壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母防治番茄采后病害及贮藏保鲜的方法

技术领域

本发明属于采后病害生物防治技术领域，具体涉及壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母防治番茄采后病害及贮藏保鲜的方法。

背景技术

番茄也叫西红柿，其色泽艳丽、酸甜可口，肉厚汁多，含有丰富的维生素、糖类、有机酸和微量元素等；此外，还具有凉血平肝、清热解毒、降低血压等功效；既可作为水果生食，又可烹成鲜美之肴，广受消费者的青睐。

番茄是典型的呼吸跃变型果实，在采后贮藏、运输以及销售过程中易受到病原真菌侵染而腐烂变质，从而造成巨大的经济损失。其中链格孢(Alternaria alternata)引起的黑斑病是采后番茄常见的真菌性病害之一，严重影响番茄的品质。因此，采取安全、有效的措施控制番茄采后病害是十分必要的。

目前控制果蔬采后病害的方法主要有物理方法、化学方法和生物防治法。物理方法包括热处理、短波紫外线照射、电离辐射、冷藏、气调贮藏等，具有安全、无毒、无害的优点，但是对设备要求较高，且处理不当易对果蔬的感官品质造成不良影响。化学方法通常是采用化学杀菌剂来控制果蔬采后病害，该方法成本低，见效快且操作简单，但病原菌易产生耐药性，且易残留而对食用者健康造成危害，而且容易造成环境污染。生物防治法是利用拮抗微生物来抑制病原菌的生长。相比于物理方法和化学方法，生物防治法具有安全无毒、绿色环保等优点。

目前发现的拮抗微生物有酵母菌、细菌和霉菌，其中酵母菌具有快速增殖、遗传稳定、不产生抗生素、不产生真菌毒素、安全性高等优点，成为研究的热点。但酵母菌单独使用往往达不到化学杀菌剂的效果，因此常将拮抗酵母与物理方法、其他拮抗菌、化学添加物等结合使用来提高其防治效果。赵妍等人的研究表明，热空气处理结合季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)能够提高樱桃番茄自身的抗性，减少樱桃番茄采后病害。宋聪报道假丝酵母属(Candida sp.)和柠檬形克勒克酵母(Kloeckera apiculata)等体积混合用于防治柑橘青霉病。

将拮抗酵母与物理方法、其他拮抗菌、化学添加物等结合使用，能够提高其防治效果，但是效果方面还需进一步提高；另一方面化学添加剂虽然可以提高生防效果，但是不可避免的也会带来安全问题，所以研究一种安全有效的生物防治方法是十分必要的。

壳寡糖(Chitosan oligosaccharide，OCH)又称壳聚寡糖、低聚壳聚糖，是一类由N-乙酰氨基葡萄糖或氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的水溶性的氨基葡聚糖，是自然界中唯一带正电荷、阳离子碱性氨基低聚糖。OCH具有分子量低、水溶性好、生物活性高等优势，是性能优良的天然食品防腐保鲜剂。而且在生物防治领域，尤其是在番茄采后病害的生物防治方面，目前未见有相关的研究报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在解决所述问题之一。本发明的目的是将OCH与卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)创造性的结合应用于番茄采后病害的防治和番茄的贮藏保鲜，可有效控制番茄采后病害的发生，减少采后病害造成的损失；经研究证明，OCH结合卡利比克毕赤酵母能显著减少番茄采后黑斑病的发生，降低番茄采后自然腐烂，对番茄品质无显著不良影响，且可以缓减其品质劣变，达到番茄贮藏保鲜的目的。达到了意想不到的显著效果，具有潜在的应用价值。

为实现以上目的，本发明提供方案如下：

壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母防治番茄采后病害及贮藏保鲜的方法，按照下述步骤进行：

(1)首先将卡利比克毕赤酵母接种于NYDB培养基中进行第一次活化培养，得到培养液；然后吸取培养液，按照体积比为1-2％的接种量再次转接入NYDB培养基中进行第二次活化培养，得到酵母培养液经离心后得到菌泥，用无菌生理盐水离心洗涤，洗涤后的菌泥用无菌生理盐水重新悬浮得到悬浮液；同样用无菌生理盐水溶解壳寡糖，得到壳寡糖溶液；然后将壳寡糖溶液与悬浮液混合得到含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液；所述含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液中壳寡糖的终浓度为2000～3000μg/mL；

