在任何适宜的位置附接于共聚单体和/或窄发射荧光团(例如，如本文所述)。在一些情况下，所述WSG提供侧链基团，所述侧链基团向远离所述共轭聚合物的骨架的方向突出，以在水相环境中发挥高度溶剂化作用。在一些情况下，所述WSG是包含两种或更多种水溶性聚合物的分支状非离子水溶性基团(WSG)，每种所述聚合物具有6-100，例如6-50、6-40或6-30个单体单元。在一些情况下，所述WSG是分支状非离子水溶性基团。

本发明的水溶性聚合物串联染料可在水相环境中溶解，这使其特别适用于各种生物测定。标的水溶性聚合物及其共轭物可以抵抗不合需求的聚合，这可以在各种生物测定中产生有利的荧光和光谱特性。染料聚合是不合需求的，因为这可能导致荧光信号减少，例如，聚合引起的染料荧光猝灭。标的水溶性共轭聚合物染料可用作各种生物传感器的荧光报告分子，并提供异常亮度信号以及适用于各种应用(例如，流式细胞术和成像)的一系列激发和发射波长选项。

在某些情况下，水溶性聚合物串联染料在水或缓冲液中的溶解度为1mg/mL或更高，例如，3mg/mL或更高、10mg/mL或更高、20mg/mL或更高、30mg/mL或更高、40mg/mL或更高、50mg/mL或更高、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/mL或更高、90mg/mL或更高、100mg/mL或更高，甚至更高。应当理解，在某些条件下，水溶性聚合染料可以在水性体系中形成离散的水溶剂化纳米颗粒。在某些情况下，所述水溶剂化纳米颗粒具有抗聚合性，可用于各种生物测定中。

分支状非离子水溶性基团(WSG)包含与其所附接的所述共聚单体连接的分支型基团，并且进一步与两种、三种或更多种非离子水溶性聚合物键合。在一些情况下，在所述WSG中使用的所述两种或更多种水溶性聚合物是聚乙二醇(PEG)基团或经修饰的PEG基团。可以利用提供3个或更多个附接点(例如，4个或更多)的任何适宜的分支型基团，例如附接于所述共轭聚合物骨架的所述共聚单体的一个附接点，以及附接于非离子水溶性聚合物的两个或更多个附接点(例如，2个、3个、4个或更多)。所述分支型基团可以利用任何适宜的连接官能团和连接化学方法，通过任选的连接子附接于所述共聚单体和所述非离子水溶性聚合物上。在某些情况下，所述分支型基团是非芳族基团。在某些情况下，所述分支型基团是环状基团。在一些情况下，所述分支型基团是被取代的芳基或杂芳基环，例如，三取代或四取代的芳基环，例如三取代或四取代的苯环，或者三取代或四取代的杂芳基环，例如三取代或四取代的吡啶基环。在某些情况下，所述分支型基团是非环状基团。在一些情况下，所述分支型基团是原子，例如，C、Si、N。在某些情况下，所述分支型基团是连接官能团，例如酰胺基或磺酰胺基团。在某些情况下，所述分支型基团是氨基酸残基或分支状连接子，例如甘油或氨基甘油。

目的水溶性聚合物包括但不限于基于聚亚烷基氧化物的聚合物，例如，聚乙二醇(PEG)(请参见，例如，“聚(乙二醇)化学物质：生物技术和生物医学应用”，J.M.Harris，编者，Plenum Press，纽约州纽约市(1992年)；聚(乙二醇)化学和生物学应用，J.M.Harris和S.Zalipsky，编者，ACS(1997年)；国际专利申请案：WO 90/13540、WO 92/00748、WO 92/16555、WO 94/04193,WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28937、WO 95/11924、WO 96/00080、WO 96/23794、WO 98/07713、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/30727、WO 99/32134、WO 99/33483、WO 99/53951、WO 01/26692、WO 95/13312、WO 96/21469、WO 97/03106、WO 99/45964；以及编号如下的美国专利：4,179,337；5,075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455,027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614,549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127,355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966)。

目的水溶性聚合物的示例包括但不限于含有聚亚烷基氧化物、聚酰胺亚烷基氧化物或其衍生物的水溶性聚合物，包括包含所述式-(CH

本文中使用的术语“经修饰的聚合物”(例如，经修饰的PEG)，是指在任一末端或两个末端进行了修饰或衍生化的水溶性聚合物，例如，包括末端取代基(例如，末端烷基、被取代的烷基、烷氧基或被取代的烷氧基等)和/或末端连接官能团(例如，适于通过酰胺键形成而附接的氨基或羧酸基团)，其适于使所述聚合物附接于所述多发色团上(例如，通过分支型基团实现)。所述标的水溶性聚合物适于包括任何适宜的连接基团。

应当理解，在一些情况下，基于所述聚合物起始物料的制备和/或纯化方法，所述水溶性聚合物相对于聚合物长度可以具有一定的分散性。在一些情况下，标的水溶性聚合物是单分散的。在一些情况下，标的水溶性聚合物是基本上单分散的，例如，包括20wt％或更少的非目标物种，例如15wt％或更少、10wt％或更少、5wt％或更少、2wt％或更少或1wt％或更少。

所述水溶性聚合物可以包括一个或更多个间隔基或连接子。间隔基或连接子的示例包括直链状或分支状部分(其包含在水溶性聚合物中使用的一个或更多个重复单元、二氨基和/或二酸单元、天然或非天然氨基酸或其衍生物)以及脂肪族部分(其包括烷基、芳基、杂烷基、杂芳基、烷氧基等，其可以包含，例如，至多18个碳原子或甚至其他聚合物链)。

所述水溶性聚合物部分或所述聚合物部分的一个或更多个间隔基或连接子(如有)可以包括具有生物稳定性或可生物降解的聚合物链或单元。例如，基于键的不稳定性，具有重复键的聚合物在生理条件下具有不同程度的稳定性。具有所述键的聚合物可以基于低分子量类似物的已知水解速率，按照其在生理条件下的相对水解速率进行分类，例如，从较不稳定至较为稳定，例如，聚氨酯(-NH-C(O)-O-)>聚原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)>聚酰胺(-C(O)-NH-)。类似地，使水溶性聚合物附接在靶分子上的键合体系可以是生物稳定的或可生物降解的，例如，从较不稳定至较为稳定：碳酸盐(-O-C(O)-O-)>酯(-C(O)-O-)>尿烷(-NH-C(O)-O-)>原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)>酰胺(-C(O)-NH-)。通常情况下，基于硫酸根基团的不稳定性，可能需要避免使用硫酸化多糖。此外，可能不太需要使用聚碳酸酯和聚酯。所述键是作为示例提供的，其无意限制可用于本发明所揭示的经修饰的醛标记多肽中的水溶性聚合物的聚合物链或键合体系中的键的类型。

在一些情况下，所述分支状非离子WSG独立地选自以下各项：-Y

在一些情况下，所述分支状非离子WSG的结构式如以下式中其中一项所示：

其中：

每个B

每个W

T

每个p和q均独立地为0或1，其中每个T

在一些情况下，所述分支状非离子WSG的结构式如下所示：

其中：

每个B

每个W

T

每个p均独立地为0或1，其中每个T

在所述分支状非离子WSG的一些实施例中(例如，如上式所示)，B

在一些实施例中，所述分支状非离子WSG的结构选自以下结构中的其中一项：

其中：

T

T

每个s均独立地为介于6至100(例如，6或50)之间的整数；以及

每个R

在某些情况下，每个s均独立地为6至30，例如，6至24、6至20、11至20、12至20、12至18或12至16。在某些情况下，每个s均独立地为6至30，例如，6至24、8至24、10至24、12至24、13至24、14至24、15至22或16至20。在一些情况下，每个s均独立地为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24。在一些实施例中，每个s均独立地为7或更大，例如，8、9或更大、10或更大、11或更大、12或更大、13或更大、14或更大、15或更大，甚至更大，而且在一些情况下，至多具有50个单体单元，例如，至多40个、至多30个或至多24个单体单元。在一些情况下，每个s均独立地为6-30个单体单元，例如，6-24或10-30、10-24或10-20、12-24、12-20、12-16或16-20个单体单元。在一些情况下，每个s均相同。在所述分支型非离子WSG的一些实施例中，T

任何适宜的水增溶性基团(WSG)均可包括在本文所述的聚合物串联染料中，以提高水溶性。虽然溶解度的增加量可能有所不同，但是在一些情况下，所述增加量(与无WSG的化合物相比)可以达到2倍或以上，例如，5倍、10倍、25倍、50倍、100倍或以上。在一些情况下，亲水水增溶性基团带电，例如，带正电或带负电。在某些情况下，亲水水增溶性基团是中性亲水基团。在一些实施例中，WSG是分支状的(例如，如本文所述)。在某些情况下，WSG是直链状的。在一些实施例中，WSG是亲水聚合物，例如，聚乙二醇、经修饰的PEG、肽序列、类肽、碳水化合物、恶唑啉、多元醇、树突、树状聚甘油、纤维素、壳聚糖或其衍生物。目的水增溶性基团包括但不限于羧酸根、膦酸根、磷酸根、磺酸根、硫酸根、亚磺酸根、锍、酯类、聚乙二醇(PEG)和经修饰的PEG、羟基、胺、氨基酸、铵基、胍基、吡啶盐、聚胺和锍、多元醇、直链状或环状糖类、伯胺、仲胺、叔胺或季胺和聚胺、膦酸酯基、次膦酸酯基、抗坏血酸酯基、乙二醇，包括聚醚、-COOM′、-SO

在所述式的一些实施例中，所述共聚单体包括选自(CH

多个WSG可以通过分支型连接子包括在标的聚合物串联染料的单个位置中。在某些实施例中，所述分支型连接子是芳烷基取代基，其进一步被水增溶性基团二取代。因此，在一些情况下，所述分支型连接子基团是使所述多发色团与两个或更多个水增溶性基团连接的所述多发色团的取代基。在某些实施例中，所述分支型连接子是氨基酸，例如，赖氨酸氨基酸，其通过氨基和羧酸基团与三个基团连接。在一些情况下，多个WSG通过分支型连接子引入后，可使所述多发色团达到所需溶解度。在一些情况下，所述WSG是能使水中溶解度超过50mg/mL的非离子侧链基团。在一些情况下，所述WSG是能使水中溶解度超过100mg/mL的非离子侧链基团。在一些实施例中，所述多发色团包括选自由烷基、芳烷基和杂环基团组成的群组的取代基，每个基团还进一步被包括水增溶性基团的亲水聚合物基团取代，例如，聚乙二醇(PEG)(例如，含2至20个单位的PEG基团)。

在本文所述的任一式的某些情况下，一种或更多种所述共聚单体被WSG和/或已连接的信号传导发色团取代。任何适宜的WSG都可适于包括在标的聚合染料的共聚单体中。在本文所述的任一式的某些情况下，一种或更多种所述共聚单体被WSG取代，所述WSG独立地选自以下结构中的其中一项：

其中：每个R

在本文所述的任一式的某些情况下，一种或更多种所述共聚单体被WSG取代，所述WSG独立地选自以下结构中的其中一项：

其中：T

在本文所述的任一式的某些情况下，一种或更多种所述共聚单体被WSG取代，所述WSG是结构选自以下结构中其中一项的多元醇：

在本文所述的任一式的某些情况下，一种或更多种所述共聚单体被WSG取代，所述WSG是结构如下的恶唑啉：

在本文所述的任一式的某些情况下，一种或更多种所述共聚单体被WSG取代，所述WSG是结构选自以下结构中其中一项的类肽：

聚合物串联染料

标的聚合物串联染料包括水溶性捕光多发色团以及经配置在能量接收时接近所述多发色团的窄发射受体荧光团。所述窄发射受体荧光团可以作为所述多发色团的侧基进行连接。术语“侧基”是指与所述多发色团的骨架连接但不属于所述共轭聚合物骨架任一部分的侧链基团。所述侧基窄发射受体荧光团不会彼此发生π共轭，也不会与所述水溶性捕光多发色团形成离域π电子体系。

本发明提供了可以用窄发射受体染料实现高信号通量的聚合物串联染料，同时提供了在远离所述激发源的窄光谱窗口中显示荧光的高信号染料。通过移动所述激发波长，可以在所述激发极大值下激发所述串联染料，并且或有可能收集到所有发射峰。此体系还提供了多路复用的主要优势。通过利用具有极窄发射的染料，可以在给定光谱范围内使用更多的串联染料，其中所有染料共用单一激发波长。例如，图9展示了在多路复用系统中5种示例性串联染料的发射光谱。图9中所示的所有串联染料的发射信号的FWHM为25nm或更小，并提供与相同紫色光可激发的供体聚合染料不重叠的波长范围。这些串联染料表现出的有效斯托克斯位移为100至250nm。421nm处的所述小峰是源自于所述供体的残余发射。

在一些情况下，用入射光直接激发所述捕光多发色团时，所述聚合物串联染料表现出的有效斯托克斯位移为100nm或更大，例如110nm或更大、120nm或更大、130nm或更大、140nm或更大、150nm或更大、160nm或更大、170nm或更大、180nm或更大、190nm或更大、200nm或更大、250nm或更大。在一些情况下，所述聚合物串联染料的所述有效斯托克斯位移至多约为300nm，例如100-300nm、100-250nm或100-200nm。

