具有由多种电纺纤维形成的棉絮状结构的骨再生材料

发明背景

发明领域

本发明涉及骨再生材料，具体涉及由包含β-磷酸三钙和骨形态发生蛋白的可生物降解纤维形成的骨再生材料。

背景技术

磷酸钙(特别是β-磷酸三钙，β-TCP)已广泛用于骨再生应用，因为它表现出骨传导(osteoconductive)特性。钙和磷离子的释放调节成骨细胞和破骨细胞的活化以促进骨再生。磷酸钙的表面特性和孔隙率的控制影响细胞/蛋白质的粘附和生长并调节骨盐的形成。(Jiwoon Jeong等人，“生物活性磷酸钙材料及其在骨再生中的应用(Bioactive calciumphosphate materials and applications in bone regeneration)”，生物材料研究(Biomater.Res.)23,4(2019)doi:10.1186/s40824-018-0149-3)。

本申请的申请人之一使用电纺(electrospin)工艺开发了含有β-TCP的可生物降解纤维，其中纺丝溶液作为细纤维从喷嘴中喷出，并被电场中的静电引力牵拉以沉积在收集器上。使用新型电纺装置，申请人已成功地将此类可生物降解纤维制备成棉絮状(cottonwool-like)结构，其包含β-TCP和可生物降解聚合物(参见美国专利号8,853,298和10,092,650)。棉絮状结构是独特的，并具有以下多个优点：(1)它包含大的组织间隙(interstitialspace)，允许生物流体容易渗透到骨移植结构中，(2)它提供了大的表面积，允许钙和磷从β-TCP中迅速释放到生物流体中；(3)它具有柔性结构，其可制成符合骨修复部位的形状；(4)它提供了大的表面积来支持其他生物活性或骨形态发生因子，如BMP-2。棉絮状复合材料作为骨替代材料的体内和体外评估已证明了其在修复复杂骨缺损方面的优势。

骨形态发生蛋白-2(BMP-2)具有骨诱导作用(osteoinductive)，可以促进骨形成/再生。例如，Infuse

因此，需要能够以允许逐步释放BMP-2但不允许这种生长因子浸出到非预期部位的方式包含BMP-2的骨移植材料。

发明内容

本发明的实施方式涉及包含

电纺可生物降解纤维

可生物降解纤维的直径为约10-100μm，优选约10-60μm，使得直径约1-5μm的钙化合物颗粒(例如，β-TCP和/或SiV颗粒)可以分布在纤维中，并且在骨缺损部位处植入

优选地，

在骨缺损部位处植入

在骨缺损部位处植入

由于BMP-2(例如，rhBMP-2或tBMP-2)与固定在可生物降解纤维表面的β-TCP颗粒结合，防止了BMP-2泄漏到骨缺损区域之外。其结果是，确保了使用

附图说明

图1A-1F显示了

图2显示了SDS-PAGE凝胶图像，其图示了tBMP-2与

图3显示了tBMP-2与几种含钙材料结合的凝胶图像。tBMP2与含有β-TCP和/或SiV的材料(SiV70,ReBOSSIS(85),和ORB-03)结合良好。

图4显示了rhBMP-2与几种含钙材料结合的凝胶图像。rhBMP-2仅保留在包含β-TCP的材料(ReBOSSIS(85)和ORB-03)上，但未保留在包含SiV的材料上。

图5显示了慢性山羊严重缺陷(Chronic Caprine Critical Defect，CCTD)模型的示意图。在前置手术中，在骨骼成熟的雌性山羊中产生了一段5厘米的严重缺陷。将5厘米长×2厘米直径的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)垫片放置在缺损处以诱导生物膜。4周后，将PMMA垫片轻轻移除并替换为移植材料。每4周拍摄正交射线照片(orthogonal radiograph)以评估缺损愈合情况。图中，AP代表头尾向(craniocaudal)，ML代表中间外侧的(mediolateral)。白色箭头表示在PMMA垫片放置处的移植材料。

