敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。

背景技术

裂殖壶菌(Schizochytrium)作为多不饱和脂肪酸(PUFAs)的优质生产者，因其生长速度快、油脂含量高、DHA比例高，是工业化生产PUFAs和DHA的代表性菌株。国内外科学家对于裂殖壶菌中PUFAs的合成机制进行了广泛的研究，发现裂殖壶菌PUFAs合成的途径包括脂肪酸合成酶(FAS)途径和聚酮合成酶(PKS)途径，其中裂殖壶菌DHA合成被认为主要与PKS途径有关。最近的研究发现裂殖壶菌中DHA的生产不仅仅取决于DHA的合成过程，还取决于DHA合成后迁移、积累和储存的装配形式。裂殖壶菌中DHA的储存形式主要为甘油三酯，还有的是以磷脂和甾醇酯形式存在，甘油酯、磷脂和甾醇酯相互转化的过程中也会伴随着脂肪酸的迁移，其过程与磷脂代谢密切相关。因此优化裂殖壶菌的磷脂代谢过程对于裂殖壶菌DHA合成具有重要意义。

磷脂酶D专一性水解磷脂中的磷酸二酯键，主要催化两类反应：(1)水解反应；(2)转磷脂酰反应。磷脂酶D能够通过水解作用调节TAG和磷脂的分配，也能够通过转磷脂酰作用使不同类型磷脂之间发生转化。调控磷脂酶D的表达会影响裂殖壶菌的磷脂代谢，进而会对裂殖壶菌的油脂及DHA合成产生影响。但截止目前还没有在裂殖壶菌中调控磷脂酶D影响裂殖壶菌油脂合成和脂质储存形式的报道。

发明内容

本发明的目的在于从一定程度上解决了现有技术的不足之处，提供了敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株及其构建方法和应用。本发明以Schizochytriumlimacinum SR21为原始菌株，通过敲除PLD基因来调控裂殖壶菌脂质储存形式，进而加强DHA的合成。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种敲除磷脂酶D(PLD)基因的裂殖壶菌基因工程菌株，所述基因工程菌株是以Schizochytrium limacinum SR21为原始菌株构建而成，所述基因工程菌株的基因组中PLD基因被敲除，降低了所述基因工程菌株中的PLD表达水平。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：

一种敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法，包括：

(1)克隆来源于野生型菌株Schizochytrium limacinum SR21基因组中PLD基因的上下游同源臂，插入到pBlue-zeo质粒的同源重组区域，构建以博来霉素为抗性的PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD；

(2)用所述PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD的同源重组区域线性化后，电转化导入Schizochytrium limacinum SR21感受态细胞中，获得敲除磷脂酶D基因PLD的裂殖壶菌基因工程菌株。

进一步地，所述步骤(1)中，PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD的构建方法包括：根据裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21的PLD基因的序列信息，设计如SEQ ID No.3～SE1 ID No.6所示的引物，通过PCR扩增得到PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂；将得到的PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂依次与质粒pBlue-zeo经酶切、连接后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，获得所述敲除载体pBlue-zeo-PLD。

进一步地，所述步骤(2)中，敲除磷脂酶D基因PLD的裂殖壶菌基因工程菌株的构建方法包括：提取pBlue-zeo-PLD敲除载体质粒，经双酶切线性化后，电击转化导入裂殖壶菌感受态中进行同源重组，经博来霉素抗性平板筛选得到阳性转化子，利用PCR进行验证，最终获得敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株。

其中：

SEQ ID No.1：SR21基因组中PLD基因的上游同源臂序列

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SEQ ID No.2：SR21基因组中PLD基因的下游同源臂序列

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本发明解决其技术问题所采用的技术方案之三是：

一种上述的敲除磷脂酶D基因的裂殖壶菌基因工程菌株在合成DHA中的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之四是：

一种应用上述构建的敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株生产DHA的方法，将所述敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种至种子培养基活化，得到发酵用菌种；将所述发酵用菌种接种至发酵培养基中进行发酵培养；收集菌体进行油脂组分鉴定分析，获得DHA。

进一步地，获得所述发酵用菌种的方法如下：首先，将敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株接种于固体种子培养基上，在27～29℃条件下静置培养，进行活化；然后，挑取形态饱满的单菌落接种至液体种子培养基，在27～29℃，150～250rpm条件下培养，得到一级种子；最后，将所述一级种子以2％～10％的接种量接种至新的液体种子培养基，在27～29℃，150～250rpm条件下培养，获得二级种子，作为所述发酵用菌种；将二级种子以2％～10％的接种量接种至发酵培养基，在27～29℃，150～250rpm条件下培养，培养过程中取样进行油脂组分鉴定分析，获得DHA。