(2)选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小均匀的番茄，进行表明消毒处理，然后用清水冲洗，清洗后的番茄放入已消毒的塑料筐中晾干；在晾干后的番茄表面打孔，形成一定大小和深度的伤口，每个伤口处加入等量的步骤(1)制备的含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液，静置一段时间后再接种与卡利比克毕赤酵母菌悬液等体积的链格孢孢子悬浮液，自然晾干后用保鲜膜将其密封，并放置于恒温恒湿培养箱中培养，实现番茄采后黑斑病的控制；

或者选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小相近的番茄，不经任何消毒处理，保持番茄的自然状况，在番茄表面均匀喷洒步骤(1)制备的含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液，自然晾干后用保鲜膜密封塑料筐，置于恒温恒湿培养箱中贮藏，即可实现番茄采后病害的防治及贮藏保鲜的用途。

优选的，步骤(1)中所述的NYDB培养基(以1L计)为：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。

优选的，步骤(1)中所述离心的条件均为：4℃，8000rpm，时间10～15min。

优选的，步骤(1)中所述第一次活化培养和第二次活化培养的条件均为：温度28℃，时间20～24h。

优选的，步骤(1)中所述含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液中壳寡糖的终浓度为2000μg/mL，酵母浓度为1×10

优选的，步骤(2)中所述番茄消毒处理的操作为：将番茄浸入含2％次氯酸钠溶液的水溶液中消毒1～3min；所述塑料筐消毒为清洗干净后晾干，再用75％酒精均匀喷洒消毒。

优选的，步骤(2)中所述打孔的孔径为4mm，深度为4mm。

优选的，步骤(2)中每个伤口处加入含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液和链格孢孢子悬浮液均为15μL；所述静置一段时间为2h；所述链格孢孢子悬浮液中孢子浓度为5×10

优选的，步骤(2)中在恒温恒湿培养箱中培养的温度为20℃，相对湿度90％。

优选的，步骤(2)中所述在番茄表面均匀喷洒含壳寡糖的卡利比克毕赤酵母菌悬液，具体用量为每个番茄喷洒1-1.5mL悬液。

与现有技术相比，本发明的优点：

(1)本发明所使用的卡利比克毕赤酵母为本实验室分离、纯化，经急性毒理实验验证为无毒类酵母，对人体安全无毒；所使用的壳寡糖是一种功能性寡糖，无毒无害；目前还没有将卡利比克毕赤酵母结合壳寡糖应用于番茄采后病害控制的相关研究。

(2)本发明利用壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母处理番茄，与卡利比克毕赤酵母单独处理相比，结合处理可以显著减少番茄采后黑斑病的发生，降低番茄采后自然腐烂率，取得了显著的技术效果。

(3)本发明所采用的壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母处理采后番茄，与对照相比，对采后番茄主要品质指标如失重率、硬度、可滴定酸、可溶性糖、Vc以及番茄红素等，无显著不良影响，且能缓解番茄在贮藏过程中的品质劣变，有利于番茄的贮藏保存。

(4)本发明使用壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母可以代替化学杀菌剂防治番茄采后病害，用于采后番茄的贮藏保鲜，可减少化学杀菌剂对食用者健康及环境的危害，具有绿色环保的优点。

附图说明

图1为不同浓度OCH与卡利比克毕赤酵母结合使用对番茄采后贮藏4d(A)和贮藏5d(B)黑斑病腐烂率的影响；其中CK为对照组，即生理盐水处理的番茄；H1、H2、H3、H4、H5分别为500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL的OCH单独处理的番茄；Y为卡利比克毕赤酵母(1×10

图2为不同浓度OCH与卡利比克毕赤酵母结合使用对番茄采后贮藏4d(A)和贮藏5d(B)黑斑病腐烂直径的影响；其中CK为对照组，即生理盐水处理的番茄；H1、H2、H3、H4、H5分别为500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL的OCH单独处理的番茄；Y为卡利比克毕赤酵母(1×10

图3为OCH结合卡利比克毕赤酵母对番茄自然腐烂的控制作用；注：CK为对照组，即无菌生理盐水处理的番茄；H为2000μg/mLOCH处理的番茄；Y为1×10

具体实施方式

通过借助以下实施实例更加详细诠释本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施例的限制。

本发明所提供的卡利比克毕赤酵母系本实验室分离、纯化；已公开自专利“卡利比克毕赤酵母、在水果贮藏保鲜中的应用及使用方法(201010198119.6)”；目前保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌株保藏编号为CGMCC No.3616。

卡利比克毕赤酵母培养程序为：

(1)第一次活化：从PDA斜面挑取2环卡利比克毕赤酵母接种于50mL的NYDB培养基中，在28℃、180rpm条件下培养20h，进行第一次活化，得到培养液；

(2)液体二次活化：用灭菌枪头吸取1mL活化培养液于另一瓶50mL的NYDB培养基中，在28℃、180rpm条件下培养20h，得到培养液；

(3)离心分离再悬浮：将上述(2)中的培养液在4℃，8000rpm条件下，离心10min，并用无菌生理盐水洗涤2次，以去除培养基质，得到菌泥，然后用无菌生理盐水重新悬浮，并调节至所需的酵母浓度(1×10