图6显示了移植手术后8周(A)和12周(B)拍摄的射线照片(中间外侧的(ML)和头尾向的(AP)投影)。每个治疗组6只山羊。与第1组(不含tBMP-2)相比，含tBMP-2的组(第2组和第3组)显示出更高的新骨形成百分比。

图7显示了用固定式X射线机拍摄的12个外植胫骨的射线照片(中间外侧的(ML)和头尾向的(AP)投影)。在较高剂量的tBMP-2组(1.5mg/cc)中获得了大量的新骨。tBMP-2添加到TCP和

图8是渗滤现象的概念图，图示了当β-TCP颗粒的量超过渗滤阈值时β-TCP颗粒簇的形成。图9(A)显示了包含50重量％(24.3体积％)β-TCP颗粒的电纺PLGA纤维的表面。图9(B)显示了包含70重量％(42.9体积％)β-TCP颗粒的电纺PLGA纤维的表面。图9(C)显示了包含80重量％(56.3体积％)β-TCP颗粒的电纺PLGA纤维的表面。图9(D)显示了包含85重量％(64.6体积％)β-TCP颗粒的电纺PLGA纤维的表面。

图10是说明SDS-PAGE分析用样品的收集方法的图。

具体实施方式

本发明的实施方式涉及含有β-TCP和骨形态发生蛋白-2(BMP-2，例如rhBMP-2或tBMP-2)的骨替代材料。此外，本发明的骨替代材料具有棉絮状结构，使得结合在棉絮状结构上的大表面积的BMP-2可以在骨修复部位与生物流体相互作用，从而促进骨诱导过程。

骨诱导包括刺激骨原细胞分化为成骨细胞，然后开始新骨形成。相比之下，当骨移植材料用作新骨生长的支架时，骨传导就会发生，所述新骨生长是由来自缺损部位周围天然骨边缘的现有成骨细胞维持的。

本发明的实施方式可以使用重组BMP-2(例如rhBMP-2)或可靶向的BMP-2。可靶向的BMP-2是与β-TCP结合肽融合的BMP蛋白(即融合蛋白)，因此BMP-2可以与骨替代材料中的β-TCP紧密结合。β-TCP结合肽可以融合到BMP-2的N-末端或C-末端。

BMP-2具有很强的骨形成活性，可用于骨科应用，例如脊柱融合术。然而，如果BMP-2从治疗部位脱逸，BMP-2可能会在非预期部位诱导骨形成。这些BMP-2相关并发症的发生频率相对较高，占病例的20％到70％，并且这些不良反应可能会危及生命。(Aaron W.James等人，“骨形态发生蛋白-2的临床副作用综述(A review of the Clinical Side Effects ofBone Morphogenetic Protein-2)”，组织工程B部修订版(Tissue Eng.Part B Rev.)，2016年，22(4)：284-297)。因此，必须将BMP限制在治疗部位，例如，通过将BMP-2牢固地结合到骨替代/修复材料上，并且不允许BMP-2从治疗部位扩散开。

本发明的实施方式可以使用rhBMP-2或BMP-2融合蛋白，它们各自含有一种或多种β-TCP结合肽。这些BMP-2融合蛋白被称为可靶向的BMP-2或tBMP-2。tBMP-2设计为与含有β-TCP和/或含有SiV的骨替代/修复材料一起使用，其中tBMP-2与β-TCP和/或SiV紧密结合，并且不会从治疗部位扩散开，从而消除不良反应或将不良反应减到最少。

本发明的骨替代/修复材料具有由可生物降解纤维制成的棉絮状结构，所述可生物降解纤维包含β-TCP和生物可降解聚合物(例如，聚(乳酸-共-乙醇酸)；PLGA)。tBMP-2融合蛋白可以与这些棉絮状结构上的β-TCP和/或SiV颗粒紧密结合，并且不会从治疗部位扩散开。