进一步地，所述固体种子培养基配方为：葡萄糖29～31g/L、酵母粉9～11g/L、20×无机盐组分A 48～52mL、500×CaCl

进一步地，所述液体种子培养基配方为：葡萄糖29～31g/L、酵母粉9～11g/L、20×无机盐组分A 48～52mL、500×CaCl

进一步地，所述发酵培养基配方为：葡萄糖88～92g/L、玉米浆粉4～6g/L、胰蛋白胨4～6g/L、20×无机盐组分A 48～52mL、500×CaCl

其中，所述20×无机盐组分A包括：NaSO

其中，所述500×CaCl

本发明所涉及的设备、试剂、工艺、参数等，除有特别说明外，均为常规设备、试剂、工艺、参数等，不再作实施例。

本发明所列举的所有范围包括该范围内的所有点值。

本发明中，所述“室温”即常规环境温度，可以为10～30℃。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

本发明以Schizochytrium limacinum SR21为野生型菌株，在大肠杆菌中构建以PLD基因两端序列为同源臂、博来霉素为筛选标记的PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD，并将功能片段通过电转化导入裂殖壶菌基因组中进行同源重组，得到一株敲除PLD基因的裂殖壶菌工程菌株，提高了DHA的产量，为基因工程调控裂殖壶菌高产DHA提供了新的思路。

附图说明

图1为基因敲除载体pBlue-zeo示意图。

图2为PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD示意图。

图3为基因工程菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图。其中，PC为阳性对照，NC为阴性对照，M为marker，PT为敲除菌株。

图4为Schizochytrium limacinum SR21野生型菌株与基因工程菌株的PLD基因RT-qPCR的结果分析图。

图5为Schizochytrium limacinum SR21野生型菌株与基因工程菌株的DHA产量对比图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明实施例所采用的培养基如下：

固体种子培养基：葡萄糖29～31g/L，酵母粉9～11g/L，20×无机盐组分A 48～52mL，500×CaCl

液体种子培养基：葡萄糖29～31g/L，酵母粉9～11g/L，20×无机盐组分A 48～52mL，500×CaCl

发酵培养基：葡萄糖88～92g/L，胰蛋白胨4～6g/L，玉米浆粉4～6g/L，20×无机盐组分A48～52mL，500×CaCl

其中：20×无机盐组分A：MgSO

500×CaCl

发酵培养的整个周期为144h，每隔24h取样检测。

表1本发明实施例所采用的引物序列汇总

实施例1 PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD的构建

1、PLD基因上下游同源臂扩增

根据裂殖壶菌PLD基因的序列信息，设计PLD基因上游同源臂扩增引物PLD-U(如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示)和PLD基因下游同源臂扩增引物PLD-D(如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示)，并通过引物设计在上游同源臂序列前后插入酶切位点Xho I和HindⅢ，在下游同源臂序列前后插入酶切位点BamH I和Xba I，然后以野生型菌株基因组为模板，利用PrimerStar高保真聚合酶和上述引物，通过PCR方式获得PLD基因上游同源臂和PLD基因下游同源臂。

PCR程序为：94℃5min、(94℃1min，60℃1min，72℃1min)×35个循环、72℃10min、4℃forever。

2、PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD构建

(1)用限制性内切酶Xho I和HindⅢ对敲除载体pBlue-zeo(图1)和PLD基因上游同源臂PCR纯化产物片段进行双酶切，37℃酶切2h。双酶切体系为：4μg DNA模板，5μL10×QuickCut Buffer，两种快切酶各1.5μL，加入适量预冷无菌水将体系补齐至50μL。

(2)用T4连接酶将PLD基因上游同源臂片段和载体pBlue-zeo片段连接，16℃反应12h。连接体系：10×T

(3)连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化方法如下：

i.取100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞置于冰上融化10min后加入10μL预冷的连接产物，冰上静置30min。

ii.将加入含有连接产物的感受态细胞置于42℃条件下水浴45s随后立即在冰上放置2～3min。

iii.在含有连接产物的感受态细胞中加入900μL LB培养基在37℃，200rpm条件下，摇床培养1h。

iv.在已培养好的液体培养基中取150μL菌液涂布于含有抗生素的LB平板上，在37℃下培养12～16h。

挑取阳性转化子，提取质粒，PCR验证连接成功后，再对已插入PLD基因上游同源臂的pBlue-zeo载体重复上述操作，插入PLD基因下游同源臂，经过PCR验证及测序验证成功后，最终获得PLD基因敲除载体pBlue-zeo-PLD(图2)。