链格孢使用前活化步骤为：将链格孢接种到PDA培养基上在25℃避光培养7天，刮取孢子于无菌生理盐水中，再经八层灭菌纱布过滤得到霉菌孢子悬浮液，并用无菌生理盐水调至最终浓度为5×10

实施例1：

OCH结合卡利比克毕赤酵母用于番茄采后黑斑病的控制；

一、试验方案

选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小均匀的番茄，用2％次氯酸钠浸泡3分钟，然后用流动清水冲洗，清洗后的番茄放入已消毒的塑料筐中晾干。在晾干后的番茄赤道部位用无菌打孔器制造出4mm×4mm(直径×深度)的伤口，分别做如下处理：

1)加入15μL无菌生理盐水；

2)加入15μL OCH溶液(使用无菌生理盐水配制得到OCH溶液，浓度为500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL)；

3)加入15μL卡利比克毕赤酵母菌悬液(1×10

4)加入15μL含OCH的卡利比克毕赤酵母菌悬液(OCH终浓度分别为500μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mL、3000μg/mL，卡利比克毕赤酵母的浓度均为1×10

腐烂率＝腐烂的孔数/总孔数×100％；

二、试验结果

由图1(A)可知，在贮藏4d时，不同浓度OCH单独处理与对照组番茄腐烂率之间没有显著性差异，而卡利比克毕赤酵母单独处理及其与不同浓度OCH结合处理的番茄腐烂率均显著低于对照组。而且，与拮抗酵母单独处理的番茄(22.22％)相比较，其与2000μg/mL、2500μg/mL OCH结合处理的番茄腐烂率(均为5.56％)均显著降低。由图1(B)可知，在贮藏5d时，不同浓度OCH单独处理与对照组的番茄腐烂率之间仍然没有显著性差异，拮抗酵母单独处理及其与不同浓度OCH结合处理的番茄腐烂率均显著低于对照组。拮抗酵母与500μg/mL、2000μg/mL、2500μg/mLOCH结合处理的番茄腐烂率均显著低于其单独处理的番茄腐烂率(57.41％)。因此，与对照组、拮抗酵母单独处理以及OCH单独处理相比较，2000μg/mL、2500μg/mL OCH与拮抗酵母结合使用可显著降低番茄黑斑病腐烂率。

由图2(A)可知，在贮藏4d时，不同浓度OCH单独处理以及卡利比克毕赤酵母单独处理与对照组的番茄腐烂直径之间没有显著性差异，而拮抗酵母与不同浓度OCH结合处理的番茄腐烂直径均显著低于对照组和拮抗酵母单独处理的番茄(5.48mm)，其中2000μg/mLOCH结合拮抗酵母处理的番茄腐烂直径(4.62mm)最低。由图2(B)可知，在贮藏5d时，除了2000μg/mL、2500μg/mL OCH结合拮抗酵母处理的番茄，其它处理的番茄腐烂直径之间无显著性差异，且2000μg/mL OCH与拮抗酵母结合处理的番茄腐烂直径最小(6.10mm)，显著低于拮抗酵母单独处理的番茄腐烂直径(7.40mm)。

综合考虑不同处理对番茄腐烂率和腐烂直径的影响，可见终浓度为2000μg/mLOCH与终浓度为1×10

实施例2：

OCH结合卡利比克毕赤酵母用于番茄贮藏保鲜的用途；

一、试验方案

选取无病害、无机械损伤、色泽均一、大小均匀的番茄，不进行消毒处理，保持番茄自然状况，直接在番茄表面喷洒(1)无菌生理盐水；(2)OCH溶液(2000μg/mL)；(3)卡利比克毕赤酵母悬液(1×10

自然腐烂率(％)＝腐烂的果实数/总果实数×100％

品质指标具体测定方法如下：

1、失重率：失重率＝(处理前质量-贮藏后质量)/处理前质量×100％

2、硬度：使用TA-XT2i物性仪测定番茄硬度。选用P2探针，测试速度为2mm/s，测试深度为10mm。选定番茄赤道处等距离的三个点进行测试。探头插入番茄时所受到的最大阻力记为硬度(N)。