棉絮状结构具有以下几个优点：(1)它包含大的组织间隙，允许生物流体容易渗透到骨移植结构中，(2)它提供了大的表面积，允许钙和磷从β-TCP中迅速释放到生物流体中；(3)它提供了大的表面积来支持/运送其他生物活性或骨形态发生因子，如rhBMP-2或tBMP-2；和(4)它具有柔性结构，可制成符合骨修复部位的形状。

通过将对包含可生物降解聚合物和β-TCP的溶液进行电纺来制造棉絮状结构。在美国专利第8,853,298号和第10,092,650号、美国专利申请公开第2016/0121024号和第2018/0280569号中描述了形成棉絮状结构的细节，其描述通过引用整体并入本文。这些棉絮状材料可从Orthorebirth有限公司(日本横滨)以商品名

在

钙化合物颗粒比PLGA更致密。例如，PLGA的密度为1.01g/cm

表1.β-TCP含量相关性

根据本发明的实施方式，

根据本发明的实施方式，

图1A显示了多根ReBOSSIS(85)纤维(PLGA 30重量％，SiV 30重量％，β-TCP 40重量％)在200倍放大倍数下的图像，显示了棉絮状结构中纤维之间的组织间隙。纤维之间的大间隙体积有利于生物流体的灌注。图1B显示了在2000放大倍数下的一根ReBOSSIS(85)纤维的图像。纤维表面上的钙颗粒很容易辨别。图1C显示了在5000放大倍数下的相同纤维，其中白色箭头表示β-TCP颗粒，黑色箭头表示SiV颗粒。大量暴露在纤维表面的钙颗粒为BMP-2或tBMP-2提供了结合位点。此外，暴露的钙颗粒还促进了重建和新骨形成过程中与破骨细胞和成骨细胞的相互作用。

图1D显示了多根ORB-03纤维(PLGA 30重量％/p-TCP 70重量％)在200放大倍数下的图像，显示了棉絮状结构中纤维之间的组织间隙。纤维之间的大间隙体积有利于生物流体的灌注。图1E显示了在2000放大倍数下的一根ORB-03纤维的图像。纤维表面上的钙颗粒很容易辨别。图1F显示了在5000放大倍数下的相同纤维，其中白色箭头表示β-TCP颗粒。大量暴露在纤维表面的钙颗粒为BMP-2或tBMP-2提供了结合位点。此外，暴露的钙颗粒还促进了重建和新骨形成过程中与破骨细胞和成骨细胞的相互作用。

根据本发明的实施方式，

在骨缺损部位处植入

在骨缺损部位处植入

根据本发明的实施方式，BMP-2(例如，rhBMP-2或tBMP-2)结合至暴露在纤维表面上的β-TCP和/或SiV颗粒，使得BMP-2被捕获到整个棉絮状结构中的

tBMP-2可以用常规分子生物学技术或本领域已知的其他技术(例如β-TCP结合肽与BMP的化学或酶促偶联)产生。例如，可以使用聚合酶链反应(PCR)将β-TCP结合肽的核酸序列连接到BMP的核酸序列。或者，融合蛋白核酸构建体可以是化学合成的。然后将上述融合蛋白构建体置于合适表达载体的限制性位点处。然后将表达载体转染到蛋白质表达体系(例如，大肠杆菌、酵母细胞或CHO细胞)中。然后对表达的蛋白质进行纯化。为了促进蛋白质纯化，可以将特定标签(例如组氨酸标签)构建到表达构建体中。所有这些过程和技术都是惯用的和常规的。本领域技术人员无需过多实验即可实施这些操作。