所述水溶性捕光多发色团本身可以是荧光，并且能够将能量转移至与所述多发色团骨架的特定重复单元连接的窄发射受体荧光团。因此，所述多发色团供体的激发可使能量转移至共价连接的窄发射受体荧光团或使所述荧光团发射能量。与所述供体水溶剂化捕光多发色团连接的窄发射受体荧光团的数量可能有所不同，其中在一些情况下，所述数量范围为1mol％至50mol％，例如5mol％至25mol％或10mol％至25mol％，例如，通过具有已连接的侧基窄发射受体荧光团的重复单元的数目进行测量。

将能量从所述荧光水溶剂化捕光多发色团供体转移至所述已连接的窄发射受体荧光团的机制包括，例如，共振能量转移(例如，

“有效的”能量转移是指由所述供体捕获并转移给所述受体的能量的10％或更高，例如，20％或更高或30％或更高。“放大”是指，与用等效强度的入射光直接激发的情况相比，通过来自所述供体捕光多发色团的能量转移激发的所述窄发射受体荧光团发射的信号高出1.5倍或更多。所述信号可以采用任何适宜的方法来测定。在一些情况下，所述1.5倍或更多的信号是指发射光的强度。在某些情况下，所述1.5倍或更多的信号是指增加的信噪比。在所述聚合物串联染料的某些实施例中，与用入射光直接激发所述窄发射受体荧光团的情况相比，通过所述多发色团激发的所述信号传导荧光团发射高出1.5倍或更多，例如，与用入射光直接激发所述窄发射受体荧光团的情况相比，高出2倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、6倍或更多、8倍或更多、10倍或更多、20倍或更多、50倍或更多、100倍或更多，甚至更高。

所述聚合物串联染料发射的量子产率为0.03或更多，例如，量子产率为0.04或更多、0.05或更多、0.06或更多、0.07或更多、0.08或更多、0.09或更多、0.1或更多、0.15或更多、0.2或更多、0.3或更多，甚至更多。在一些情况下，所述聚合物串联染料的消光系数为5×10

标的聚合物串联染料提供来自窄发射受体发色团的荧光发射，所述荧光发射的亮度相较于可能来自分离的此类荧光染料的发射更高。所述聚合物串联染料发射的亮度为50mM

本文中使用的术语“捕光多发色团”、“聚合染料”和“共轭聚合物”可互换使用，是指具有能够捕获具有特定最大吸收波长的光并将其转换为具有更长的最大发射波长的发射光的结构的共轭聚合物。在一些情况下，所述捕光多发色团本身是荧光。共轭聚合物(CP)的特征在于离域电子结构，并且其有效共轭长度明显短于所述聚合物链的长度，因为所述骨架可能含有大量紧密相邻的共轭链段。在一些情况下，共轭聚合物能高效捕光，并通过将Forster能量转移至受体来提供光学放大作用。

本文中使用的术语“单元”是指聚合物的结构亚单元。术语“单元”旨在包括单体、共聚单体、共嵌段、共轭链段、重复单元等。“重复单元”是指聚合物的亚单元，其由被视为是单体的单元所需的最小数量的不同结构特征所定义，因此当所述单元重复n次时，由此得到的结构描述所述聚合物或其嵌段。在一些情况下，所述聚合物可以包括两个或更多个不同的重复单元，例如，当所述聚合物为多嵌段聚合物或无规则排列单元时，每个嵌段均可定义不同的重复单元，例如，n-嵌段和m-嵌段。应当理解，n个和/或m个重复单元或嵌段可能出现各种各样的排列形式，而且在本文所述的标的多发色团的所示式中，以任何适宜的线性方式排列的n个和m个各种长度的共嵌段都可以包括在整个聚合物的结构中。应当理解，就每个单元的mol％值而言，所述聚合物也可以用式表示，而且此类式可以表示重复单元的各种排列形式，例如，无规或多嵌段聚合物。在一些情况下，所述聚合物的重复单元包括单个单体基团。在某些情况下，所述聚合物的重复单元包括两个或更多个单体基团，即共聚单体基团，例如，两个、三个、四个或更多个共聚单体基团。本文中使用的术语“共聚单体”或“共聚单体基团”是指聚合物的结构单元，其本身可以是聚合物重复单元的一部分。在一些实施例中，所述共轭聚合物包括由聚合单体的嵌段组成的嵌段共聚物。在此类情况下，所述嵌段共聚物可被描述为具有不同的重复单元，每个重复单元对应于所述聚合物的不同共嵌段。在一些情况下，所述聚合物是含有两个不同共嵌段的二嵌段共聚物。在此类情况下，所述聚合物可被描述为包括共嵌段，其中每个共嵌段可以由共聚单体(例如一种、两种、三种或更多种共聚单体)组成。

所述多发色团可以具有任何适宜的长度。在一些情况下，所述多发色团的单体重复单元或链段的具体数目范围可以是2至500,000，例如2至100,000、2至30,000、2至10,000、2至3,000或2至1,000个单元或链段，或者例如5至100,000、10至100,000、100至100,000、200至100,000或500至50,000个单元或链段。在一些情况下，所述多发色团的单体重复单元或链段的具体数目范围可以是2至1,000，例如2至500、2至100、3至100、4至100、5至100、6至100、7至100、8至100、9至100或10至100个单元或链段。

所述多发色团可以具有任何适宜的分子量(MW)。在一些情况下，所述多发色团的MW可以表示为平均分子量。在一些情况下，所述聚合染料的平均分子量范围是500至500,000，例如，1,000至100,000、2,000至100,000、10,000至100,000，甚至平均分子量范围达到50,000至100,000。

在一些实施例中，所述多发色团包括特定芳基或杂芳基共聚单体，所述特定芳基或杂芳基共聚单体在所述多发色团中所占的摩尔百分比为5％或更高(例如5mol％)，例如在所述多发色团中所占的摩尔百分比为10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高，甚至更高。在此类情况下，所述多发色团可以包括5个或更多个重复单元，例如10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多、80个或更多、90个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多、10,000个或更多，甚至更多个重复单元。在此类情况下，所述多发色团可以包括5个或更多个共聚单体单元，例如10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多、80个或更多、90个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多、10,000个或更多，甚至更多个共聚单体单元。在某些实施例中，目的芳基或杂芳基共聚单体在所述多发色团中所占的摩尔百分比为25％或更高，例如在所述多发色团中所占的摩尔百分比为30％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高，甚至更高，所述多发色团包括5个或更多个重复单元，例如10个或更多、20个或更多、30个或更多、40个或更多、50个或更多、60个或更多、70个或更多、80个或更多、90个或更多、100个或更多个重复单元。

在一些实施例中，所述多发色团包括形成共轭体系的多个第一光学活性单元，其具有所述第一光学活性单元在其下吸收光以变为激发态的吸收波长(例如，如本文所述)。在某些情况下，所述多发色团包括共轭聚合物链段或低聚物结构，其包括带隙降低的n-共轭重复单元。

标的多发色团可以具有一种或更多种所需的光谱性质，例如特定最大吸收波长、特定最大发射波长、消光系数、量子产率等。标的聚合物串联染料提供了各种吸收和发射谱，其取决于各种因素，例如所选定的组成所述聚合物串联染料的共聚单体、连接基团、取代基和已连接的窄发射受体荧光团。在一些情况下，所述聚合染料的最大吸收波长范围为300至600nm，例如350nm至560nm或400nm至560nm。在某些实施例中，所述多发色团的最大吸收波长为600nm或更小，例如575nm或更小、550nm或更小、525nm或更小、500nm或更小、475nm或更小、450nm或更小、440nm或更小、430nm或更小、420nm或更小、410nm或更小、400nm或更小，甚至更小。在某些实施例中，所述多发色团仅吸收紫外光。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为300nm至400nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为300nm至350nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为350nm至400nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为400nm至600nm，例如400nm至560nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为400nm至450nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为450nm至500nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为500nm至550nm。在某些情况下，所述多发色团的最大吸收波长范围为550nm至600nm。

在一些实施例中，所述多发色团的最大发射波长范围为300至900nm，例如，350至850nm、350至600nm、360至500nm、370至500nm、380至500nm、390至500nm或400至500nm，其中目的发射极大值的具体示例包括但不限于：395nm±5nm、460nm±5nm、490nm±5nm、550nm±5nm、560nm±5nm、605nm±5nm、650nm±5nm、680nm±5nm、700nm±5nm、805nm±5nm。在某些情况下，所述多发色团的最大发射波长选自由395nm、460nm、490nm、550nm、560nm、605nm、650nm、680nm、700nm和805nm组成的群组。在某些情况下，所述多发色团的最大发射波长为395nm±5nm。在一些情况下，所述多发色团本身的最大发射波长范围为375至900nm(例如范围为380nm至900nm、390nm至900nm或400nm至900nm)。

在一些情况下，所述多发色团的消光系数为5×10

在一些情况下，所述多发色团的消光系数为40,000cm

应当理解，在一些情况下，标的多发色团可以包括共嵌段(例如，n和m-共嵌段)或无规则排列的n个和m个重复单元。标的多发色团可以在整个聚合物的结构内包括以任何适宜的线性方式排列的n个和m个各种长度的共嵌段。在一些情况下，本文所述结构中描述的共聚单体的所述线性排列是无规则的。另外，所述多发色团可以包括在此类n个和/或m个共嵌段内以任何适宜的方式排列的共聚单体。除非另有相反规定，否则以所有潜在方式排列的共聚单体意在包括在本文所述的聚合染料中。在制备标的多发色团时，可以利用各种聚合物合成方法来制备目的共聚单体和共嵌段。应当理解，在一些情况下，所述聚合方法可以生成包括共轭聚合物群体的组合物，所述共轭聚合物群体包括相对于所述特定长度和/或所述群体的每种共轭聚合物中存在的端基(即，末端基)的一些变化。本文所述的式可指单一化合物或聚合物群体或亚群体。本文中使用的*表示用于共价连接至共轭聚合物的不饱和骨架的位点。应当理解，本文所述的标的聚合物的式是所述结构的一种表示，并且也可以使用其他表示方式，例如指示所述共轭聚合物链段中特定共聚单体的mol％比值的表示方式。

任何适宜的水溶性捕光多发色团可适于包括侧基窄发射受体荧光团(例如，如本文所述)。目的多发色团包括但不限于WO2016/144653、WO2018/013389、WO2018/009581、WO2018/111774、US2017/0247504、WO2017/180998、WO2018/009861和US9,896,538中所述的多发色团，这些出版物中的内容以引用方式全文并入本文。在一些情况下，所述聚合物串联染料包括多发色团，所述多发色团包括结构如式(XI)所示的共轭链段：

其中：

F

M

n是介于1至100,000之间的整数；以及

*表示用于共价连接至共轭聚合物的不饱和骨架或末端基的位点；以及

与在能量接收时接近的所述多发色团连接的窄发射受体荧光团。在某些情况下，所述聚合物串联染料的水溶性基团(WSG)可使所述多发色团的水中溶解度(例如，在水性缓冲液中的溶解度)达到10mg/mL或更高，例如20mg/mL或更高、30mg/mL或更高、40mg/mL或更高、50mg/mL或更高、60mg/mL或更高、70mg/mL或更高、80mg/mL或更高、90mg/mL或更高、100mg/mL或更高，甚至更高。

目的芳基或杂芳基共聚单体包括但不限于稠合三环共聚单体，例如芴共聚单体、咔唑共聚单体、噻咯共聚单体或桥联联苯共聚单体。稠合三环共聚单体是包括三环芳族基(在构型中具有三个稠合环)的共聚单体，其中两个芳基或杂芳基6元环与中心5或6元碳环或杂环稠合。在一些情况下，所述稠合三环共聚单体包括两个与中心5或6元碳环或杂环稠合的苯并或吡啶并环。所述稠合三环共聚单体可以通过所述稠合环上任何适宜的环原子与聚合物骨架中相邻的共聚单体进行π共轭。所述中心5或6元环可以是芳族或部分饱和的碳环或杂环，且可以进一步包括侧链取代基，例如，WSG和/或连接化学选择性标签的连接子。桥联联苯共聚单体是具有联苯基团的稠合三环共聚单体，其中所述两个苯环通过中心6元环彼此进一步连接。在某些情况下，所述稠合三环共聚单体的结构如以下结构所示：