3、可滴定酸含量：采用氢氧化钠滴定法进行测定。称取约5.0g样品，加入适量蒸馏水置于研钵中研磨成匀浆，转至50mL离心管中静置30min，每隔10min震荡一次。4℃，8000rpm条件下离心10min，转移上清液至100mL容量瓶中，并定容至刻度，摇匀。吸取30mL样液转入三角瓶中，加入2滴1％酚酞，用0.01mol/L的NaOH进行滴定，滴定至溶液初显淡粉色并在0.5min内不褪色为终点。蒸馏水为空白对照，结果以质量分数(％)表示。

可滴定酸含量(％)＝(V×c×(V

其中V是样品提取液的总体积(mL)，c为NaOH浓度(mol/L)，V

4、Vc含量：采用2，6-二氯酚靛酚滴定法进行测定。称取约5.0g番茄组织样品置于研钵中，加入适量2％草酸溶液，在避光冰浴条件下置于研钵中研磨成匀浆，转入50mL离心管中。4℃，8000rpm条件下离心10min，转移上清液于100mL棕色容量瓶并定容至刻度，摇匀。取10mL样液于三角瓶中，用经标定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定样液，至出现微红色且30s不褪色为滴定终点，同时以10mL2％的草酸溶液做空白对照。根据2，6-二氯酚靛酚的用量，计算番茄中抗坏血酸的含量，以每100g样品中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。

滴定度T＝(c×V)/(V

其中c是抗坏血酸标准溶液的质量浓度(mg/mL)，V是吸取抗坏血酸标准溶液体积(mL)，V

抗坏血酸含量(mg/100g)＝[V×(V

其中V是样品提取溶液总体积(mL)，V

5、可溶性糖含量：采用蒽酮试剂法进行测定。称取约1.0g样品，加适量蒸馏水研磨成匀浆，转移至刻度试管中。加热煮沸30min，冷却至室温后，转移至50mL离心管中。4℃，8000rpm的条件下离心10min。转移上清液至100mL容量瓶并定容至刻度线。吸取样液0.5mL加入到25mL刻度试管中，加入1.5mL蒸馏水，0.5mL蒽酮-乙酸乙酯和5mL浓硫酸，立即充分震荡后，逐个精确沸水浴保温1min。取出后自然冷却至室温，测定其在630nm处的吸光度值。以蒸馏水作为空白对照，结果以质量分数(％)表示，计算公式：

可溶性糖含量(％)＝(m'×V×N)/(Vs×m×10

其中m'是从标准曲线查得的蔗糖的质量(μg)，V是提取液的总体积(mL)，N是稀释倍数，Vs是测定时吸取样液体积(mL)，M是样品质量(g)。

6、番茄红素：采用石油醚浸提法。称取约5.0g样品，加入25mL蒸馏水置于研钵中，在避光冰浴条件下研磨至匀浆，转移至分液漏斗中，加入25mL石油醚，充分混匀，静置30min，分液，取上层，加入25mL石油醚，再次充分混匀，静置30min，再分液取上层，在472nm下测其吸光度(A)。

番茄红素含量(mg/100g)＝(c’×V)/(m×10)

其中c’是从标准曲线得到的番茄红素浓度(μg/mL)，V是提取液总体积(mL)，m是样品质量(g)。

二、试验结果

由图3可以看出，在20℃贮藏14d后，OCH单独处理的番茄自然腐烂率(48.48％)显著低于对照组(66.67％)；卡利比克毕赤酵母单独处理的番茄自然腐烂率(36.67％)显著低于对照组和OCH单独处理组；而OCH与拮抗酵母结合处理的番茄自然腐烂率仅为20.83％，显著低于以上三个处理组。

按照上述步骤测定的番茄品质指标如表1所示。

表1壳寡糖结合卡利比克毕赤酵母对番茄自然腐烂及贮藏品质的影响

注：CK为对照组，即无菌水处理的番茄，H为2000μg/L OCH处理的番茄，Y为卡利比克毕赤酵母(1×10

由表1可看出，相较于对照组，OCH单独处理的番茄失重率显著降低，硬度和可溶性糖含量显著增加；卡利比克毕赤酵母单独处理组失重率显著降低，可溶性糖和番茄红素含量显著增加；而OCH与拮抗酵母结合处理组失重率显著降低，硬度、可溶性糖和番茄红素含量均显著增加，且可滴定酸和Vc含量无显著性差异。与拮抗酵母单独处理组相比较，OCH与其结合处理的番茄失重率显著降低、硬度和番茄红素含量显著增加，其它指标无显著性差异。

由此可见，与OCH结合使用，可提高卡利比克毕赤酵母对番茄自然腐烂的防治效果，对番茄品质无显著不良影响，且可一定程度缓解番茄品质劣变。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。