根据本发明的实施方式，β-TCP结合肽可包含氨基酸序列：LLADTTHHRPWT(SEQ IDNO:1),GQVLPTTTPSSP(SEQ ID NO:2)、VPQHPYPVPSHK(SEQ ID NO:3)、HNMAPATLHPLP(SEQ IDNO:4)、QSFASLTNPRVL(SEQ ID NO:5)、HTTPTTTYAAPP(SEQ ID NO:6)、Q Y GVV SHLTHTP(SEQID NO:7)、TMSNPITSLISV(SEQ ID NO:8)、IGRISTHAPLHP(SEQ ID NO:9)、MNDP SPWLRSPR(SEQ ID NO:10)、QSLGSMFQEGHR(SEQ ID NO:11)、KPLF TRY GD V AI(SEQ ID NO:12)、MPFGARIL SLPN(SEQ ID NO:13)、QLQLSNSMSSLS(SEQ ID NO:14)、TMNMP AKIF A AM(SEQ IDNO:15)、EPTKEYTTSYHR(SEQ ID NO:16)、DLNELYLRSLRA(SEQ ID NO:17)、DYDSTHGAVFRL(SEQID NO:18)、SKHERYPQ SPEM(SEQ ID NO:19)、HTHSSDGSLLGN(SEQ ID NO:20)、NYDSMSEPRSHG(SEQ ID NO:21)、或ANPIISVQTAMD(SEQ ID NO:22)，其公开在美国专利号10,329,327B2中，其公开内容通过引用整体并入本文。

根据本发明的一些实施方式，β-TCP结合肽可包含两个或更多个选自上述序列的序列。所述两个或更多个序列可以直接相互连接，或者与其间散布的短肽接头连接，以形成更长的β-TCP结合肽。

由于β-TCP结合肽的存在，tBMP-2与β-TCP颗粒的结合非常紧密，从而进一步防止tBMP-2泄漏到骨缺损区域之外。其结果是，进一步确保了使用

通过在捏合机中将钙颗粒添加到聚合物中以对生物可降解聚合物和钙颗粒的混合物进行捏合，钙颗粒均匀地分散在基质聚合物中。但是，如果钙颗粒的体积比超过阈值量，由于渗滤现象的发生，颗粒就不能再保持均匀的分散状态，并且开始出现团簇相(见图8)。由于颗粒的团簇相形成，一些钙颗粒暴露在可生物降解纤维的表面上(见图1A-1F)。这使得BMP-2可以与可生物降解纤维上的β-TCP颗粒结合。根据发明人的经验，当钙颗粒的量超过约25体积％时，这种渗滤现象开始出现。

图9A-9D显示了本发明的

根据本发明的方法，从静电纺丝(ES)装置的喷嘴纺出的纤维被喷射到填充有乙醇的收集器中，其中纤维以棉絮状结构的形式被收集。在收集器中，纤维中的溶剂(例如氯仿)通过溶解在乙醇中而被去除。

棉絮状结构为BMP-2结合提供了大的表面积，并为包含可参与骨形成以注入/渗透的细胞的生物流体提供了足够的组织间隙，从而增强了骨诱导过程。

tBMP-2

本发明的一些实施方式使用可靶向的BMP-2(tBMP-2)，其中β-TCP结合肽与BMP2融合。tBMP-2与本发明的发明人之一开发的β-TCP结合肽融合。β-TCP结合肽的详细内容在美国专利公开号10,329,327B2和下述文献中进行了解释：“表皮生长因子(EGF)通过融合到高亲和力、多聚体fi-TCP结合肽与磷酸三钙(3TCP)的系连：对人类多能基质细胞/结缔组织祖细胞的影响(Tethering of Epidermal Growth Factor(EGF)to Beta TricalciumPhosphate(3TCP)via Fusion to a High Affinity,Multimeric fi-TCP bindingPeptide:Effects on Human Multipotent Stromal Cells/Connective TissueProgenitors)”，Alvarez等人，PLoS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0129600,June 29,2015。这些参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。

