一种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体。

背景技术

白皮杉醇是一种儿茶酚类化合物，可由白藜芦醇邻位羟基化产生(图1)。研究表明，白皮杉醇具有出色的抗氧化、消炎、抗病毒、抗癌、降血糖和改善血液循环的生理功能，在食品、医药和化妆品领域具有重要的应用价值。此外，白皮杉醇也是多种药物和化工产品的合成前体。

在自然界中，白皮杉醇主要存在于葡萄、百香果和蓝莓中，但天然来源中白皮杉醇的含量相对较低，从植物中提取相对困难。

利用应用化学法合成白皮杉醇存在合成步骤多，反应条件苛刻，环境污染等问题。利用生物转化法通过生物催化剂对具有苯酚结构的物质进行邻位羟基化来制备白皮杉醇等儿茶酚结构化合物，具有反应条件温和、高选择性和环境友好等优点，因而备受关注和青睐。

目前，主要有两类酶可以实现白藜芦醇的邻位羟基化：细胞色素P450羟化酶和4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4-Hydroxyphenylacetate-3-hydroxylase，4HPA3H，EC1.14.13.3)。

尽管细胞色素P450羟化酶可以实现白藜芦醇的邻位羟基化生成白皮杉醇，但细胞色素P450羟化酶在实际应用中都存在着难以克服的问题，例如，植物源的P450酶系难以在细菌细胞内得到活性表达；微生物源的P450羟化酶普遍催化效率低下。

相比之下，4HPA3H由于其易于表达、催化效率高等优点，成为了白皮杉醇制备的首选用酶。4HPA3H是细菌降解4-羟基苯乙酸(4HPA)的关键酶，它不仅可以对4HPA进行邻位羟基化，而且对众多苯酚类物质也具有良好的催化活性，展现了较广的底物谱([1]Deng Y，Faivre B，Back O，et al.Structural and Functional Characterization of 4-Hydroxyphenylacetate3-Hydroxylase from Escherichia coli[J].Chembiochem，2020，21(1-2)：163-170.[2]Y.Lin，Y.Yan.Biotechnological Production of Plant-SpecificHydroxylated Phenylpropanoids[J].Biotechnology and Bioengineering 2014，111(9)1895-1899.)。

尽管4HPA3H能够催化白藜芦醇生成白皮杉醇，但与其天然底物4HPA相比，其对复杂结构底物白藜芦醇的催化效率明显降低，严重制约了其对白藜芦醇等复杂结构底物中的应用。

发明内容

本发明提供了三种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶的突变体，这三种酶具有高于野生型4-羟基苯乙酸-3-羟化酶的酶活力，能高效催化合成白皮杉醇。

一种4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体，由大肠杆菌(Escherichia coli)来源的野生型4HPA3H酶(WT)经过突变所得，野生型4HPA3H酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的突变位点为以下任一种：

(1)I157L/A211D；

(2)A211D；

(3)I157L。

本发明又提供了编码所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体的基因。

本发明又提供了包含所述基因的重组质粒。

本发明又提供了包含所述基因的基因工程细胞。

优选的，将大肠杆菌中野生型4HPA3H酶的编码基因突变为所述基因，或者向大肠杆菌中外源导入所述基因。

本发明又提供了所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体在催化白藜芦醇生成白皮杉醇中的应用。

本发明又提供了所述基因在催化白藜芦醇生成白皮杉醇中的应用。

本发明又提供了所述基因工程细胞在催化白藜芦醇生成白皮杉醇中的应用。

本发明还提供了一种催化白藜芦醇生成白皮杉醇的方法，包括以下步骤：以白藜芦醇为底物，添加所述4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体进行催化反应生成白皮杉醇。

本发明还提供了一种催化白藜芦醇生成白皮杉醇的方法，包括以下步骤：以白藜芦醇为底物，添加所述基因工程细胞进行催化反应生成白皮杉醇。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明4-羟基苯乙酸-3-羟化酶突变体由大肠杆菌(Escherichia coli)来源的野生型4HPA3H酶经过突变所得，其中I157L、A211D两种突变体全细胞催化白藜芦醇活性相对于WT提高了1.84和2.07倍，同时将两个位点进行叠加所得的突变体I157L/A211D全细胞催化白藜芦醇活性相较于WT提高了2.46倍。

附图说明

图1为4HPA3H催化白藜芦醇制白皮杉醇反应示意图。

图2为WT以及突变体蛋白纯化图。

图3为WT以及突变体生产白皮杉醇的量。

具体实施方式

本发明是在大肠杆菌(Escherichia coli)的4HPA3H(EC 1.14.13.3)基础上，通过定点突变PCR在底物口袋域上引入157和211位点的突变，获得催化白藜芦醇效率优于WT的突变体I157L，A211D。

野生型4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4HPA3H)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。编码野生型4-羟基苯乙酸-3-羟化酶(4HPA3H)的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码I157L突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码A211D突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码I157L/A211D突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

