用于细胞疗法的方法和组合物

交叉引用

本申请要求2020年10月20日提交的英国专利申请第2016659.1号和2021年2月5日提交的英国专利申请第2101665.4号的权益，这两个申请均通过引用整体并入本文。

背景技术

细胞疗法为战胜以前的疑难杂症带来了巨大的希望。尽管自体细胞的使用通常是最佳的，但这种方法成本高昂且负担沉重。虽然同种异体多能干细胞(PSC)提供了更大的可扩展性并节约了成本，但由于需要匹配人白细胞抗原(HLA)1类等位基因(人基因组中最具遗传多态性的区域)，它们的效用受到限制。HLA 1类单体型的错配导致“自身对非自身”免疫应答，从而导致身体对移植的治疗性细胞的排斥。最近对被阻断触发T细胞激活的免疫应答的HLA复合物进行工程改造的努力的一般效用受到这些复合物不能成功地与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)接合的限制，导致“丧失自我”免疫应答。因此，仍然存在未满足的开发可避开T细胞介导和KIR介导的免疫应答的工程化多能干细胞的需求。

发明内容

在一方面，本文提供了一种包含一个或多个人白细胞抗原(HLA)的复合物，其中当所述复合物被一个或多个T细胞询问时，所述一个或多个HLA被抑制引发T细胞应答。

在一些实施方案中，所述复合物以N末端至C末端的顺序包含：包含肽的区段和包含人HLA 1类重链序列的区段。在一些实施方案中，当所述肽被一个或多个T细胞询问时，所述肽不引发T细胞应答。在一些实施方案中，所述肽不能激活所述一个或多个T细胞。在一些实施方案中，所述肽能够与所述一个或多个T细胞的受体结合，并且所述结合不足以激活所述一个或多个T细胞。在一些实施方案中，所述肽与所述人HLA 1类重链序列的一个或多个HLA结合沟结构域残基结合。在一些实施方案中，所述肽调节所述人HLA 1类重链序列的构象。在一些实施方案中，所述构象阻止所述一个或多个T细胞与所述人HLA 1类重链序列结合。在一些实施方案中，所述肽包含大于或等于8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。在一些实施方案中，所述人HLA 1类重链序列包含一个或多个1类HLA。

根据权利要求2至10中任一项所述的复合物，其中所述人HLA 1类重链序列包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或其任何组合。在一些实施方案中，所述人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-A、HLA-B、HLA-C或其任何组合。在一些实施方案中，所述人HLA 1类重链序列包含所述HLA-A，其中所述HLA-A被置换到所述HLA-B和所述HLA-C之间。在一些实施方案中，所述复合物进一步包含所述肽和所述人HLA 1类重链序列之间的一个或多个连接子。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子被配置成抵抗蛋白水解切割。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子包含被配置成不阻断所述人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象。在一些实施方案中，所述肽通过二硫键偶联到所述复合物。在一些实施方案中，所述复合物进一步包含一个或多个免疫检查点激动剂。在一些实施方案中，所述一个或多个免疫检查点激动剂包括CD47、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA、SIGLEC7或其组合。在一些实施方案中，所述人HLA 1类重链序列包含HLA-E或其片段、HLA-F或其片段、HLA-G或其片段或它们的任何组合。在一些实施方案中，当所述复合物被一个或多个T细胞询问时，所述HLA-E或所述其片段、HLA-F或所述其片段、HLA-G或所述其片段或它们的任何组合中的至少一个被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，所述复合物进一步包含调节肽。在一些实施方案中，所述调节肽是凋亡诱导肽。在一些实施方案中，所述复合物进一步包含被配置成允许检测所述复合物的表位。在一些实施方案中，所述表位包含3,5-二硝基水杨酸。在一些实施方案中，所述复合物包含人β2-微球蛋白序列。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子中的连接子被置换到所述肽和所述人β2-微球蛋白序列之间、所述人β2-微球蛋白序列和所述人HLA 1类重链序列之间，或二者兼而有之。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子中的连接子包含与SEQ ID NO:48-54中的任一个具有至少约70％、80％、90％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述复合物以N末端至C末端的顺序包含：

a.所述肽；

b.所述一个或多个连接子中的第一连接子；

c.所述人β2-微球蛋白序列；

d.所述一个或多个连接子中的第二连接子；和

e.所述人HLA 1类重链序列。

在另一方面，本文提供了一种包含一个或多个人白细胞抗原(HLA)的复合物，其中当所述复合物被一个或多个T细胞询问时，所述一个或多个HLA被抑制引发T细胞应答，并且其中所述复合物包含：