根据本发明的实施方式，β-TCP结合肽可包含氨基酸序列：LLADTTHHRPWT(SEQ IDNO:1)、GQVLPTTTPSSP(SEQ ID NO:2)、VPQHPYPVPSHK(SEQ ID NO:3)、HNMAPATLHPLP(SEQ IDNO:4)、QSFASLTNPRVL(SEQ ID NO:5)、HTTPTTTYAAPP(SEQ ID NO:6)、Q Y GVV SHLTHTP(SEQID NO:7)、TMSNPITSLISV(SEQ ID NO:8)、IGRISTHAPLHP(SEQ ID NO:9)、MNDP SPWLRSPR(SEQ ID NO:10)、QSLGSMFQEGHR(SEQ ID NO:11)、KPLF TRY GD V AI(SEQ ID NO:12)、MPFGARIL SLPN(SEQ ID NO:13)、QLQLSNSMSSLS(SEQ ID NO:14)、TMNMP AKIF A AM(SEQ IDNO:15)、EPTKEYTT S YHR(SEQ ID NO:16)、DLNELYLRSLRA(SEQ ID NO:17)、DYDSTHGAVFRL(SEQ ID NO:18)、SKHERYPQ SPEM(SEQ ID NO:19)、HTHSSDGSLLGN(SEQ ID NO:20)、NYDSMSEPRSHG(SEQ ID NO:21)、或ANPIISVQTAMD(SEQ ID NO:22)。根据本发明的一些实施方式，β-TCP结合肽可包含两个或更多个选自上述序列的序列。所述两个或更多个序列可以直接相互连接，或者与其间散布的短肽连接，以形成更长的β-TCP结合肽。

根据本发明的实施方式，tBMP中使用的BMP可以包括可靶向的BMP-2和重组人BMP-2(rhBMP-2)。

BMP-2与

根据本发明的实施方式，BMP-2可以结合到

制备了四种样品溶液。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将以下四种样品溶液中的tBMP-2和rhBMP-2的浓度与对照样品进行比较。牛血清白蛋白(BSA)用作对照样品。

具体制备如下试剂：(a)tBMP-2(治疗性TCP结合BMP-2，在10mM醋酸钠、0.1M NaCl中，含或不含0.1M尿素，pH 4.75)；(b)BSA原液：42mg/ml溶解在醋酸盐洗涤缓冲液中(储存在-20℃)；(c)醋酸盐洗涤缓冲液：5mM醋酸钠pH 4.75，100mM NaCl；(d)

方法：结合20μg tBMP-2或BSA/mg

制备

1.在离心管中称取10mg

2.准备BSA：取29μl BSA原液并添加971μl醋酸盐缓冲液，以获得pH 4.75、1.22mg/ml的稀释的BSA溶液。

3.通过在每个管中添加500μl醋酸盐洗涤缓冲液，在醋酸盐洗涤缓冲液中预洗

4.凝胶样品：留出一些BSA加载物和tBMP2加载物用于以后的SDS-PAGE分析。

试验

5.将200μg tBMP2添加到10mg经预洗的

6.将200μg BSA添加到10mg经预洗的

示例设置

7.结合30分钟(20分钟时结合基本完成)；

收集未结合的物质

8.在微量离心机中管以最高速度离心4-5分钟。

9.将移液管插入管顶部的上清液中，然后用移液管将未结合物移入管中。(注意：确保不要让

洗涤

10.添加500μl的PBS或醋酸盐洗涤缓冲液；

11.温和涡旋。颠倒混合5分钟，然后再次温和涡旋；

12.在微量离心机中管以最高速度离心4-5分钟以进行提取洗涤。保持洗涤；

洗脱

13.通过添加164μl非还原性IX SDS PAGE凝胶染料(不含b-巯基乙醇，因为这会破坏BMP2二聚体)进行洗脱；

14.温和涡旋，孵育5分钟，重复涡旋；

15.在微量离心机中管以最高速度离心4-5分钟以

16.按如下加载凝胶：

用于SDS PAGE分析的样品按如下标记(如图10所示)：

Ld：加载含有已知量的tBMP-2或BSA的样品溶液。

FT：通过收集在将Ld提供给

W：在提供洗涤缓冲液后，通过收集通过含有蛋白质的

·如果与

·假设植入部位的pH条件为酸性或中性，制备两种类型的洗涤缓冲液(PBS pH7.0和醋酸盐缓冲液pH 4.5)并用于进行实验。

EL：在用洗涤缓冲液洗涤后，通过收集将洗脱缓冲液提供至

蛋白质结合的评估(SDS-PAGE)