实施例1：突变体的构建

一、定点突变PCR产物的获得

根据大肠杆菌4HPA3H基因序列(GenBank登录号：NC_011751.1)，设计PCR引物来扩增E.coil BL21(DE3)基因组中4HPA3H基因，并在上下游引物的5′末端分别加入BamH I和Hind III。引物序列如下：

hpaBCF：5′-ACGCGGATCCGATGAAACCAGAAGATTTCCGCG-3′(BamH I)，

hpaBCR：5′-ACCCAAGCTTAAATCGCAGCTTCCATTTCC-3′(Hind III)。

按照Omega细菌基因组提取试剂盒的方法提取大肠杆菌BL21(DE3)基因组。用hpaBCF/R引物进行PCR扩增反应。PCR程序：94℃，5min；(94℃，1min；50℃，30s；72℃，1min)×32个循环；72℃，5min；最后降至4℃保存。

将目的基因经BamH I、Hind III两限制性内切酶消化后，与经相同双酶切处理的质粒pETDuet相连接，得到重组质粒pETDuet-4HPA3H。

以pETDuet-4HPA3H质粒为模板，进行定点PCR扩增，PCR反应体系为：10μL5×PCR缓冲液，4μLdNTPs(2.5mmol/L)，1μL上游引物(10mmol/L)，1μL下游引物(10mmol/L)，1μL质粒模板(50ng/μL)，Fast Pfu DNA聚合酶5U，高温灭菌的超纯水补至总体积50μL。定点PCR扩增程序：94℃变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸4min，30个循环；72℃延伸4min。

I157L：

上游引物：5′-TAACCACGCGcttGTTAACCCACCGAT-3′，

下游引物：5′-ATCGGTGGGTTAACaagCGCGTGGTTA-3′。

A211D：

上游引物：5′-TTGGCTTCGGCTCGgatCAAGTGATGG-3′，

下游引物：5′-CCATCACTTGatcCGAGCCGAAGCCAA-3′。

其中，小写字母代表发生替换的碱基。

I157L/A211D突变体是在I157L突变体的基础以A211D的引物构建而成。

二、定点突变PCR产物的转化与验证

将上述获得的定点突变PCR产物使用Dpn I酶进行消化，以降解质粒模板，消除转化子中野生型个体出现的可能，从而有效的筛选突变克隆。消化的体系为：PCR产物40-50μL，Dpn I 1μL，轻轻吸打混匀后，短暂离心收集至底管，并置于37℃恒温条件下反应1-2小时。

将消化以后的产物用CaCl

(1)从-70℃冰箱中取100μL的感受态细胞悬液，冰上融化；

(2)加入定点突变PCR消化产物5μL，轻轻混匀，冰上放置30min；

(3)于42℃水浴热激110s，然后立即冰上放置2min；

(4)向管中加入900μL SOC培养基，混匀，37℃振荡培养1h，使细胞复苏；

(5)将上述菌液摇匀，取适量涂布在含有100μg/mL氨苄霉素的LB平板上，正面向上放置半小时，待菌液被培养基吸收后倒置平板，37℃培养过夜。

(6)转化子长出后，随机挑选若干个克隆，提取质粒，进行全自动DNA测序，证实预期突变位点157、211位和157/211的ATT→CTT、GCA→GAT和ATT→CTT/GCA→GAT。

实施例2：突变酶的表达与纯化

挑取单菌落接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200r/min的条件下进行过夜培养。随后，以2％比例(V/V)将过夜培养物接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的100mL LB培养基中，在37℃条件下培养至OD

实施例3：WT和突变体全细胞催化活力的测定

将诱导后的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，收集的菌体重新悬浮在PBS缓冲液中，调OD

HPLC操作条件如下：色谱分离柱为Hypersil ODS2 C18(250mm×4.6mm)(Thermo公司)，紫外检测波长为306nm，进样量为10μL，控制柱温30℃，流动相A为含0.05％三氟乙酸的水，流动相B为含0.05％三氟乙酸的乙腈，流速为1mL/min梯度洗脱程序见表1。

表1HPLC梯度洗脱程序

得到结果如图3。由图3可见，在同样的处理条件下，突变体酶I157L、A211D和I157L/A211D的比活力高于野生型4HPA3H的比活力。

实施例4：突变体酶动力学参数测定

测定在不同底物浓度(10～1000μM)下的反应初速度。

以白皮杉醇为底物，在pH 7.4、30℃的条件下，分别测定野生型酶、突变酶I157，突变酶A211D和突变酶I157L/A211D的米氏动力学常数。在底物浓度为110～1000μM的条件下测定催化速率。采用OriginPro8

表2HpaB和突变体I157L、A211D和I157L/A211D对底物白藜芦醇的动力学参数

K

K

K

由表2可见，突变体I157L、A211D和I157L/A211D的K