a.第一连接子；和

b.包含人HLA 1类重链序列的区段；

其中所述第一连接子包含被配置成不阻断所述人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象。

在一些实施方案中，所述复合物包含肽，其中所述肽被配置成或选择成不能激活所述一个或多个T细胞。在一些实施方案中，所述配置被进一步配置成抵抗蛋白水解切割。在一些实施方案中，所述复合物进一步包含人β2-微球蛋白以及在所述人β2-微球蛋白序列和所述人HLA 1类重链序列之间的另外的连接子。在一些实施方案中，所述另外的连接子包含被配置成抵抗蛋白水解切割的构象。在一些实施方案中，所述另外的连接子被进一步配置成不阻断所述人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点。在一些实施方案中，所述第一连接子包含与SEQ ID NO:48-54中的任一个具有至少约70％、80％、90％或99％同一性的序列，或所述另外的连接子包含与SEQ ID NO:48-54中的任一个具有至少约70％、80％、90％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个人白细胞抗原(HLA)包含一个或多个突变，其中当所述复合物被一个或多个CD8细胞询问时，所述一个或多个突变抑制所述一个或多个HLA引发T细胞应答。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括氨基酸残基115、122、128、194、197、198、212、214、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、243、245、248、262中的一个或多个或其任何组合的突变。在一些实施方案中，所述复合物进一步包含抑制补体系统的免疫应答的一个或多个蛋白质或其片段。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质或其片段选自CD48、CD59或其组合。在一些实施方案中，所述肽包含选自L、M、S、I、F、T、V和Y的第二氨基酸残基。在一些实施方案中，所述第二氨基酸残基选自T、V和Y。在一些实施方案中，所述肽包含选自V、I、F、W、Y、L、R和K的最末氨基酸残基。在一些实施方案中，所述最末氨基酸残基选自Y、L、R和K。在一些实施方案中，所述肽包含选自E、P、L、Q、A、R、H、S、T、V、M、D和K的第二氨基酸残基。在一些实施方案中，所述第二氨基酸残基选自E、P、L、Q、A、R和H。在一些实施方案中，所述肽包含选自V、L、F、A、I、Y、M、W、P和R的最末氨基酸残基。在一些实施方案中，所述最末氨基酸残基选自V、L和F。在一些实施方案中，所述肽包含选自A、Y、S、T、V、I、L、F、Q、R、N和W的第二氨基酸残基。在一些实施方案中，所述第二氨基酸残基选自A和Y。在一些实施方案中，所述肽包含选自L、V、M、F、Y和I的最末氨基酸残基。在一些实施方案中，所述最末氨基酸残基是L。