在SDS-PAGE上评估tBMP-2(或BSA)与

在这个实验中，凝胶图像是通过肉眼观察来比较的。泳道中显示的蓝色条带是通过用蓝色染料对蛋白质(tBMP2或BSA)进行染色产生的。条带越密表示蛋白质的量越多。

SDS-PAGE在130V的恒定电压下进行。使用NuPAGE 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶,1.0mm,12孔(生命技术公司(Life Technologies),目录号NP0322BOX)，并使用NuPAGE MOPSSDS运行缓冲液(20X)(生命技术公司,目录号NP0001)作为电泳缓冲液。为了在电泳完成后对蛋白质进行染色，使用了Gelcode蓝色安全蛋白染色剂(Gelcode Blue Safe ProteinStain)(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，目录号24596)。

如图2所示，A版块显示使用酸性缓冲液(醋酸盐缓冲液)作为洗涤缓冲液获得的凝胶图像，B版块显示使用中性缓冲液(PBS)作为洗涤缓冲液获得的凝胶图像。在每个凝胶图像中，右侧四个泳道显示了tBMP-2的分析结果，左侧四个泳道显示了BSA的分析结果。

在Ld泳道(加载样品)中，可以识别tBMP-2和BSA的主带的位置。如果tBMP-2或BSA包含在FT、W或EL泳道中，则其条带预计会出现在与Ld泳道相同的位置。

在图2中，虚线包围的区域显示了在条件A下使用BSA制备的样品的凝胶图像。BSA主带的位置用矩形实线框表示，表示为BSA主带。通过比较每个泳道中BSA主带的强度，很明显FT和Ld泳道显示相似水平的蛋白质，表明大多数BSA并未结合

在中性pH缓冲液(B版块)中，BSA显示出与

相比之下，tBMP-2与

从该实验中证实，tBMP-2可以与

从该实验中证实，在中性和酸性条件下，超过98％的tBMP-2结合并保留在

tBMP-2和rhBMP-2(Infuse)之间的保留比较

该实验是为了比较tBMP-2和rhBMP-2(INFUSE)与

PLGA：聚(乳酸-共-乙醇酸)

SiV：含硅氧烷的球霰石(一种形式的碳酸钙，CaCO3)

β-TCP：β-磷酸三钙

结合方案如上所述。图3显示了tBMP-2与各种材料结合的结果。在含有β-TCP和/或SiV(含硅氧烷的球霰石)的材料(SiV70、ReBOSSIS(85)和ORB-03)上，tBMP-2得到很好的保留。tBMP-2的保留明显不同于BSA的保留。

图4显示了重组人BMP-2(rhBMP-2)的结果。rhBMP-2仅保留在包含β-TCP的材料上(ReBOSSIS(85)和ORB-03)，但并未保留在包含SiV的材料上。tBMP-2的结合强于rhBMP-2的结合。尽管如此，rhBMP2仍然可以很好地用于

ReBOSSIS/tBMP2在慢性山羊胫骨缺损(CCTD)模型中的评估

为了评估

研究设计

动物选择

十二(12)只体重在40-60kg之间的雌性西班牙波尔山羊(Spanish Boer goats)用于该研究。它们被分为以下三个实验组：

·第1组一仅TCP+

·第2组－

·第3组－

TCP，磷酸三钙颗粒；BMA，骨髓穿刺液

CCTD模型

CCTD是由Muschler博士(克利夫兰诊所)、Pluhar博士(明尼苏达大学)、Bechtold博士(明尼苏达大学)和Wenke博士(ISR)构思和开发的。CCTD模型旨在为大型动物模型“提高标准”(raise the bar)，并更好地匹配具有挑战性的临床生物学环境，在这些环境中，当前对大型骨缺损的治疗继续以不可接受的频率失败。