其中：

Y

每个Z均独立地为CH、CR

每个R

每个R

*表示用于共价连接至共轭聚合物的不饱和骨架或末端基的位点。在某些情况下，每个环中至少有两个Z是CH或CR

在某些情况下，所述稠合三环共聚单体的结构如以下结构中其中一项所示：

其中：

Y是C(R

每个R

每个R均独立地为H、R

在某些实施例中，所述稠合三环共聚单体选自：

其中：

Y

每个R

在所述稠合三环共聚单体的某些实施例中，所述共聚单体包括两个R取代基，其连接成环状结构，以提供任选地被进一步取代的碳环或杂环A：

其中Y是C(R

其中每个R

在某些情况下，所述稠合三环共聚单体的结构如以下结构中其中一项所示：

其中：

每个R

每个R均独立地为H、R

在某些情况下，所述稠合三环共聚单体的结构如以下结构所示：

其中每个WSG是分支状或直链状水溶性基团，并且每个R

其中T

稠合6-5-6三环共聚单体是包括三环芳族基(在构型6-5-6中具有三个稠合环，即两个苯并环与中心5元环稠合)的共聚单体。所述5元环可以是碳环或杂环，并且可以在不与苯并环稠合的所述环原子上进一步包括侧链取代基。在某些情况下，所述稠合6-5-6三环共聚单体的结构如以下结构所示：

其中：Z是–C(R

芴共聚单体是包括具有9H-芴核结构的芳族基的共聚单体，所述芳族基在9位被任何适宜的侧链取代基取代。在一些情况下，所述芴共聚单体是9,9-二取代基芴。所述芴共聚单体通过所述芴核结构的任何适宜的位置，例如位置1-8中的任意两个位置(请参见以下编号方案)，与聚合物骨架的相邻基团共轭。在一些实施例中，所述芴核结构通过所述2和7位与所述聚合物骨架的相邻基团连接。在某些实施例中，所述芴共聚单体的结构如以下结构所示：

其中：每个R

在某些情况下，所述芴共聚单体的结构如以下结构所示：

其中：每个R

在一些情况下，所述芴共聚单体的结构如以下结构所示：

其中每个R

在某些实施例中，所述芴共聚单体的结构如以下结构所示：

其中R

其中：R

R

本文所述的任何芴共聚单体均可用于标的多发色团中，例如，式(XI)-(XIV)所示的多发色团。在一些情况下，所述多发色团包括以下结构中的其中一项作为所述聚合物骨架的一部分：

其中每个R

在式(XI)的某些情况下，F

其中：Z是–C(R

在式(XI)的某些情况下，F

其中：Z是–C(R

在式(XI)的一些实施例中，F

在式(I)的一些实施例中，F

其中s是6-60；

t是0-10(例如，0-6，例如0、1、2或3)；

R

在式(I)的一些实施例中，F

在式(I)的一些实施例中，n为5或更大，例如，10或更大、30或更大、100或更大、300或更大、1000或更大、3000或更大，甚至更大。应当理解，共轭聚合物群体可以由包括相对于所述特定长度的一些变化的标的式表示。在一些情况下，所述共轭链段在所述多发色团中所占的摩尔百分比为25mol％或更高，例如，30mol％或更高、40mol％或更高、50mol％或更高、60mol％或更高、70mol％或更高、80mol％或更高或90mol％或更高。

在式(XI)的一些实施例中，所述多发色团的结构如式(XII)所示：

其中：

M

Z

x和y表示所述单元在所述多发色团中的摩尔百分比；以及

G

在式(XI)-(XII)的一些实施例中，所述聚合染料的结构如式(XIIa)所示：

其中F

在一些实施例中，所述聚合染料的结构如式(XIIb)所示：

其中u、v、w、x、y和z表示每种共聚单体在所述多发色团中所占的mol％值；Y

在式(XIIb)的一些情况下，u为5％或更高，例如10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高，甚至更高。在式(IIb)的一些情况下，w为5％或更高，例如10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高，甚至更高。在式(XIIb)的一些情况下，y为1％或更高，例如2％或更高、5％或更高、10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、75％或更高、80％或更高、85％或更高、90％或更高，甚至更高。在式(XIIb)的一些情况下，v为80％或更低，例如75％或更低、70％或更低、65％或更低、60％或更低、55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低，甚至更低。在式(XIIb)的一些情况下，x为80％或更低，例如75％或更低、70％或更低、65％或更低、60％或更低、55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低，甚至更低。在式(XIIb)的一些情况下，z为80％或更低，例如75％或更低、70％或更低、65％或更低、60％或更低、55％或更低、50％或更低、45％或更低、40％或更低、35％或更低、30％或更低、25％或更低、20％或更低、15％或更低、10％或更低，甚至更低。

在式(XI)的一些实施例中，所述多发色团的结构如式(XIII)所示：

其中：

F

M

N

a-d和f各自独立地为0或1；

e是1；

每个n和m均是介于1至10,000之间的整数；

p是介于1至100,000之间的整数；以及

G

在式(XIII)的某些实施例中，所述多发色团的结构如式(XIVa)或(XIVb)所示：

在式(XII)-(XIV)的一些情况下，L

其中：R

在L

在式(XI)-(XIV)的一些实施例中，所述聚合染料的结构如式(XV)或(XVI)所示：

其中每个WSG独立地为分支状或直链状WSG(例如，如本文所述)；Z

在式(I)-(VI)的一些实施例中，所述聚合染料的结构如式(VII)或(VIII)所示：

其中每个s均独立地为介于6至50之间的整数，例如6至30、6至20、11至20、12至20或12至16；每个R

任何适宜的共聚单体都可适于包括侧链取代基，所述侧链取代基可使所述聚合染料与目的部分(例如信号传导发色团或生物分子)共轭。任何共聚单体都可以包括使所述聚合物染料的水溶性更高的取代基。

在本文所述的任何式的一些实施例中，n、m和p的选择使得所述多发色团共计包括2至100,000个重复单元(即，单体重复单元)，其中所述多发色团可以包括各种不同的单体重复单元。在一些情况下，当m为0时，p为1，并且n为2至100,000。应当理解，本文所述的式的共轭聚合物还可以由提供每种共聚单体在所述聚合物中的mol％值的式表示。应当进一步理解，在一些情况下，所述聚合方法可以生成包括共轭聚合物群体的组合物，所述共轭聚合物群体包括相对于所述特定长度和/或所述群体的每种共轭聚合物中存在的端基(即，末端基)的一些变化。本文所述的式可指单一化合物或聚合物群体或亚群体。

如上所述，标的聚合染料包括通过共价键、亚乙烯基或亚乙炔基连接的芳基或杂芳基共聚单体的共轭链段。除上述示例性式中所述的共聚单体以外，各种芳基和杂芳基共聚单体也可用于标的聚合染料中。任何适宜的芳基和杂芳基共聚单体可用于标的多发色团中，例如，用于带隙修饰单元中，并且可沿本文所述的共轭聚合物均匀或无规分布。

在本文所述的式(例如，式(XI)-(XIV))的一些实施例中，所述芳基或杂芳基共聚单体(例如，L

其中

Cy

Y

每个R

R

Y

R

Z

T

Cy

在式(XXIII)-(XXVI)的某些实施例中，所述共聚单体(例如，M

其中：

每个Y

X为S或O；每个R

R

Z

T

在某些情况下，Y

其中Y

在式(XXIII)-(XXVI)和(a)-(x)的一些情况下，所述共聚单体(M

其中：

Y

X是S或O；

每个R

R

本文所述的芳基和杂芳基共聚单体(例如，式(XI)-(XIV)、(a)-(x)和(ba)-(cd)所示的共聚单体)可以包括水增溶性基团WSG(例如，如本文所述)。

在本文所述的式(例如，式(XI)-(XIV))的某些实施例中，所述共聚单体(例如，M

其中每个s均独立地为1至30，例如6至30，例如6至20、11至20、12至20或12至16。在某些情况下，每个s均独立地为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些情况下，每个s均为4。在一些情况下，每个s均为5。在一些情况下，每个s均为6。在一些情况下，每个s均为7。在一些情况下，每个s均为8。在一些情况下，每个s均为9。在一些情况下，每个s均为10。在一些情况下，每个s均为11。在一些情况下，每个s均为12。在一些情况下，每个s均为13。在一些情况下，每个s均为14。在一些情况下，每个s均为15。在一些情况下，每个s均为16。在一些情况下，每个s均为17。在一些情况下，每个s均为18。在一些情况下，每个s均为19。在一些情况下，每个s均为20。

在一些情况下，所述多发色团(例如，式(XI)-(XIV)所示的多发色团)包括与具有以下结构中的其中一项的信号传导发色团连接的共聚单体(例如，L

在某些实施例中，所述芳基或杂芳基共聚单体是选自2,1,3-苯并噻二唑、2,1,3-苯并恶二唑、苯并恶二唑、苯并硒二唑、苯并硫二唑、萘并硒二唑、4,7-二(噻吩-2-基)-2,1,3-苯并噻二唑、方酸菁染料、喹喔啉、苝、苝酰亚胺、吡咯并吡咯二酮、噻吩并吡嗪低带隙商业染料、烯烃和氰基取代的烯烃及其异构体。在一些情况下，可在标的多发色团中使用的芳基和杂芳基共聚单体选自结构如下的a’-m’：

其中*＝用于共价连接至不饱和骨架的位点；每个R均独立地为H、具有水溶性的非离子侧基(例如，WSG)或–L

在一些实施例中，所述多发色团包括结构如下的吸光度修正的共聚单体：

其中X是O或S，R

在一些情况下，所述芳基或杂芳基共聚单体是被取代或未被取代的苯基、联苯基或吡啶基共聚单体。在某些实施例中，所述芳基或杂芳基共聚单体选自被取代或未被取代的1,4-苯基、被取代或未被取代的1,3-苯基、被取代或未被取代的4,4'-联苯基、被取代或未被取代的2,5-吡啶基以及被取代或未被取代的2,6-吡啶基。在某些情况下，所述吸光度修正的共聚单体是结构选自以下结构中其中一项的任选被取代的芳基或杂芳基共聚单体：

其中Z

在一些情况下，所述芳基或杂芳基共聚单体选自以下各项中的其中一项：

其中n是1-20，R'是H或低级烷基。在所述芳基或杂芳基共聚单体结构的一些实施例中，n是介于6至20之间的整数，例如12-20或12-16或16-20。

在一些实施例中，所述多发色团包括如以下结构所述的被取代的芳基共聚单体：

在一些实施例中，所述多发色团包括如以下结构所述的被取代的芳基共聚单体：

其中n是1-20，R’是H或低级烷基。在某些情况下，n为3至12。在一些实施例中，所述多发色团包括如以下结构所述的被取代的芳基共聚单体：

其中每个n均为1-20，每个R'均独立地为H或低级烷基。在上述被取代的芳基或杂芳基共聚单体结构的某些实施例中，n为3。在一些情况下，n为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在某些情况下，R’是甲基。在某些情况下，R’是氢。在一些实施例中，所述多发色团包括如以下结构所述的被取代的芳基共聚单体：

在一些实施例中，所述多发色团包括如以下结构所述的被取代的芳基共聚单体：

在本文所述的任何式的一些实施例中，所述多发色团包括结构如下的被取代的芳基共聚单体(M1)：

其中s为6-50(例如，6-40、6-30或6-20)；每个R

上述任何吸光度修正的共聚单体均可用于标的多发色团中，例如，式(XI)-(XIV)所示的多发色团。

在某些实施例或本文所述的式中，例如式(XI)-(XIV)、(a)-(w)和(ba)-(cb)，包括已连接的窄发射受体荧光团(N

可以将任何适宜的连接共聚单体引入标的多发色团中，以提供可以在其上附接任何适宜的目的部分(例如，已连接的信号传导发色团)的连接基团。目的连接共聚单体包括但不限于本文式中所述的共聚单体以及芴共聚单体、亚苯基亚乙烯基共聚单体、亚苯基亚乙炔基共聚单体、咔唑共聚单体、C

在本文所述的任何式的一些情况下，所述窄发射受体荧光团(N

任何适宜的化学选择性官能团都可以包括在标的多发色团中(例如，在–Z

在一些实施例中，所选择的窄发射受体荧光团(N

任何适宜的末端基(例如，G

在本文所述的式的一些实施例中，G

*-Ar-L-Z

其中Ar是共轭的芳基基团，L是连接子，Z是化学选择性标签或特异性结合成员。在一些情况下，所述L-Z基团可与末端共聚单体直接连接。在本文所述的式的某些实施例中，G

其中：

q是0或介于1-12之间的整数；

L是任选的连接子；以及

Z是化学选择性标签或特异性结合成员。

在某些实施例中，Z是生物分子。目的生物分子包括但不限于多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、其结构类似物及其组合。在某些情况下，Z是抗体。在一些情况下，Z是抗体片段或其结合衍生物。在一些情况下，所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')

应当理解，对于本文所述的任何结构和式，在标的多发色团的一些情况下，所描绘的末端基可以位于与所示端基相对的末端，例如，可使所述末端基G

*-H

*-Br *-Cl *-I

*-SH *-B(OH)

其中r是0或介于1-50之间的整数；k是0或介于1-50之间的整数(例如，1-20)；R

在一些实施例中，所述多发色团包括一个或更多个以下基团，例如，作为末端基或侧链基团，以与另一分子上的相容官能团共轭：

本发明的方面包括已标记的特异性结合成员。已标记的特异性结合成员是标的聚合染料(例如，如本文所述)与特异性结合成员组成的共轭物。本文所述的任一聚合染料或聚合物串联染料均可与特异性结合成员共轭。所述特异性结合成员与所述聚合染料可通过任选的连接子在所述两个分子的任何适宜位置彼此共轭(例如，共价连接)。