实施例2敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株的构建

提取pBlue-zeo-PLD敲除载体质粒，用限制性内切酶Apa I和Not I双酶切线性化后，电击转化导入裂殖壶菌感受态中进行同源重组，经博来霉素抗性平板筛选得到阳性转化子，利用PCR进行验证(图3)，最终获得敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株。具体过程如下：

1、裂殖壶菌感受态细胞的制备：

(1)挑取已活化好的裂殖壶菌单菌落至10mL液体种子培养基，在28℃，200rpm摇床中培养24h。

(2)转移2mL一级种子液转移至50mL液体种子培养基，在28℃，200rpm摇床中培养6～10h，至OD

(3)取10mL培养好的菌液至已灭菌的50mL离心管，于室温下4,500rpm离心2min，弃上清液。

(4)加入20mL已预冷的无菌水清洗菌体，在4℃下4,500rpm离心2min，弃上清液。

(5)加入25mL DTT-PBS缓冲液重悬菌体，在28℃，200rpm摇床中培养30min。随后在室温下4,500rpm离心2min，弃上清液。

(6)加入20mL已预冷的无菌水重悬菌体，于4℃下4,500rpm离心2min，弃上清液。

(7)加入20mL无菌预冷山梨醇溶液重悬菌体，于4℃下4,500rpm离心4min，弃上清液。并重复一次该操作。

(8)在离心管中加入少量无菌预冷山梨醇溶液，吹打混匀后以每管100μL的量分装于1.5mL的无菌离心管，置于冰上备用。

2、裂殖壶菌的电转化：

(1)在裂殖壶菌感受态细胞中加入10～20μL的功能基因片段(约2～3μg)，吹打混匀后转移至电击杯中，冰浴30min。

(2)擦拭电击杯后装于电转仪相应位置。电击程序为：2KV，6ms，一个脉冲。

(3)取1mL已预冷的液体种子培养基(含1M山梨醇)至电转杯中，吹打混匀后转移至1.5mL无菌离心管，在28℃，200rpm摇床中培养2～3h。

(4)经略微离心后弃部分上清，取150μL富含菌体的菌液涂布于含抗生素的固体种子培养基上，在28℃恒温培养箱中培养，至平板上出现形态饱满的菌落。

3、敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株的鉴定

(1)挑取平板菌落接种至含30～50mg/L博来霉素的液体种子培养基中，28℃，200rpm培养24h。

(2)按上述操作摇瓶传代5～7次，保证敲除载体稳定遗传。

(3)提取稳定遗传的阳性菌株基因组，设计与博来霉素抗性基因特异性结合的引物(SEQ ID No.7和SEQ ID No.8)进行PCR验证，基因工程菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图如图3所示，结果表明PLD基因已经被成功敲除。

(4)将成功构建的敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株保藏于-80℃。

实施例3阳性转化子中PLD基因转录水平测定

根据PLD基因序列和内参Actin序列设计如SEQ ID No.9至SEQ ID No.12所示的引物，然后通过RT-q-PCR进行转录水平测定，具体实验步骤如下：

1、样品预处理：

取1mL混匀后的发酵液于1.5mL离心管中，在室温下10,000rpm离心2min收集菌体。用生理盐水洗涤菌体，相同操作离心收集菌体，重复两次。洗涤完毕后用液氮猝灭，置于-80℃冰箱保存备用。

2、RNA提取

(1)将预处理后的菌体置于研钵中，液氮研磨5～6次，待菌体成粉末状，加入600μLBuffer RL溶液，反复吹打至研钵中无明显沉淀后转移到1.5mL灭菌离心管中。

(2)将裂解液在4℃条件下12,000rpm离心5min，小心吸取上清液到新的1.5mLRNase Free Tube中。

(3)将上清液转移到已安装到Collection Tube中的gDNA Eraser Spin Column，12,000rpm离心1min。

(4)弃gDNA Eraser Spin Column，在Collection Tube中加入液体1/2体积的无水乙醇，吹打混匀后立即将混合液全部转移到RNA Spin Column(含Collection Tube)中。(如果混合液多于600μL，则分批加入。)12,000rpm离心1min，弃滤液。