CCTD模型涉及骨的临界尺寸(5cm)的节段性胫骨缺损。

CCTD模型与急性缺陷模型的区别有几个特点：

1.从缺损部位的每一端去除2厘米的骨膜，形成9厘米的骨膜段(5厘米缺损+两侧2厘米)，

2.在缺损部位周围的10g骨骼肌，

3.髓内管扩孔，去除邻近缺损部位的骨髓和骨内膜骨，以及

4.在移植前将PMMA垫片放置在缺损处4周。这允许间隔物被纤维状的“诱导膜”(IM)或“马思坤雷特膜”(Masquelet membrane)包裹。

5.每只动物都要经历两次手术，这里定义为创造这些生物条件的“前置手术”和“治疗手术”，其中可以实施临床相关治疗方案。

图5显示了慢性山羊严重胫骨缺损(Chronic Caprine Critical Tibial Defect，CCTD)模型的示意图。在前置手术中，在骨骼成熟的雌性山羊中产生了一段5厘米的严重缺陷。将5厘米长×2厘米直径的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)垫片放置在缺损处以诱导生物膜。4周后，将PMMA垫片轻轻移除并替换为移植材料。每4周拍摄正交射线照片以评估缺损愈合情况。图中，AP代表头尾向的(craniocaudal)，ML代表中间外侧的(mediolateral)。白色箭头表示在PMMA垫片放置处的移植材料。

前置手术包括以下基本特征：

1.创建前内侧皮肤切口并切除5厘米的胫骨骨干和骨膜段。

2.在近端和远端骨段上再切除2cm的骨膜。

3.10cm

4.使用定制的垫片夹放置互锁髓内钉，以保持5厘米的缺损。

5.在缺损中的钉子周围放置一个预成型的5厘米长×2厘米直径的PMMA垫片。

6.用生理(0.9％)盐水冲洗伤口和伤口闭合。

前置手术4周后进行的治疗手术包括：

1.在胫骨的前内侧打开先前的皮肤切口。

2.使用“炸弹舱门开口(bomb bay door opening)”打开PMMA垫片周围的“诱导膜”。

3.在不损坏膜或钉子的情况下移除垫片。

4.收集如下定义的适当组织样本。

5.将适当的治疗放入缺损处。

6.用3-0尼龙闭合诱导膜以提供内在标记(intrinsic marker)和伤口闭合。

射线照相分析：

在垫片手术(第0周)、移植手术(第4周)和后续(第8周和第12周)之后，对胫骨、前后向的(AP)和中间外侧的(ML)投影进行透视成像。在移植手术后12周进行安乐死(解剖软组织后)后获得射线照片。

样品制备

样品组成：

将tBMP2结合至

1.在无菌环境中，在培养皿中梳理50cc

2.向

3.使用10mL移液器取出30mL结合缓冲液，垂直握住移液器并将吸头推到该位置的表面。把吸头放在表面上，小心地吸取液体。将移液器移到其他区域以确保收集尽可能多的液体。监控回收体积；