在一些实施例中，所述已标记的特异性结合成员具有抗聚合性。本文中使用的“抗聚合”是指目的水性缓冲液中浓度为1mg/ml或更高的已标记的特异性结合成员，其能够形成同质水性组合物，且无聚合沉淀物，例如，2mg/ml或更高、3mg/ml或更高、4mg/ml或更高、5mg/ml或更高、6mg/ml或更高、7mg/ml或更高、8mg/ml或更高、9mg/ml或更高、10mg/ml或更高，甚至更高浓度的已标记的特异性结合成员。在某些实施例中，所述抗聚合的已标记的特异性结合成员包含：聚合物串联染料，其包括捕光多发色团(例如，如本文所述)以及与在能量接收时接近的所述多发色团连接的窄发射受体荧光团；以及与所述多发色团共价连接的特异性结合成员。

本文中使用的术语“特异性结合成员”是指对于彼此具有结合特异性的分子对的一个成员。这对分子中的一个成员可以在其表面上或腔中具有一区域，其与这对分子的另一个成员的表面上或腔中的相应区域特异性结合。因此，这对分子的成员具有与彼此特异性结合以产生结合复合物的特性。在一些实施例中，结合复合物中特异性结合成员之间的亲和力的特征在于K

所述特异性结合成员可以是蛋白质部分。本文中使用的术语“蛋白质的”是指由氨基酸残基组成的部分。蛋白质部分可以是多肽。在某些情况下，所述蛋白质特异性结合成员是抗体。在某些实施例中，所述蛋白质特异性结合成员是抗体片段，例如，与聚合染料特异性结合的抗体的结合片段。本文中使用的术语“抗体”和“抗体分子”可互换使用，是指由一种或更多种多肽组成的蛋白质，所述多肽基本上由全部或部分公认的免疫球蛋白基因编码。所述公认的免疫球蛋白基因(例如，人体内的相应基因)包括κ(k)、λ(I)和重链遗传基因座，其共同构成无数可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG、IgE和IgA同种型的恒定区基因μ(u)、δ(d)、γ(g)、σ(e)和α(a)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区(也称为“互补决定区”或“CDR”)间断的“框架”区(FR)组成。框架区和CDR的范围已被精确定义(详情请参见，“具有免疫学意义的蛋白质序列”，E.Kabat等人，美国卫生和公众服务部，(1991年))。本文所探讨的所有抗体氨基酸序列的编号均符合Kabat系统要求。不同轻链或重链构架区的序列在同一物种内是相对保守的。抗体的框架区(即，组成性轻链和重链的组合框架区)用于定位和调整CDR。CDR主要负责与抗原表位结合。术语“抗体”旨在包括全长抗体，且可以指用于实验、治疗或下文进一步定义的其他目的的来自任何生物体的天然抗体、工程化抗体或重组产生的抗体。

目的抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv或抗体的其他抗原结合子序列，其通过修饰全抗体或使用重组DNA技术从头合成产生。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，且可以具有针对细胞的其他比活性(例如，拮抗剂、激动剂、中和抗体、抑制性抗体或刺激性抗体)。应当理解，抗体可以发生对抗原结合或其他抗体功能基本上无影响的其他保守氨基酸取代。

在某些实施例中，所述特异性结合成员是Fab片段、F(ab')

在一些实施例中，所述已标记的特异性结合成员包括：水溶剂化捕光多发色团(例如，如本文所述)；与在能量接收时接近的所述多发色团共价连接的信号传导发色团(例如，如本文所述)；以及与所述多发色团共价连接的特异性结合成员。在所述已标记的特异性结合成员的一些情况下，本文所述的任何式(例如，式(V)和(VII)-(VIII))所示的多发色团，其中：G

多路复用荧光组合物

如上所述，所述聚合物串联染料提供了适用于多路复用应用的各种窄发射光谱。标的聚合物串联染料具有可以提供多路复用信号格式的窄发射光谱。由于所述窄发射光谱，相较于基于广谱发射器的多路复用系统，可以在相同的光谱范围内同时组合并使用各种染料。通过使适用于每种染料的检测窗口保持较小尺寸，可以在多重分析中包括多个较小的发射范围，从而使在给定系统中观察到的独立荧光信号数量增加。例如，图9展示了在多路复用系统中5种示例性串联染料的发射光谱。图9中所示的所有串联染料的发射信号的FWHM为25nm或更小，并提供与相同紫色光可激发的供体聚合染料不重叠的波长范围。这些串联染料表现出的有效斯托克斯位移为100至250nm。421nm处的所述小峰是源自于所述供体的残余发射。

本发明的方面包括用于多路复用荧光信号生成的组合物。所述组合物可以包括：具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料(例如，如本文所述)；以及具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长的第二聚合物串联染料。所述第二聚合物串联染料可以是任何适宜的染料。在一些情况下，所述第一窄发射光谱的半峰全宽(FWHM)的宽度为25nm或更小，例如20nm或更小、15nm或更小或10nm或更小。所述第二最大发射波长不同于第一最大发射波长，且两者相差20nm或更多，以便发挥所需的发射信号分离作用。

多种染料可在标的组合物中进行多路复用。在某些情况下，所述组合物包括一种或更多种其他聚合物串联染料，每种均具有不同的最大发射波长。在某些情况下，所述组合物中的每种聚合物串联染料独立地为具有窄发射受体荧光团的聚合物串联染料(例如，如本文所述)。在某些实施例中，所述组合物包括三种或更多种(4种或更多、5种或更多、6种或更多、10种或更多，甚至更多)聚合物串联染料，每种均具有范围为480nm至700nm的不同且不重叠的发射光谱(例如，具有不重叠的半峰全宽(FWHM)范围的不同发射光谱)。所述组合物中的每种聚合物串联染料都能够采用单个光源激发以提供正交可检测的荧光发射。图9展示了多路复用组合物的光谱，其中每种串联染料均用单个光源激发。

所述组合物中的聚合物串联染料可与特异性结合成员(例如，如本文所述)连接。因此，本发明的方面包括用于对靶分子进行多路复用检测的组合物，所述组合物包括第一和第二已标记的特异性结合成员。所述第一已标记的特异性结合成员可以包括：(i)具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料，其包含：水溶性捕光多发色团；以及经配置在能量接收时接近所述捕光多发色团的窄发射受体荧光团；以及(ii)与第一靶分子特异性结合并与所述第一聚合物串联染料连接的第一特异性结合成员。所述第二已标记的特异性结合成员可以包括：(i)具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长的第二聚合物串联染料；以及(ii)与第二靶分子特异性结合并与所述第二聚合物串联染料连接的第二特异性结合成员。所述窄发射受体荧光团可以是BODIPY染料(例如，如本文所述)。

方法

如上所述，本发明的方面包括评估样品中靶标分析物存在情况的方法。所述方法的方面包括使样品与特异性结合靶标分析物的聚合染料共轭物接触，以产生标记组合物接触样品。本文中使用的术语“聚合染料共轭物”和“已标记的特异性结合成员”可互换使用。因此，所述聚合染料共轭物可以包括：(i)水溶剂化聚合物串联染料(例如，如本文所述)；以及(ii)特异性结合成员(例如，如本文所述)。在一些情况下，所述聚合物串联染料共轭物包括与在能量接收时接近的所述聚合染料的多发色团共价连接的窄发射受体荧光团(例如，如本文所述)。

可以采用任何适宜的方法使样品与特异性结合靶标分析物的聚合染料共轭物接触，以产生标记组合物接触样品。在一些情况下，在特异性结合成员与靶标分析物(如有)特异性结合的条件下，使样品与聚合染料共轭物接触。为了使共轭物的特异性结合成员与靶标分析物特异性结合，可以使用适当的溶液来维持样品组分和特异性结合成员的生物活性。所述溶液可以是平衡盐溶液，例如，生理盐水、PBS、汉克平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清、人血小板裂解物或其他因子以及低浓度(例如，5-25mM)的可接受缓冲液。适宜的缓冲液包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。各种培养基可在市场上购得，且可根据靶标分析物的性质加以使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、Iscove培养基等，而且在一些情况下，需要补充胎牛血清或人血小板裂解物。所述溶液的最终组分可以根据所包括的样品组分加以选择。

所述共轭物的特异性结合成员与靶标分析物特异性结合的温度可能会有所不同，而且在一些情况下，所述温度范围可以是5℃至50℃，例如10℃至40℃、15℃至40℃、20℃至40℃，例如，20℃、25℃、30℃、35℃或37℃(例如，如上所述)。在一些情况下，选择进行特异性结合的温度，以与特异性结合成员和/或靶标分析物的生物活性相匹配。在某些情况下，所述温度是25℃、30℃、35℃或37℃。在某些情况下，所述特异性结合成员是抗体或其片段，且进行特异性结合的温度是室温(例如，25℃)、30℃、35℃或37℃。可以选择适用于特异性结合的任何适宜的温育时间，以便得到所需量的结合复合物，而且在一些情况下，所述时间可以是1分钟(min)或更长，例如，2分钟或更长、10分钟或更长、30分钟或更长、1小时或更长、2小时或更长，甚至是6小时或更长。

任何适宜的特异性结合成员均可在共轭物中使用。目的特异性结合成员包括但不限于与各种细胞类型的细胞表面蛋白特异性结合的试剂，所述细胞类型包括但不限于干细胞(例如，多能干细胞、造血干细胞)、T细胞、调节性T细胞、树突细胞、B细胞(例如，记忆B细胞、抗原特异性B细胞)、粒细胞、白血病细胞、淋巴瘤细胞、病毒细胞(例如，HIV细胞)、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞和红系细胞。目的靶细胞包括具有适宜的细胞表面标记物或抗原的细胞，其可以被适宜的特异性结合成员共轭物捕获。在一些实施例中，所述靶细胞选自含有HIV的细胞、Treg细胞、抗原特异性T细胞群体、肿瘤细胞或来自全血、骨髓或脐带血的造血祖细胞(CD34+)。在标的方法中，可以靶向任何适宜的细胞表面蛋白或细胞标记物，以特异性结合聚合染料共轭物。在一些实施例中，所述靶细胞包括选自细胞受体和细胞表面抗原的细胞表面标记物。在一些情况下，所述靶细胞可以包括细胞表面抗原，例如CD11b、CD123、CD14、CD15、CD16、CD19、CD193、CD2、CD25、CD27、CD3、CD335、CD36、CD4、CD43、CD45RO、CD56、CD61、CD7、CD8、CD34、CD1c、CD23、CD304、CD235a、T细胞受体α/β、T细胞受体γ/δ、CD253、CD95、CD20、CD105、CD117、CD120b、Notch4、Lgr5(N-末端)、SSEA-3、TRA-1-60抗原、双唾液酸神经节苷脂GD2和CD71。

可以采用标的方法选择任何适宜的靶标进行评估。目的靶标包括但不限于核酸，例如，RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子；蛋白质，例如，融合蛋白、改性蛋白(例如，磷酸化蛋白、糖基化蛋白、泛素化蛋白、SUMO化蛋白或乙酰化蛋白)；或抗体、肽、聚合生物分子、细胞、小分子、维生素和药物分子。本文中使用的术语“靶蛋白”是指靶标家族中的所有成员及其片段。所述靶蛋白可以是任何目的蛋白，例如，治疗或诊断靶标，包括但不限于：激素、生长因子、受体、酶、细胞因子、成骨诱导因子、集落刺激因子和免疫球蛋白。术语“靶蛋白”旨在包括重组和合成分子，其可以采用任何适宜的重组表达方法或任何合适的合成方法制备或商购。在一些实施例中，所述聚合染料共轭物包括抗体或抗体片段。在标的方法中，可以靶向与目的抗体或抗体片段特异性结合的任何适宜的靶标分析物。

在一些实施例中，所述靶标分析物与细胞缔合。在某些情况下，所述靶标分析物是细胞的细胞表面标记物。在某些情况下，所述细胞表面标记物选自由细胞受体和细胞表面抗原组成的组。在一些情况下，所述靶标分析物是细胞内靶标，且所述方法进一步包括裂解细胞。

在一些实施例中，所述样品可以包括从中分离靶细胞的异质细胞群体。在一些情况下，所述样品包括外周全血、在细胞分离之前红细胞已裂解的外周全血、脐带血、骨髓、密度梯度纯化的外周血单核细胞或匀浆组织。在一些情况下，所述样品包括全血、骨髓或脐带血中的造血祖细胞(例如，CD34+细胞)。在某些实施例中，所述样品包括外周血中的肿瘤细胞。在某些情况下，所述样品是包括(或疑似包括)病毒细胞(例如，HIV)的样品。

所述已标记的特异性结合成员可用于标的方法中，例如，用聚合染料或聚合物串联染料标记靶细胞、颗粒、靶标或分析物。例如，已标记的特异性结合成员可用于标记待在流式细胞仪中处理(例如，检测、分析和/或分选)的细胞。所述已标记的特异性结合成员可以包括与诸如各种细胞类型(例如，如本文所述)的细胞表面蛋白特异性结合的抗体。所述已标记的特异性结合成员可用于研究各种生物(例如，细胞)特性或过程，例如，细胞周期、细胞增殖、细胞分化、DNA修复、T细胞信号传导、细胞凋亡、细胞表面蛋白表达和/或呈递等。已标记的特异性结合成员可用于包括(或可能包括)对细胞、颗粒或分析物进行的抗体介导的标记的任何应用中。