(5)将500μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。

(6)将600μL的Buffer RWB沿管壁四周加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。重复操作一次。

(7)12000rpm空转离心2分钟。

(8)将RNA Spin Column安置于1.5mL的RNase free Collection Tube上，在膜中央处加入50μL的RNase Free dH

3、RNA逆转录

(1)按照表2在PCR管中加入反应所需的各种试剂。

(2)混匀后50℃孵育5分钟。

(3)85℃加热5秒钟使得

表2 RNA逆转录体系

4、实时荧光定量PCR

(1)按照表3添加反应试剂。通过PCR仪进行此反应，反应程序如表4所示。

表3 RT-qPCR反应体系

表4 RT-qPCR反应程序

结果表明，通过本发明实施例的方法获得的敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株较野生型菌株的PLD基因在发酵中期和发酵后期都显示出更低的转录水平。

实施例4敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株DHA含量测定

1、裂殖壶菌的培养

(1)菌种活化：取-80℃保藏的裂殖壶菌种子在固体种子培养基上划线培养，在28℃条件下培养36h。

(2)一级种子：在已培养好的固体种子培养基上挑选形态饱满的单菌体，置于50mL种子培养基中，在28℃，200rpm条件下培养24h。

(3)二级种子：从一级种子培养基中，按照4％的接种量，转移一定量种子培养液至50mL种子培养基中，在28℃，200rpm条件下培养24h。

(4)摇瓶发酵：从二级种子培养基中，按照4％的接种量，转移一定量种子培养液至50mL发酵培养基中，在28℃，200rpm条件下培养144h。

2、总油脂含量的测定

(1)取5mL发酵液至50mL离心管中，再在离心管中加入5mL浓盐酸，并加入磁性转子，于65℃的恒温加热磁力搅拌器中50min至菌体完全消化。

(2)取出离心管待冷却至室温后加入5mL正己烷萃取、颠倒、混匀后静置5min，于6,000rpm条件下离心1min，取上层有机相至已称重好的50mL离心管中，重复该操作两次，直至上层有机相呈无色。

(3)用氮气吹干离心管中正己烷，并置于60℃烘箱干燥2h，使正己烷完全挥发。

(4)取出离心管待冷却至室温后称重，所得重量减去空离心管重量即得总油脂产量。

3、脂肪酸含量的测定

(1)在装有油脂的50mL离心管中加入5mL 0.5M的KOH-CH

(2)取出离心管待冷却至室温之后，在离心管中加入5mL 30％的三氟化硼乙醚，将离心管置于65℃恒温水浴锅中加热30min。

(3)取出离心管待冷却至室温后加入5mL正己烷和50μL 40g/L的二十烷酸甲酯，震荡混匀后加入1mL的饱和氯化钠溶液防止乳化，静置5min分层。

(4)用滴管吸取上层有机相加入至含有适量无水硫酸钠的5mL离心管中，用于脱水。

(5)将5mL离心管中的溶液用0.22μm有机滤膜过滤装入气相瓶中，用于气相色谱分析。气相色谱检测条件如下：

仪器：AgilentGC7890A气相色谱法；色谱柱：Supelco-2560(100m×0.25mm ID，0.20μmfilm)；进样设置：进样量1μL，进样温度260℃，分流比50:1；载气：氮气，20cm/s；检测器温度：260℃；柱温控制：初始温度140℃，维持5min；然后以3℃/min速度升温至260℃并维持10min。

改造菌株与野生型菌株的DHA产量如图5所示，结果表明敲除PLD基因的裂殖壶菌基因工程菌株较野生型菌株的DHA产量有明显提升，在120h时提高了12.3％(P＜0.01)，这主要归功于PLD敲除对DHA占比的影响(表5)，DHA占比在120h提高了13.3％(P<0.01)。结果表明，通过对PLD基因的敲除，可使裂殖壶菌DHA产量显著提高。

表5野生型菌株与基因工程菌株在发酵后期的脂肪酸组分

注：通过单因素方差分析比较显著性差异，当P＞0.05时为差异性不显著，当0.01＜P＜0.05时为差异性显著，用*表示，当P＜0.01时为差异性极显著，用**表示。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。