在另一方面，本文提供了一种编码如本文所述的复合物的核酸分子。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含内源性HLA基因座中的缺失。在一些实施方案中，所述缺失包括内源性HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座或其任何组合中的缺失。在一些实施方案中，所述缺失是所述内源性HLA基因座的完全缺失。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码人HLA 1类重链序列的序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含HLA-A序列，其中所述HLA-A序列被置换到所述HLA-B序列和所述HLA-C序列之间。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含少于1700个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含少于500bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含少于250bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含少于150bp。在一些实施方案中，所述HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，所述一个或多个侧翼序列包含内源性HLA序列。在一些实施方案中，所述一个或多个侧翼序列对一个或多个启动子具有特异性。在一些实施方案中，所述启动子包含HLA-A启动子、HLA-B启动子、HLA-C启动子或其组合。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列不包含所述HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合的至少一部分。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码人β2-微球蛋白肽的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码肽的序列。在一些实施方案中，当所述肽被一个或多个T细胞询问时，所述肽不引发T细胞应答。在一些实施方案中，所述肽不能激活所述一个或多个T细胞。在一些实施方案中，所述肽能够与所述一个或多个T细胞的受体结合，并且其中所述结合不足以激活所述一个或多个T细胞。在一些实施方案中，所述肽与所述人HLA 1类重链序列的一个或多个HLA结合沟结构域残基结合。在一些实施方案中，所述第一肽调节所述人HLA 1类重链序列的构象。在一些实施方案中，所述构象阻止所述一个或多个T细胞结合所述人HLA 1类重链序列。在一些实施方案中，所述肽包含大于或等于8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码一个或多个连接子的一个或多个序列，所述一个或多个序列在编码所述肽的所述序列和编码所述人HLA 1类重链序列的所述序列之间。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子被配置成抵抗蛋白水解切割。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子包含被配置成不阻断所述人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象。在一些实施方案中，编码一个或多个连接子的所述一个或多个序列中的序列被置换到编码所述肽的所述序列和编码所述人β2-微球蛋白肽的所述序列之间、编码所述人β2-微球蛋白肽的所述序列和编码所述人HLA 1类重链序列的所述序列之间，或二者兼而有之。在一些实施方案中，所述一个或多个连接子中的连接子包含与SEQ ID NO:48-54中的任一个具有至少约70％、80％、90％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码一个或多个免疫检查点激动剂的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个免疫检查点激动剂包括CD47、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA、SIGLEC7或其组合。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码与所述一个或多个免疫检查点激动剂的受体对应的一个或多个敲除蛋白质的序列。在一些实施方案中，编码所述人HLA 1类重链序列的所述序列包含HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合。在一些实施方案中，当所述人HLA 1类重链序列被一个或多个T细胞询问时，所述HLA-E序列或所述其片段、HLA-F序列或所述其片段、HLA-G序列或所述其片段或它们的任何组合中的至少一个被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码对应于II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)的一个或多个敲除蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码调节肽的序列。在一些实施方案中，所述调节肽是凋亡诱导肽。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码表位的序列，所述表位被配置成允许检测所述复合物。在一些实施方案中，所述表位包含3,5-二硝基水杨酸。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码一个或多个敲除蛋白质的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个敲除蛋白质选自血型A抗原和血型B抗原。在一些实施方案中，所述核酸分子包含：a.编码所述肽的所述序列；b.编码一个或多个连接子的所述一个或多个序列中的编码第一连接子的第一序列；c.编码所述人β2-微球蛋白肽的所述序列；d.编码一个或多个连接子的所述一个或多个序列中的编码第二连接子的第二序列；和e.编码所述人HLA 1类重链序列的所述序列。

在另一方面，本文提供了一种核酸分子，其包含编码包含一个或多个1类人白细胞抗原(HLA)蛋白的复合物的序列，其中当所述复合物被一个或多个T细胞询问时，所述一个或多个1类HLA蛋白被抑制引发T细胞应答，并且其中所述核酸分子包含：

a.编码肽的序列，其中所述肽不能激活所述一个或多个T细胞；

b.编码第一连接子的第一序列；和

c.编码一个或多个1类HLA蛋白的序列；

其中所述第一连接子包含被配置成不阻断所述人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象，并且其中所述构象被进一步配置成抵抗蛋白水解切割。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含在编码所述连接子的所述序列和编码所述人HLA 1类重链序列的所述序列之间的编码人β2-微球蛋白肽的序列。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含在编码所述人β2-微球蛋白肽的所述序列和编码所述人HLA 1类重链序列的所述序列之间的编码另外的连接子的另外的序列，其中所述另外的连接子包含被配置成抵抗蛋白水解切割的构象。在一些实施方案中，所述另外的连接子被进一步配置成不阻断所述人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点。在一些实施方案中，所述第一连接子包含与SEQ ID NO:48-54中的任一个具有至少约70％、80％、90％或99％同一性的序列，或所述另外的连接子包含与SEQID NO:48-54中的任一个具有至少约70％、80％、90％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的所述序列包含一个或多个突变，其中当所述人HLA 1类重链序列被一个或多个CD8细胞询问时，所述一个或多个突变抑制所述人HLA 1类重链序列引发T细胞应答。在一些实施方案中，所述一个或多个突变包括氨基酸残基115、122、128、194、197、198、212、214、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、243、245、248、262中的一个或多个或其任何组合的突变。在一些实施方案中，所述核酸分子进一步包含编码抑制补体系统的免疫应答的一个或多个蛋白质或其片段的序列。在一些实施方案中，所述一个或多个蛋白质或其片段选自CD48、CD59或其组合。

在另一方面，本文提供了一种用于生成如本文所述的核酸分子的方法，其包括置换对区域进行编码的序列，所述区域被配置成接收包含所述HLA基因座中的所述缺失的序列、编码所述人HLA 1类重链序列的序列或其任何组合。

在另一方面，本文提供了一种生成无免疫能力细胞的方法，其包括向细胞施用如本文所述的复合物或核酸。

在一些实施方案中，所述核酸被递送到所述细胞的基因组。在一些实施方案中，细胞与所述复合物一起孵育。在一些实施方案中，所述细胞是干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。