在所述方法的某些情况下，所述已标记的特异性结合成员包括本文所述的多发色团(例如，根据式(XI)-(XIV)中的任一项所述的多发色团)。在某些情况下，G

所述方法的方面包括测定标记组合物接触样品中是否存在聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物，以评估样品中是否存在靶标分析物。一旦所述样品与聚合染料共轭物接触，便可以采用任何适宜的方法来测定产生的标记组合物接触样品中是否存在聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物。所述聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物是所述共轭物的特异性结合成员与所述靶标分析物(如有)特异性结合时产生的结合复合物。测定标记组合物接触样品可以包括检测来自结合复合物的荧光信号(如有)。在一些情况下，所述测定包括分离步骤，在所述步骤中使靶标分析物(如有)与样品分离。可以利用各种方法来使靶标分析物与样品分离，例如，通过固定在支持物上。目的测定方法包括但不限于任何适宜的方法和测定形式，其中涉及到特异性结合成员对，例如，可使用亲和素-生物素或半抗原-抗半抗原抗体。适于与标的组合物结合使用的目的方法和测定形式包括但不限于流式细胞术方法、原位杂交方法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选测定和荧光染料纯化色谱分析。

在某些实施例中，所述方法进一步包括使样品与特异性结合靶标分析物的第二特异性结合成员接触。在某些情况下，第二特异性结合成员已结合支持物。可以采用任何适宜的支持物来固定标的方法所述的组分(例如，第二特异性结合成员)。在某些情况下，所述支持物是颗粒，例如，磁粉。在一些情况下，所述第二特异性结合成员和聚合染料共轭物产生夹层复合物，所述复合物可以采用任何适宜的方法进行分离和检测(如有)。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过流式细胞术分析聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物，即荧光标记的靶标分析物。聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物存在情况测定可以提供相应测定结果(例如，定性或定量测定数据)，其可以用于评估样品中是否存在靶标分析物。

任何适宜的支持物均可用于标的方法中，以固定所述方法中所示的任何适宜的组分，例如，已标记的特异性结合成员、靶标、第二特异性结合成员等。目的支持物包括但不限于：固体基质，其中所述基质可以具有多种构型，例如，片状、微球状或其他结构，例如带孔的板；微球、聚合物、颗粒、纤维网格、水凝胶、多孔基体、针、微阵列表面、色谱分析支持物等。在一些情况下，所述支持物选自由以下各项组成的组：颗粒、平面固体基质、纤维网格、水凝胶、多孔基体、针、微阵列表面和色谱分析支持物。可以将所述支持物引入系统中，所述系统可在任何适宜方法的辅助下进行细胞分离，例如，手动操作的注射器、离心机或自动化液体处理系统。在一些情况下，所述支持物可用于自动化液体处理系统(例如，流式细胞仪)中，以实现细胞的高通量分离。

在所述方法的一些实施例中，所述分离步骤包括施加外部磁场以固定磁粉。任何适宜的磁体都可以用作外部磁场源(例如，磁场梯度)。在一些情况下，所述外部磁场由磁源产生，例如，通过永磁体或电磁体产生。在一些情况下，固定磁粉是指使磁粉在最靠近磁场梯度源(即磁体)的表面附近积聚。

所述分离可以进一步包括一个或更多个任选洗涤步骤，以从支持物中除去样品的未结合物质。可以采用任何适宜的洗涤方法，例如，用生物相容性缓冲液洗涤固定的支持物，所述缓冲液可以保留聚合染料与特异性结合成员之间的特异性结合相互作用。从支持物中分离并任选地洗涤样品的未结合物质，以提供富集的靶细胞群体，其中可除去不合需求的细胞和物质。

在某些实施例中，所述方法进一步包括检测已标记的靶标。检测已标记的靶标可以包括用一个或更多个激光器激发多发色团，随后用一个或更多个光学检测器检测来自聚合物串联染料的荧光发射。所述已标记的靶标可以采用任何适宜的仪器和方法进行检测，包括但不限于流式细胞术、FACS系统、荧光显微镜检查；使用酶标仪进行的荧光、冷光、紫外光和/或可见光检测；高效液相色谱法(HPLC)；以及质谱分析法。在本发明所述的方法和组合物中使用荧光标记的组分时，通常认为可以使用不同类型的荧光检测系统来实践标的方法。在一些情况下，可以进行高通量筛选，例如，使用96孔或更多孔的微量滴定板的系统。可以采用各种方法对荧光物质进行测定，例如，以下出版物中所述的方法：Lakowicz,J.R.，荧光光谱的原理，纽约：Plenum Press(1983年)；Herman,B.，共振能量转移显微镜检查，载于：培养物中活细胞的荧光显微镜检查，第B部分，细胞生物学方法，第30卷，编辑，Taylor,D.L.和Wang,Y.-L.，圣地亚哥：Academic Press(1989年)，第219-243页；Turro,N.J.，现代分子光化学，门洛帕克：Benjamin/Cummings Publishing Col,Inc.(1978年)，第296-361页。

可以使用荧光计测定样品中的荧光。在一些情况下，来自具有第一波长的激发源的激发辐射穿过激发光学器件。所述激发光学器件促使激发辐射激发样品。作为响应，所述样品中荧光标记的靶标发出的辐射的波长不同于激发波长。然后，收集光学器件收集来自样品中的发射。相关设备可以包括温度控制器，以在扫描样品时使样品保持在特定温度下。在某些情况下，多轴平移台移动装有多个样品的微量滴定板，以便定位待暴露的不同孔。所述多轴平移台、温度控制器、自动聚焦功能以及与成像和数据采集相关的电子设备均可以通过适当编程的数字计算机进行管理。所述计算机也可以将在测定过程中采集的数据转换成另一种格式以进行显示。

在一些实施例中，评估样品中是否存在靶标分析物的方法进一步包括在流式细胞仪中检测荧光。在一些实施例中，评估样品中是否存在靶标分析物的方法进一步包括通过荧光显微镜检查对标签组合物接触样品进行成像。荧光显微镜成像可用于识别接触样品中的聚合染料共轭物-靶标分析物结合复合物，以评估靶标分析物是否存在。在标的方法中使用的目的显微镜检查法包括激光扫描共聚焦显微镜检查。

本发明还提供了标记靶分子的方法。标的聚合物串联染料可用于各种标记、分离、检测和/或分析方法中。在一些实施例中，所述方法包括：使靶分子与聚合物串联染料(例如，如本文所述)接触，以产生标记的靶分子，其中所述聚合物串联染料包括与靶分子共价连接的共轭标签。在所述方法的一些情况下，所述聚合染料成员包括根据式(XI)-(XIV)中任一项所述的多发色团(例如，如本文所述)，其中G

术语“共轭标签”是指包括化学选择性官能团(例如，如本文所述)的基团，所述官能团在任选活化和/或脱保护后可以与靶分子的相容官能团共价连接。任何适宜的共轭标签可用于标的聚合染料中，以使所述染料与目的靶分子共轭。在一些实施例中，所述共轭标签包括选自以下各项的末端官能团：氨基、羧酸或其衍生物、硫醇、羟基、肼、酰肼、叠氮化物、炔烃和蛋白质反应性基团(例如，氨基反应性基团、硫醇反应性基团、羟基反应性基团、咪唑基反应性基团或胍基反应性基团)。

任何适宜的方法和试剂均适合用于标的标记方法中，以使共轭标签与靶分子共价连接。用于标记靶标的目的方法包括但不限于以下出版物中所述的方法和试剂：Hermanson，生物共轭技术，第三版，Academic Press，2013年。所述接触步骤可以在水溶液中进行。在一些情况下，所述共轭标签包括氨基官能团，而所述靶分子包括活化酯官能团，例如，NHS酯或磺基-NHS酯，反之亦然。在某些情况下，所述共轭标签包括马来酰亚胺官能团，而所述靶分子包括硫醇官能团，反之亦然。在某些情况下，所述共轭标签包括炔烃(例如，环辛炔基)官能团，而所述靶分子包括叠氮化物官能团，反之亦然，其可以通过点击化学反应进行共轭。

可以采用标的方法选择任何适宜的靶分子进行标记。目的靶分子包括但不限于核酸，例如，RNA、DNA、PNA、CNA、HNA、LNA或ANA分子；蛋白质，例如，融合蛋白、改性蛋白(例如，磷酸化蛋白、糖基化蛋白、泛素化蛋白、SUMO化蛋白或乙酰化蛋白)；或抗体、肽、聚合生物分子、细胞、小分子、维生素和药物分子。本文中使用的术语“靶蛋白”是指靶标家族中的所有成员及其片段。所述靶蛋白可以是任何目的蛋白，例如，治疗或诊断靶标，包括但不限于：激素、生长因子、受体、酶、细胞因子、成骨诱导因子、集落刺激因子和免疫球蛋白。术语“靶蛋白”旨在包括重组和合成分子，其可以采用任何适宜的重组表达方法或任何合适的合成方法制备或商购。在一些实施例中，所述靶分子是特异性结合成员(例如，如本文所述)。在某些情况下，所述特异性结合成员是抗体。在一些情况下，所述特异性结合成员是抗体片段或其结合衍生物。在一些情况下，所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')

在一些情况下，所述方法包括分离步骤，在所述步骤中使已标记的靶分子与反应混合物分离，例如，多余试剂或未标记的靶标。可以采用各种方法来分离样品中的靶标，例如，通过固定在支持物上、沉淀、色谱分析法等。

在一些情况下，所述方法进一步包括检测和/或分析已标记的靶分子。在一些情况下，所述方法进一步包括荧光检测已标记的靶分子。可以利用任何适宜的方法以及标的方法和组合物来检测和/或分析已标记的靶分子。分析标的方法中使用的目的靶标的方法包括但不限于流式细胞术、荧光显微镜检查、原位杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选测定和荧光染料纯化色谱分析。目的检测方法包括但不限于荧光光谱法、荧光显微镜检查、核酸测序、荧光原位杂交(FISH)、蛋白质质谱分析、流式细胞术等。

可以通过聚合物串联染料直接进行检测，也可以通过二级检测系统间接进行检测。后者可基于几种不同原理中的任一种或其组合进行，包括但不限于抗体标记的抗物种抗体和其他形式的免疫或非免疫桥接和信号放大系统(例如，生物素-链霉亲和素技术、蛋白质-A和蛋白质-G介导的技术或核酸探针/抗核酸探针等)。合适的报告分子可以是免疫细胞化学、分子生物学、光、荧光和电子显微镜检查、细胞免疫表型分析、细胞分选、流式细胞术、细胞可视化、检测、枚举和/或信号输出定量领域中已知的报告分子。可以标记一种以上具有特异性和/或非特异性的抗体，且同时或相继使用所述抗体来增强靶标的检测、鉴定和/或分析。

系统

本发明的方面进一步包括用于实施标的方法和组合物相关过程的系统。样品分析系统可以包括装载有样品和已标记的特异性结合成员的样品视场或流道。在一些实施例中，所述系统是流式细胞术系统，其包括：包括流路的流式细胞仪；流路中的组合物，其中所述组合物包括：样品；以及已标记的特异性结合成员(例如，如本文所述)。

在一些实施例中，用于分析样品的系统是荧光显微镜系统，其包括：包括样品视场的荧光显微镜；在样品视场中加以处置的组合物，其中所述组合物包含样品；以及已标记的特异性结合成员(例如，如本文所述)。

在所述系统的一些情况下，所述已标记的特异性结合成员包括：聚合物串联染料(例如，如本文所述)和特异性结合成员(其与共价连接至所述多发色团的靶标分析物特异性结合)。在标的系统的一些情况下，所述已标记的特异性结合成员和所述聚合物串联染料的结构式如式(XI)-(XIV)(例如，如本文所述)中的任一项所示，其中：G

在所述系统的某些实施例中，所述组合物进一步包括一个第二特异性结合成员，其已结合支持物且与靶标分析物特异性结合。在一些情况下，所述支持物包括磁粉。因此，在某些情况下，所述系统还可以包括可控的外部顺磁场，其被配置成适用于流道的测定区域。

所述样品可以包括细胞。在一些情况下，所述样品是含有细胞的生物样品。在一些情况下，所述样品包括与靶细胞特异性结合的已标记的特异性结合成员。在某些情况下，与特异性结合成员特异性结合的靶标分析物是所述细胞的细胞表面标记物。在某些情况下，所述细胞表面标记物选自细胞受体和细胞表面抗原。

在某些方面，所述系统还可以包括光源，其被配置成将光引导至流道的测定区域或样品视场。所述系统可以包括检测器，其被配置成接收来自流道的测定区域或样品视场的信号，其中所述信号由荧光组合物提供。任选地，所述样品分析系统可以进一步包括一个或更多个附加检测器和/或光源，以检测一个或更多个附加信号。