4.将40mL无菌PBS添加到

5.如步骤3所述，使用10mL移液管取出40mL PBS，将PBS储存在50mL锥形管中；

6.重复一遍步骤4-5；

7.将盖子放在培养皿上，并在边缘封上封口膜，以保持

将tBMP2结合至TCP

1.测量所需量的TCP并放入无菌管中。

2.通过用70％乙醇填充管并孵育2-4小时或过夜来对TCP进行消毒。

3.用无菌双去离子水清洗TCP三遍，以去除乙醇。

4.在TCP结合缓冲液(10mM醋酸钠pH 4.75，100mM NaCl)中洗涤TCP 5分钟，同时轻轻搅拌。

5.用无菌PBS清洗TCP以去除TCP结合缓冲液。

6.将适量的tBMP2添加到管中的TCP中。

7.添加足以覆盖TCP的TCP结合缓冲液。

8.温和混合2小时。

9.用PBS清洗两遍以去除TCP结合缓冲液。

10.将tBMP-2/TCP储存在4℃的无菌容器中。

手术时间

1.打开一个含有

2.找到同一培养皿的一个角落，倒出5立方厘米的tBMP-2涂覆的TCP。然后将6立方厘米的骨髓穿刺液涂在TCP上并均匀分布。

3.使用无菌刮刀将tBMP-2/TCP/BMA转移到

4.用戴手套的无菌手轻轻填塞上述的tBMP-2/TCP/BMA，使其像一层细鹅卵石一样均匀分布在

5.像卷饼一样轻轻地卷起

结果

移植后X光片显示，第1组

图7显示了用固定式X射线机拍摄的12个外植胫骨的射线照片(中间外侧的(ML)和头尾向的(AP)投影)。在较高剂量的tBMP-2组(1.5mg/cc)中获得了大量的新骨。

如这些结果所示，

虽然已经用有限数量的示例说明了本发明的实施方式。但是本领域技术人员应理解，在不偏离本发明范围的情况下，其他改变和变化是可能的。因此，保护范围应仅由所附权利要求书限定。

SEQUENCE LISTING

<110> 奥梭瑞贝斯株式会社

赛瑞达普提孚股份有限公司

<120> 具有由多种电纺纤维形成的棉絮状结构的骨再生材料

<130> Nino-012PCT

<150> 62/784,746

<151> 2018-12-25

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

Leu Leu Ala Asp Thr Thr His His Arg Pro Trp Thr

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

Gly Gln Val Leu Pro Thr Thr Thr Pro Ser Ser Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

Val Pro Gln His Pro Tyr Pro Val Pro Ser His Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

His Asn Met Ala Pro Ala Thr Leu His Pro Leu Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

Gln Ser Phe Ala Ser Leu Thr Asn Pro Arg Val Leu

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

His Thr Thr Pro Thr Thr Thr Tyr Ala Ala Pro Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

Gln Tyr Gly Val Val Ser His Leu Thr His Thr Pro

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

Thr Met Ser Asn Pro Ile Thr Ser Leu Ile Ser Val

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

Ile Gly Arg Ile Ser Thr His Ala Pro Leu His Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

Met Asn Asp Pro Ser Pro Trp Leu Arg Ser Pro Arg

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

Gln Ser Leu Gly Ser Met Phe Gln Glu Gly His Arg

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

Lys Pro Leu Phe Thr Arg Tyr Gly Asp Val Ala Ile

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

Met Pro Phe Gly Ala Arg Ile Leu Ser Leu Pro Asn

1 5 10

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

Gln Leu Gln Leu Ser Asn Ser Met Ser Ser Leu Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

Thr Met Asn Met Pro Ala Lys Ile Phe Ala Ala Met

1 5 10

<210> 16

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

Glu Pro Thr Lys Glu Tyr Thr Thr Ser Tyr His Arg

1 5 10

<210> 17

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

Asp Leu Asn Glu Leu Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Ala

1 5 10

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

Asp Tyr Asp Ser Thr His Gly Ala Val Phe Arg Leu

1 5 10

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

Ser Lys His Glu Arg Tyr Pro Gln Ser Pro Glu Met

1 5 10

<210> 20

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

His Thr His Ser Ser Asp Gly Ser Leu Leu Gly Asn

1 5 10

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

Asn Tyr Asp Ser Met Ser Glu Pro Arg Ser His Gly

1 5 10

<210> 22

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

Ala Asn Pro Ile Ile Ser Val Gln Thr Ala Met Asp

1 5 10