在某些方面，所述系统可以进一步包括被配置成检测荧光信号是否存在的基于计算机的系统。“基于计算机的系统”是指用于分析本发明的信息的硬件装置、软件装置和数据存储装置。本发明所述的基于计算机的系统的最低硬件配置包括中央处理器(CPU)、输入装置、输出装置和数据存储装置。技术人员可轻易理解的是，当前可用的任何一种基于计算机的系统都适用于标的系统。所述数据存储装置可以包括任何产品，包括对如上所述的本发明信息的记录，或可以访问所述产品的内存访问装置。

为了“记录”数据，计算机可读介质上的编程信息或其他信息是指使用本领域已知的任何所述方法存储信息的过程。基于用于访问存储信息的装置，可以选择任何适宜的数据存储结构。各种数据处理器程序和格式可用于存储，例如，文字处理文本文件、数据库格式等。

“处理器”是指将执行其所需功能的任何硬件和/或软件组合。例如，本文所述的任何处理器可以是可编程数字微处理器，例如，通过以下形式提供：电子控制器、大型机、服务器或个人计算机(台式机或便携式计算机)。若处理器是可编程的，则适合的编程可以从远端位置传送至所述处理器，或预先保存在计算机程序产品(例如，便携式或固定式计算机可读存储介质，无论是基于磁性、光学还是固态设备)中。例如，磁性介质或光盘可以承载编程，而且可以由在其相应基站与各处理器连通的合适的读取器来读取。

除了传感器设备和信号处理模块(例如，如上所述)外，本发明所述的系统可以包括多个附加组件，例如，数据输出设备(例如，显示器和/或扬声器)、数据输入装置(例如，接口、键盘等)、流体处理组件、电源等。

在某些方面，所述系统包括流式细胞仪。目的流式细胞仪包括但不限于编号如下的美国专利中所述的设备：4,704,891；4,727,029；4,745,285；4,867,908；5,342,790；5,620,842；5,627,037；5,701,012；5,895,922；以及6,287,791；这些专利中的内容以引用方式并入本文。

其他系统可用于实施标的方法。在某些方面，所述系统可以是装载有样品(具有本文所探讨的任一实施例中所述的荧光组合物)的荧光计或显微镜。所述荧光计或显微镜可以包括光源，其被配置成将光引导至流道的测定区域或样品视场。所述荧光计或显微镜还可以包括检测器，其被配置成接收来自流道的测定区域或视场的信号，其中所述信号由荧光组合物提供。

试剂盒

本发明的方面进一步包括用于实施标的方法和组合物相关过程的试剂盒。本发明所述的组合物可以作为试剂被包括在试剂盒中，其可以作为起始物料或提供以用于诸如上述方法中。

本发明提供了用于多路复用荧光信号生成的试剂盒。所述试剂盒可以包括具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料(例如，如本文所述)；以及一种或更多种具有与所述第一窄发射光谱正交的最大发射波长的其他聚合物串联染料。一种或更多种其他聚合物串联染料各自可以具有不同的最大发射波长。在一些情况下，标的试剂盒中的所述聚合物串联染料具有范围为480nm至700nm的不同且不重叠的发射光谱(例如，具有不重叠的半峰全宽(FWHM)范围的不同发射光谱)。

试剂盒可以包括聚合物串联染料(包括水溶剂化捕光多发色团(例如，如本文所述))和容器。可以使用任何适宜的容器，例如，管、瓶、多孔条或板中的孔、盒、袋、隔热容器等。所述标的试剂盒可进一步包括一种或更多种选自以下各项的组成部分：聚合物串联染料、荧光团、特异性结合成员、特异性结合成员共轭物、支持物结合的特异性结合成员、细胞、支持物、生物相容的水性洗脱缓冲液和使用说明。在所述试剂盒的一些实施例中，所述多发色团与特异性结合成员共价连接。在一些情况下，所述特异性结合成员是抗体。在某些情况下，所述特异性结合成员是抗体片段或其结合衍生物。在某些情况下，所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')2片段、scFv、双抗体和三抗体组成的群组。

在某些实施例中，所述试剂盒可用于评估样品中是否存在靶标分析物，例如，细胞内靶标。因此，在一些情况下，所述试剂盒包括一种或更多种适于裂解细胞的组分。所述试剂盒的一种或更多种附加组分可以装在单独的容器(例如，单独的管、瓶或者多孔条或板中的孔)中提供。

在某些方面，所述试剂盒进一步包括用于进行流式细胞术测定的试剂。目的试剂包括但不限于用于重构和稀释的缓冲液、用于使细胞样品与多发色团接触的缓冲液、洗涤缓冲液、对照细胞、对照微球、用于流式细胞仪校准的荧光微球及其组合。所述试剂盒试剂盒还可以包括一种或更多种细胞固定试剂，例如，多聚甲醛、戊二醛、甲醇、丙酮、福尔马林或其任何组合或缓冲液。此外，所述试剂盒可以包括细胞透化试剂，例如，甲醇、丙酮或清洁剂(例如，曲通、NP-40、皂苷、吐温20、毛地黄皂苷、leucoperm)或其任何组合或缓冲液。技术人员熟悉的其他蛋白转运抑制剂、细胞固定试剂和细胞透化试剂均在标的试剂盒的范围内。

所述试剂盒的组合物可以液体组合物(例如，任何合适的缓冲液)的形式提供。此外，所述试剂盒的组合物可以干组合物(例如，可以冻干)的形式提供，而且所述试剂盒可以任选地包括一种或更多种用于重构所述干组合物的缓冲液。在某些方面，所述试剂盒可以包括装在单独的容器(例如，单独的管、瓶或者多孔条或板中的孔)中提供的组合物的等分试样。

此外，可以将一种或更多种组分混合装在单个容器中，例如，玻璃或塑料小瓶、管或瓶。在某些情况下，所述试剂盒可以进一步包括其中装有所有相应组分(及其单独的容器)的容器(例如，盒、袋、隔热容器、瓶、管等)。所述试剂盒可以进一步包括与所述试剂盒容器分开或附于其上且上面印有关于试剂盒、试剂盒的组成部分和/或试剂盒的使用说明的信息的包装。

除上述组成部分外，标的试剂盒可能进一步包括用于实施标的方法的说明书。这些说明书可能以各种形式存在于标的试剂盒中，其中一种或更多种可能存在于所述试剂盒中。这些说明书可能存在的一种形式是印在适合的介质或基底(例如，其上印有信息的一张纸或更多张纸)、试剂盒包装、包装说明书等之上的印刷信息。其存在的另一种形式是其上已记录有信息的计算机可读介质，例如，软盘、CD、便携式闪存驱动器等。这些说明书还可能存在的一种形式是网址，可以借此通过互联网访问远程网站上的信息。所述试剂盒中可能存在任何适宜的装置。

效用

本文所述的窄发射荧光团染料、聚合物串联染料、组合物、方法和系统可用于各种应用中，包括诊断和研究应用，其中需要对目的靶标进行标记、检测和/或分析。所述应用包括各种方法，例如，细胞计数、显微镜检查、免疫测定(例如，竞争性或非竞争性)、游离分析物评估、受体结合配体的评估等。本文所述的组合物、系统和方法可用于分析多种样品中的任何一种，包括但不限于生物流体、细胞培养样品和组织样品。在某些方面，本文所述的组合物、系统和方法可用于使用荧光标记(例如，在荧光活化的细胞分选或分析、免疫测定、免疫染色等中)检测样品中的分析物(如有)的方法。在某些情况下，所述组合物和方法可用于涉及评估样品中是否存在靶标分析物的应用中。

在一些情况下，所述方法和组合物可用于涉及检测和/或分析样品中的靶标的任何测定形式，包括但不限于流式细胞术、荧光显微镜检查、原位杂交、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹分析、磁性细胞分选测定和荧光染料纯化色谱分析。在某些情况下，所述方法和组合物可用于涉及靶分子的荧光标记的任何应用中。所述标的组合物适合用于任何可使用特异性结合成员对(例如，生物素-链霉亲和素和半抗原-抗半抗原抗体)的适宜应用中。

本发明阐述了以下定义，以便说明及定义本说明书中所使用的术语的含义和范围。

除非另有定义，否则本专利所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管如此，为清楚起见，也为了便于参考，某些术语的定义如下。

必须注意的是，如本专利和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一”、“一个”和“所述/该”包括复数指代对象，除非上下文另有明确说明。例如，术语“染料”是指一种或更多种染料，即，单种染料和多种染料。还应注意，可以起草权利要求以排除任何可选要素。因此，该陈述旨在作为使用诸如“单独”、“仅”等与陈述权利要求要素有关的专用术语或使用“否定”限制的前置基础。

本文中使用的术语“样品”涉及含有一种或更多种目的分析物的材料或材料混合物，所述材料在一些情况下为液态。在一些实施例中，在广义上，“样品”是指含有细胞或产生细胞代谢物的任何植物、动物或细菌，例如，从个体(包括但不限于血浆、血清、脑脊液、淋巴、泪液、唾液和组织切片)或体外细胞培养成分以及来自环境的样品中分离出来的组织或液体。术语“样品”也可以指“生物样品”。本文中使用的术语“生物样品”是指整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集(例如，体液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。“生物样品”也可以指用整个生物体或其组织、细胞或组成部分的子集或其碎片或部分(包括但不限于血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外层切片、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、泪液、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤和器官)制备的匀浆、裂解物或提取物。在某些实施例中，样品已从动物或植物中取出。生物样品可以包括细胞。依照常规含义，术语“细胞”是指至少具有细胞核和细胞膜的真核生物和原核生物的基本结构单位。在某些实施例中，细胞包括原核细胞，例如，来自细菌的原核细胞。在其他实施例中，细胞包括真核细胞，例如，获取自动物、植物或真菌的生物样品的细胞。

本文中使用的术语“支持物结合”和“与支持物连接”可互换使用，是指与目的支持物共价或非共价连接的部分(例如，特异性结合成员)。共价连接可能涉及两个相容官能团(例如，两个化学选择性官能团、一个亲电体和一个亲核体等)的化学反应，以在两个目的部分(例如，支持物和特异性结合成员)之间形成共价键。在一些情况下，非共价连接可能涉及两个目的部分(例如，两个亲和部分，例如半抗原和抗体或生物素部分和链霉亲和素等)之间的特异性结合。在某些情况下，非共价连接可能涉及对底物的吸收。

本文中使用的术语“多肽”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，包括长度为2-50个氨基酸的肽和长度大于50个氨基酸的多肽。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“多肽”包括编码和非编码氨基酸的聚合物、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有经修饰的肽骨架的多肽，其中常规骨架已被非天然存在或合成的骨架替代。多肽可以具有任何适宜的长度，例如，2个或更多个氨基酸，例如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸、100个或更多个氨基酸、300个或更多个氨基酸，例如至多500个或1000个或更多个氨基酸。“肽”可以是2个或更多个氨基酸，例如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸，例如至多50个氨基酸。在一些实施例中，肽的长度介于5至30个氨基酸之间。

本文中使用的术语“分离的”是指与其他组分(即，纯化前与目的部分相关联的组分)至少60％分离、至少75％分离、至少90％分离、至少95％分离、至少98％分离甚至99％分离的目的部分。

“多个”至少含有2个成员。在某些情况下，多个可以具有10个或更多个，例如100个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个、100,000个或更多个、10

数值范围包括定义所述范围的数字。

本文中使用的术语“特异性结合”是指捕获剂(或特异性结合对的第一成员)优先结合存在于，例如，不同分析物的均匀混合物中的特定分析物(或特异性结合对的第二成员)的能力。在一些情况下，特异性结合相互作用将区分样品中合乎需求的与不合需求的分析物，其中与不合需求的分析物相比，合乎需求的分析物的特异性高出10倍或更多，例如100倍或更多或1000倍或更多。在一些情况下，当捕获剂与分析物以捕获剂/分析物复合物的形式特异性结合时，它们之间的亲和力为至少10

本文中使用的术语“亲和力”和“亲合力”具有相同的含义，在本文中可互换使用。“亲和力”是指结合强度，结合亲和力增加与Kd降低有关。

本文所述的方法包括多个步骤。根据需要，可以在步骤之间经过预定量的时间之后执行每个步骤。因此，执行每个步骤之间的时间可以是1秒或更长、10秒或更长、30秒或更长、60秒或更长、5分钟或更长、10分钟或更长、60分钟或更长，包括5小时或更长。在某些实施例中，每个后续步骤均在前一步骤完成之后立即执行。在其他实施例中，步骤可以在前一步骤完成后的孵育或等待时间过后执行，例如，在几分钟至过夜等待时间之后执行。

本文中使用的术语“评价”、“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用，且包括定量和定性测定。

本文中使用的术语“分离”是指两种元素的物理分离(例如，按照尺寸或亲和力等分离)以及一种元素降解而另一种元素保持完整。

术语“化学选择性官能团”和“化学选择性标签”可互换使用，是指在一些情况下，在任选地活化其中一个官能团后，可选择性地与另一个相容官能团反应以形成共价键的官能团。可获取各种化学选择性官能团、其合成前体及其受保护形式，并且可以将其掺入标的BODIPY染料中，以促使所述染料与目的分子(例如，如本文所述)共轭。术语化学选择性官能团旨在包括目的官能团的任何适宜的合成前体或受掩蔽或受保护形式。目的化学选择性官能团包括但不限于胺基(例如，-NH

术语“连接子”、“连接基团”和“键”是指连接两个基团且具有长度为100个或更少的原子的骨架的连接部分。连接子或键可以是连接两个基团的共价键或长度为1至100个原子的链，例如，长度为1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20或更多个碳原子的链，其中连接子可以是直链状、分支状、环状或单个原子。在一些情况下，连接子是分支型连接子，即指连接三个或更多个基团的连接部分。在某些情况下，连接子骨架的一个、两个、三个、四个或五个或更多个碳原子可以任选地被硫、氮或氧杂原子取代。在一些情况下，连接子骨架包括连接官能团，例如，乙醚、硫醚、氨基、酰胺、磺酰胺、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯、脲、硫脲、酯、硫酯或亚胺。骨架原子之间的键可以是饱和键，也可以是不饱和键；在一些情况下，连接子骨架中的不饱和键数量不超过一个、两个或三个。连接子可以包括一个或更多个取代基，例如，被烷基、芳基或烯基基团取代。连接子可以包括但不限于聚乙二醇；乙醚；硫醚；叔胺；烷基，其可以是直链状或分支状，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)等。连接子骨架可以包括环状基团，例如，芳基、杂环或环烷基基团，其中骨架包括环状基团的2个或更多个原子，例如，2个、3个或4个原子。连接子可以是可裂解的，也可以是不可裂解的。

本文中使用的术语“聚环氧乙烷”、“PEO”、“聚乙二醇”和“PEG”可互换使用，是指包括如化学式--(CH

本文中使用的术语“烷基”(本身或作为另一取代基的一部分)是指去除母体烷烃中单个碳原子的一个氢原子后衍生得到的饱和分支状或直链状单价烃基。-目的烷基基团包括但不限于甲基；乙基；丙基，例如丙-1-基或丙-2-基)；以及丁基，例如丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基或2-甲基-丙-2-基。在一些实施例中，烷基基团包括1至20个碳原子。在一些实施例中，烷基基团包括1至10个碳原子。在某些实施例中，烷基基团包括1至6个碳原子，例如，1至4个碳原子。此术语包括，例如，直链状和分支状烃基基团，例如甲基(CH

术语“被取代的烷基”是指本文所定义的烷基基团，其中烷基链中的一个或更多个碳原子已任选地被杂原子(例如，-O-、-N-、-S-、-S(O)

“烷氧基”是指基团-O-烷基，其中烷基如本文所定义。举例来说，烷氧基包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基等。术语“烷氧基”也指基团烯基-O-、环烷基-O-、环烯基-O-和炔基-O-，其中烯基、环烷基、环烯基和炔基如本文所定义。

术语“被取代的烷氧基”是指基团被取代的烷基-O-、被取代的烯基-O-、被取代的环烷基-O-、被取代的环烯基-O-和被取代的炔基-O-，其中被取代的烷基、被取代的烯基、被取代的环烷基、被取代的环烯基和被取代的炔基如本文所定义。

“氨基”是指基团–NH

术语“被取代的氨基”是指基团-NRR，其中每个R独立地选自由以下各项组成的组：氢、烷基、被取代的烷基、环烷基、被取代的环烷基、烯基、被取代的烯基、环烯基、被取代的环烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、杂芳基和杂环基，前提是至少有一个R不是氢。

“芳基”(本身或作为另一取代基的一部分)是指去除芳环体系中单个碳原子的一个氢原子后衍生得到的单价芳烃基。目的芳基基团包括但不限于衍生自以下各项的基团：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、薁、苯、苣、蔻、荧蒽、芴、并六苯、己芬、己搭烯、不对称引达省、对称引达省、茚满、茚、萘、并八苯、辛芬、辛搭烯、卵苯、戊-2,4-二烯、并五苯、戊搭烯、戊芬、苝、非那烯、菲、苉、七曜烯、芘、吡蒽、玉红省、三亚苯、三萘等。在某些实施例中，芳基基团包括6至20个碳原子。在某些实施例中，芳基基团包括6至12个碳原子。芳基基团的示例是苯基和萘基。

“杂芳基”(本身或作为另一取代基的一部分)是指去除杂芳环体系中单个原子的一个氢原子后衍生得到的单价杂芳基。目的杂芳基基团包括但不限于衍生自以下各项的基团：吖啶、砷哚、咔唑、β-咔啉、色烷、色烯、噌啉、呋喃、咪唑、吲唑、吲哚、吲哚啉、吲哚嗪、异苯并呋喃、异色烯、异吲哚、异吲哚啉、异喹啉、异噻唑、异恶唑、萘啶、恶二唑、恶唑、

“杂环”、“杂环的”、“杂环烷基”和“杂环基”是指具有单环或多个稠环(包括稠合桥环和螺环体系)且具有3至20个环原子(包括1至10个杂原子)的饱和或不饱和基团。所述环原子选自由氮、硫或氧组成的组，其中，在稠合环体系中，一个或更多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基，前提是附接点通过非芳香环。在某些实施例中，杂环基团的氮和/或硫原子任选地被氧化，以提供氮氧化物、-S(O)-或-SO

杂环和杂芳基的示例包括但不限于吖丁啶、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲咯啉、异噻唑、吩嗪、异恶唑、吩恶嗪、吩噻嗪、咪唑烷、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4-四氢异喹啉、4,5,6,7-四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基(也称为噻吗啉基)、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷、四氢呋喃基等。

除非所述杂环取代基的定义另有限制，否则此类杂环基团可任选地被选自以下各项的1至5个取代基或1至3个取代基取代：烷氧基、被取代的烷氧基、环烷基、被取代的环烷基、环烯基、经取代的环烯基、酰基、酰氨基、酰氧基、氨基、被取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧基氨酰基、叠氮基、氰基、卤素、羟基、氧代、硫酮、羧基、羧烷基、硫代芳氧基、硫代杂芳氧基、硫代杂环氧基、硫醇、硫代烷氧基、被取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、杂芳基、杂芳氧基、杂环基、杂环氧基、羟氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-被取代的烷基、-SO-芳基、-SO-杂芳基、-SO

术语“烷芳基”或“芳烷基”是指基团-亚烷基-芳基和被取代的亚烷基-芳基，其中亚烷基、被取代的亚烷基和芳基如本文所定义。

“亚烷基”是指优选地具有1至6个(更优选地具有1至3个)直链状或分支状碳原子的二价脂肪族烃基基团，其任选地被一个或多个选自-O-、-NR

“被取代的”是指其中一个或更多个氢原子独立地被相同或不同的取代基取代的基团。目的取代基包括但不限于亚烷二氧基(例如亚甲二氧基)、-M、-R

其他术语定义可能在说明书其他地方出现。

示例

BODIPY染料可以根据任何适宜的方法制备，包括以下出版物中所述的方法：Loudet和Burgess(“BODIPY染料及其衍生物：合成和光谱性质，”化学评论，2007，107，4891-4932)。

制备多种BODIPY染料，并使其与聚合染料偶联，以制备聚合物串联染料。图3展示了示例性聚合物串联染料的结构。评估特定BODIPY染料以及包括所述BODIPY染料的聚合物串联染料的光谱特性。观察本发明的示例性BODIPY染料，其表现出的量子产率为0.57至0.90，最大吸收波长范围为493nm至663nm，最大发射波长范围为504nm至673nm。示例性BODPY染料以及包括所述BODIPY染料的串联染料的更多详细信息列于下表1和2中。

表1.示例性BODPY染料与市售BODPY染料的半峰全宽

上述标的物的各方面(包括实施例)可单独使用或与一个或更多个方面或实施例合并使用。在不限制本文所述内容的情况下，下文提供了本发明的某些非限制性内容。在阅读本发明后，以下内容对所属领域的技术人员来说是显而易见的，每个单独编号的内容可单独使用，也可与之前或之后任一单独编号内容组合使用。这旨在为各项内容的所有此类组合提供支持，并且不仅限于以下明确提供的内容的组合：

1.一种聚合物串联染料，其包含：

水溶性捕光多发色团；以及

经配置在能量接收时接近所述捕光多发色团的窄发射受体荧光团。

2.根据1所述的聚合物串联染料，其中所述窄发射受体荧光团的所述发射光谱的半峰全宽(FWHM)的宽度为25nm或更小。

3.根据1-2中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述窄发射受体荧光团在直接激发时表现出的斯托克斯位移为20nm或更少。

4.根据1-3中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料在所述捕光多发色团用入射光直接激发时表现出的有效斯托克斯位移为100nm或更多(例如，100-300nm)。

5.根据1-4中任一项所述的多发色团，其中所述窄发射受体荧光团被水溶性基团取代。

6.根据1-5中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述窄发射受体荧光团是通过非共轭连接子与所述捕光多发色团的共聚单体共价连接的侧基。

7.根据1-6中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述窄发射受体荧光团是荧光半导体纳米晶体或量子点。

8.根据1-7中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述窄发射受体荧光团是小分子荧光团。

9.根据8所述的聚合物串联染料，其中所述小分子荧光团是BODIPY染料。

10.根据9所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(I)所示：

其中：

Q是C或N；

R

任选地，选自R

L

Z

Y

其中Y

11.根据10所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(IIa)或(IIb)所示：

其中：

Z

每个i均独立地为0-3；以及

每个R

12.根据11所述的聚合物串联染料，其中Z

13.根据11或12所述的聚合物串联染料，其中Z

其中：

X是O或S；

Y是O、S或NR，其中R是H、烷基、被取代的烷基；以及

R

14.根据10-13中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(IIIa)或(IIIb)所示：

其中：

X是O或S；以及

R

15.根据10-13中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(IVa)或(IVb)所示：

其中：

每个X均是O或S；以及

R

16.根据10-15中任一项所述的聚合物串联染料，其中R

17.根据16所述的聚合物串联染料，其中L

18.根据16-17中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(V)所示：

其中：

L

R

每个R

t是0-4。

19.根据18所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(Va)所示：

20.根据18或19所述的聚合物串联染料，其中：

R

R

21.根据20所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(VIa)或(VIb)所示：

其中：

*是键合所述捕光多发色团的重复单元或化学选择性官能团的键合点。

22.根据10-15中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(VIIa)或(VIIb)所示：

其中：n是0-12。

23.根据10-14中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(VIII)所示：

24.根据23所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(VIIIa)所示：

其中：

L

每个R

t是0-4。

25.根据15所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(IX)所示：

其中：

每个R

t是0-4。

26.根据25所述的聚合物串联染料，其中所述BODIPY染料的结构式如式(IXa)所示：

其中L

27.根据10-26中任一项所述的聚合物串联染料，其中L

其中：

L

R

L

t是0-4；以及

每个R

28.根据10-27中任一项所述的聚合物串联染料，其中Y

29.根据10-28中任一项所述的聚合物串联染料，其中Y

30.根据29所述的聚合物串联染料，其中Y

31.根据30所述的聚合物串联染料，其中Y

其中：

s是1-6；

q是0至50(例如，1至50、1至30、2至30、4至30、6至30等)；以及

R

32.根据1-31中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料的结构式如式(XIIa)所示：

其中：

F

M

N

G

w、x、y和z表示所述单元在所述多发色团中的摩尔百分比。

33.根据1-32中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团包括结构如式(XI)所示的共轭链段：

其中：

F

M

n是介于1至100,000之间的整数；以及

*表示用于共价连接至共轭聚合物的不饱和骨架或末端基的位点。

34.根据32-33中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料的结构如式(XIII)所示：

其中：

F

M

N

a-d和f各自独立地为0或1；

e是1；

每个n和m均是介于1至10,000之间的整数；

p是介于1至100,000之间的整数；以及

G

35.根据34所述的聚合物串联染料，其中所述聚合物串联染料的结构如式(XIVa)或(XIVb)所示：

36.根据32-35中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述稠合三环共聚单体的结构式如下：

其中：

Y

每个Z均独立地为CH、CR

每个R

每个R

*表示用于共价连接至共轭聚合物的不饱和骨架或末端基的位点。

37.根据36所述的聚合物串联染料，其中所述稠合三环共聚单体的结构式如下：

38.根据37所述的聚合物串联染料，其中所述稠合三环共聚单体选自以下各项：

其中：

Y

每个R

39.根据32-38中任一项所述的聚合物串联染料，其中M

40.根据1-39中任一项所述的聚合物串联染料，其中所述多发色团和/或所述窄发射受体荧光团的多种共单聚体被一个或更多个独立地选自以下各项的水增溶性基团(WSG)取代：

其中：

T

每个T

R

每个s均是介于1至50之间的整数。

41.一种用于多路复用荧光信号生成的组合物，所述组合物包含：

根据权利要求1-40中任一项所述的具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料；以及

具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长的第二聚合物串联染料。

42.根据41所述的组合物，其中所述第一窄发射光谱的半峰全宽(FWHM)的宽度为25nm或更小。

43.根据41或42所述的组合物，其中所述第二最大发射波长不同于第一最大发射波长，且两者相差20nm或更多。

44.根据41-43中任一项所述的组合物，进一步包含一种或更多种其他聚合物串联染料，每种均具有不同的最大发射波长。

45.根据41-44中任一项所述的组合物，其中所述第二和所述一种或更多种其他聚合物串联染料各自独立地为根据权利要求1-40中任一项所述的聚合物串联染料。

46.根据45所述的组合物，其中所述组合物包含三种或更多种聚合物串联染料，每种均具有范围为480nm至700nm的不同且不重叠的发射光谱。

47.根据41-46中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的每种聚合物串联染料都能够采用单个光源激发以提供正交可检测的荧光发射。

48.根据41-47中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二聚合物串联染料与特异性结合成员连接。

49.根据41-48中任一项所述的组合物，其中所述组合物是水性组合物。

50.一种已标记的特异性结合成员，其包含：

聚合物串联染料，其包含：

水溶性捕光多发色团；以及

经配置在能量接收时接近所述捕光多发色团的窄发射受体荧光团；以及

与所述聚合物串联染料连接的特异性结合成员。

51.根据50所述的已标记的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体。

52.根据51所述的已标记的特异性结合成员，其中所述特异性结合成员是抗体片段或其结合衍生物。

53.根据52所述的已标记的特异性结合成员，其中所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')

54.根据50-53中任一项所述的已标记的特异性结合成员，其中所述窄发射受体荧光团是BODIPY染料。

55.根据50-54中任一项所述的已标记的特异性结合成员，其中所述聚合物串联染料是根据权利要求2-40中任一项所述的染料。

56.一种用于对靶分子进行多路复用检测的组合物，所述组合物包含：

(a)第一已标记的特异性结合成员，其包含：

(i)具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料，其包含：

水溶性捕光多发色团；以及

经配置在能量接收时接近所述捕光多发色团的窄发射受体荧光团；以及

(ii)与第一靶分子特异性结合并与所述第一聚合物串联染料连接的第一特异性结合成员；以及

(b)第二已标记的特异性结合成员，其包含：

(i)具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长的第二聚合物串联；以及

(ii)与第二靶分子特异性结合并与所述第二聚合物串联染料连接的第二特异性结合成员。

57.根据56所述的组合物，其中所述第一窄发射光谱的半峰全宽(FWHM)的宽度为25nm或更小。

58.根据56或57所述的组合物，其中所述第二最大发射波长不同于第一最大发射波长，且两者相差20nm或更多。

59.根据56-58中任一项所述的组合物，进一步包含一种或更多种其他已标记的特异性结合成员，每种均包含具有不同的最大发射波长的聚合物串联染料。

60.根据56-59中任一项所述的组合物，其中所述第二和所述一种或更多种已标记的特异性结合成员各自独立地包含根据1-40中任一项所述的聚合物串联染料。

61.根据60所述的组合物，其中所述组合物包含三种或更多种已标记的特异性结合成员，每种均独立地包含具有范围为480nm至700nm的不同且不重叠的发射光谱的聚合物串联染料。

62.根据56-61中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的每种聚合物串联染料都能够采用单个光源激发以提供正交可检测的荧光发射。

63.根据56-62中任一项所述的组合物，其中所述第一和第二已标记的特异性结合成员分别与第一和第二靶蛋白特异性结合。

64.根据56-63中任一项所述的组合物，其中特异性结合成员各自为抗体。

65.根据56-64中任一项所述的组合物，其中特异性结合成员各自为抗体片段或其结合衍生物。

66.根据65所述的组合物，其中所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')

67.根据56-66中任一项所述的组合物，其中所述组合物是水性组合物。

68.一种评估样品中是否存在靶标分析物的方法，所述方法包含：

(a)使所述样品与特异性结合所述靶标分析物的已标记的特异性结合成员接触，以产生标记组合物接触样品，其中所述已标记的特异性结合成员包含：

(i)根据权利要求1-40中任一项所述的聚合物串联染料；以及

(ii)与所述聚合物串联染料连接的特异性结合成员；以及

(b)测定所述标记组合物接触样品中是否存在已标记的特异性结合成员-靶标分析物结合复合物，以评估所述样品中是否存在所述靶标分析物。

69.根据68所述的方法，其进一步包含使所述样品与第二特异性结合成员接触，所述第二特异性结合成员其已结合支持物且与靶标分析物特异性结合。

70.根据69所述的方法，其中所述支持物包含磁粉。

71.根据68-70中任一项所述的方法，其中所述靶标分析物与细胞缔合。

72.根据71所述的方法，其中所述靶标分析物是细胞的细胞表面标记物。

73.根据72所述的方法，其中所述细胞表面标记物选自由细胞受体和细胞表面抗原组成的组。

74.根据71所述的方法，其中所述靶标分析物是细胞内靶标，且所述方法进一步包含裂解细胞。

75.根据68-74中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括通过流式细胞术分析荧光标记的靶标分析物。

76.根据68-75中任一项所述的方法，其中所述接触步骤包含使所述样品与多路复用组合物接触，所述组合物包含：

(a)第一已标记的特异性结合成员，其包含：

(i)具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料，其包含：

水溶性捕光多发色团；以及

经配置在能量接收时接近所述捕光多发色团的窄发射受体荧光团；以及

(ii)与第一靶标分析物特异性结合并与所述第一聚合物串联染料连接的第一特异性结合成员；以及

(b)第二已标记的特异性结合成员，其包含：

(i)具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长的第二聚合物串联；以及

(ii)与第二靶标分析物特异性结合并与所述第二聚合物串联染料连接的第二特异性结合成员。

77.根据76所述的方法，其中所述多路复用组合物是根据56-67中任一项所述的组合物。

78.一种标记靶分子的方法，所述方法包含：

使靶分子与聚合物串联染料接触，以产生已标记的靶分子，其中：

所述聚合物串联染料是根据权利要求1-40中任一项所述的染料，且包含与所述靶分子共价连接的共轭标签。

79.根据78所述的方法，其中所述聚合物串联染料的结构式如下：

其中所述多发色团的结构式如式(XIII)所示：

其中：

F

M

N

a-d和f各自独立地为0或1；

e是1；

每个n和m均是介于1至10,000之间的整数；

p是介于1至100,000之间的整数；

G

G

80.根据78或79所述的方法，其中所述聚合物串联染料具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱，所述方法进一步包含：

使第二靶分子与包含共轭标签的第二聚合物串联染料接触，以产生第二已标记的靶分子，其中：

所述第二聚合物串联染料具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长。

81.根据80所述的方法，其中所述第二聚合物串联染料是根据权利要求1-40中任一项所述的染料，且包含与所述第二靶分子共价连接的共轭标签。

82.根据80-81中任一项所述的方法，其中靶分子各自为蛋白。

83.根据80-82中任一项所述的方法，其中靶分子各自为抗体。

84.根据80-82中任一项所述的方法，其中靶分子各自为抗体片段或其结合衍生物。

85.根据84所述的方法，其中所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')

86.根据80-85中任一项所述的方法，进一步包含将所述已标记的靶分子并入水性组合物中。

87.一种用于多路复用荧光信号生成的试剂盒，其包含：

根据权利要求1-40中任一项所述的具有第一最大发射波长和第一窄发射光谱的第一聚合物串联染料；以及

具有与所述第一窄发射光谱正交的第二最大发射波长的第二聚合物串联染料。

88.根据87所述的试剂盒，其中所述第一窄发射光谱的半峰全宽(FWHM)的宽度为25nm或更小。

89.根据87或88所述的试剂盒，其中所述第二最大发射波长不同于第一最大发射波长，且两者相差20nm或更多。

90.根据87-89中任一项所述的试剂盒，进一步包含一种或更多种其他聚合物串联染料，每种均具有不同的最大发射波长。

91.根据87-90中任一项所述的试剂盒，其中所述第二和所述一种或更多种其他聚合物串联染料各自独立地为根据1-40中任一项所述的聚合物串联染料。

92.根据91所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含三种或更多种(4种或更多、5种或更多，甚至更多)聚合物串联染料，每种均具有范围为480nm至700nm的不同且不重叠的发射光谱。

93.根据87-92中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒中的每种聚合物串联染料都能够采用单个光源激发以提供正交可检测的荧光发射。

94.根据87-93中任一项所述的试剂盒，其中所述第一和第二聚合物串联染料各自与特异性结合成员(与靶分子特异性结合)连接。

95.根据94所述的试剂盒，其中特异性结合成员各自为抗体。

96.根据94所述的试剂盒，其中特异性结合成员各自为抗体片段或其结合衍生物。

97.根据96所述的试剂盒，其中所述抗体片段或其结合衍生物选自由Fab片段、F(ab')

在至少一些前述实施例中，一实施例中使用的一个或更多个元件可以在另一实施例中互换使用，除非这种替换在技术上不可行。本领域技术人员应当理解，在不脱离所主张的标的的情况下，可对上述方法和结构进行各种其他省略、添加和修改。所有这些修改和变更内容都旨在被所附权利要求书中定义的标的范围覆盖。

本领域技术人员应当理解，一般而言，本文使用的术语，特别是所附权利要求书中(例如，在所附权利要求书的主体部分中)使用的术语，通常应理解为“开放”术语(例如，术语“包括”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应解释为“至少具有”等)。本领域技术人员还应理解，如果意在所引入的权利要求中标明具体数目，则这种意图将在该权利要求中明确指出，而在无这种明确标明的情况下，则视为不存在这种意图。例如，为帮助理解，所附权利要求可能使用了引导短语“至少一个”和“一个或更多个”来引入权利要求中的特征。然而，这种短语的使用不应被解释为暗示着由不定冠词“一”或“一个”引入的权利要求特征将含有该特征的任意特定权利要求限制为仅含有一个该特征的实施例，即便是该权利要求既包括引导短语“一个或更多个”或“至少一个”又包括不定冠词如“一”或“一个”(例如，“一”和/或“一个”应当被解释为意指“至少一个”或“一个或更多个”)；在使用定冠词来引入权利要求中的特征时，同样如此。另外，即使明确指出了所引入权利要求特征的具体数目，本领域技术人员应当认识到，这种列举应解释为意指至少是所列数目(例如，不存在其他修饰语的短语“两个特征”意指至少两个该特征，或者两个或更多该特征)。另外，在使用类似于“A、B和C等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有A、B和C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C的系统等)。在使用类似于“A、B或C等中至少一个”这样的表述的情况下，一般来说应该按照本领域技术人员通常理解该表述的含义来予以解释(例如，“具有A、B或C中至少一个的系统”应包括但不限于单独具有A、单独具有B、单独具有C、具有A和B、具有A和C、具有B和C和/或具有A、B和C的系统等)。本领域技术人员还应当理解，实质上任意表示两个或更多可选项目的转折连词和/或短语，无论是在说明书、权利要求书还是附图中，都应被理解为给出了包括这些项目之一、这些项目任一方或两个项目的可能性。例如，短语“A或B”应当被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。

另外，在以马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员应当认识到，本发明因此也是以该马库什组中的任意单独成员或成员子组来描述的。

本领域技术人员应当理解，出于任意和所有目的，例如为了提供书面说明，本文所揭示的所有范围也包含任意及全部可能的子范围及其子范围的组合。任意列出的范围可被轻易地视作充分描述且实现了将该范围至少进行二等分、三等分、四等分、五等分、十等分等。作为非限制性示例，在此所讨论的每一范围均可被轻易地分成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员应当理解，所有诸如“直至”、“至少”、“大于”、“小于”之类的语言包括所列数字，并且指代了随后可以如上所述被分成子范围的范围。最后，本领域技术人员应当理解，范围包括每一单独数字。因此，例如具有1-3个单元的组是指具有1、2或3个单元的组。类似地，具有1-5个单元的组是指具有1、2、3、4或5个单元的组，以此类推。

尽管为了达到清晰理解的目的采用图示和示例的方式详细描述了前述发明，但是鉴于本发明的教学意义，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是，在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可对其进行特定的变更和修改。

因此，前述内容仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种结构，尽管这里没有明确表述或示出，但这些设计反应了本发明的原理，未超出本发明的精神和范围。此外，本文列举的所有示例和条件语言主要为了帮助读者理解本发明的原理和发明人为进一步拓展本领域所提供的构想，并且应解释为不受这些具体列举的示例和条件的限制。而且，本文中引用本发明的原理、方面和实施例及其特定示例的所有陈述旨在涵盖其在结构和功能上的等同物。此外，所述等同物拟包括目前已知的等同物和日后待开发的等同物，即，开发出的任何功能相同且不考虑其结构的元件。而且，无论在权利要求书中是否明确叙述了本发明的公开内容，都不会向公众披露其中的任何内容。

因此，本发明的范围并不限于本文中显示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神通过所附权利要求书体现。在权利要求书中，只有当权利要求书的限制内容开头明确使用短语“用于……的手段”或“用于……的步骤”时，《美国法典》第35章第112节(f)或《美国法典》第35章第112节(6)明确定义为被援引；如果权利要求书的限制内容中未使用所述短语，则《美国法典》第35章第112节(f)或《美国法典》第35章第112节(6)未被援引。