在另一方面，本文提供了一种治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的如本文所述的核酸分子或如本文所述的无免疫能力细胞。

在一些实施方案中，所述疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所述疾病是癌症。在一些实施方案中，所述疾病是退行性疾病。

在另一方面，本文提供了一种抑制人白细胞抗原(HLA)的方法，其包括将所述HLA与不包含T细胞受体结合残基或片段的肽接触。

在一些实施方案中，所述肽与所述HLA的一个或多个HLA结合沟结构域残基结合。在一些实施方案中，所述肽调节所述HLA的构象。在一些实施方案中，所述构象阻止T细胞结合所述HLA。在一些实施方案中，所述肽包含大于或等于8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。在一些实施方案中，所述HLA是合成的。

援引并入

本说明书和所附附录中提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指明通过引用并入一样。如通过引用并入的出版物和专利或专利申请达到与本说明书中所含的公开内容相矛盾的程度，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。

附图说明

在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中也被称为“图”)，将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在说明性实施方案中利用了本发明的原理，并且在附图中：

图1示出了本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物的结构域视图。

图2示出了本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物的构建体结构的三维视图。

图3示出了HLA结合的免疫原性肽与T细胞受体接合，从而导致T细胞激活。

图4示出了本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物与T细胞受体接合，从而导致T细胞激活失败。

图5示出了单链三聚体(SCT)与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)复合，从而导致阻断的KIR相互作用并产生“丧失自我”免疫信号。

图6示出了本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)复合，从而导致成功的KIR相互作用且不产生“丧失自我”免疫信号。

图7示出了单链三聚体(SCT)与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)复合以及本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)复合的叠加图。

图8示出了本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物与CD8接合。

图9示出了本文提供的无免疫能力细胞。

图10示出了在细菌中重组表达的如本文所述的synHLA复合物的SDS-PAGE凝胶。

图11示出了在细菌中重组表达的如本文所述的synHLA复合物的SDS-PAGE。

图12A示出了SYNC4-1和SYNC4-1+KIR2DL2的原始热解链曲线。

图12B示出了SYNC4-1和SYNC4-1+KIR2DL2的热解链曲线的一阶导数。

图13A示出了SYNC4-1、SYNC4-1+KIR2DL2和KIR2DL2的原始热解链曲线。

图13B示出了SYNC4-1、SYNC4-1+KIR2DL2和KIR2DL2的热解链曲线的一阶导数。

图14A示出了SYNA1-1、SYNA1-1+KIR2DL2和KIR2DL2的原始热解链曲线。

图14B示出了SYNA1-1、SYNA1-1+KIR2DL2和KIR2DL2的热解链曲线的一阶导数。

图15示出了被设计成用于在细菌中表达的本文提供的合成人白细胞抗原(synHLA)复合物的结构域视图。

具体实施方式

定义

每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“至少”、“大于”或“大于或等于”适用于所述系列数值中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3相当于大于或等于1、大于或等于2或大于或等于3。

每当术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”在一系列两个或多个数值中的第一个数值之前时，术语“不大于”、“小于”或“小于或等于”适用于所述系列数值中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1相当于小于或等于3、小于或等于2或小于或等于1。

如本文所使用，“T细胞”是包含T细胞受体的细胞。

如本文所使用，“肽”是二至五十个氨基酸残基的链。

“药学上可接受的载剂”是指药物调配物中除活性成分以外的对对象无毒的成分。药学上可接受的载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂，诸如本领域已知的那些，例如描述于Remington'sPharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编(1980)中的那些。

如本文所使用，“治疗”是用于获得有益或期望的结果，包括并且优选临床结果的方法。例如，有益或期望的临床结果包括但不限于以下中的一种或多种：减少由疾病引起的症状，提高患有疾病的人的生活质量，减少治疗疾病所需的其它药物的剂量，延缓疾病的进展和/或延长个体的存活。

如本文所使用，复合物、核酸分子、无免疫能力细胞或其药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益或期望的结果的量。对于预防性用途，有益或期望的结果包括诸如消除或降低疾病的风险、减轻疾病的严重程度或延迟疾病的发作的结果，所述包括疾病的生物化学、组织学和/或行为症状、其并发症以及疾病发展过程中出现的中间病理表型。对于治疗性用途，有益或期望的结果包括临床结果，诸如减少由疾病引起的一种或多种症状，提高患有疾病的人的生活质量，降低治疗疾病所需的其它药物的剂量，诸如经由靶向增强另一种药物的效果，延缓疾病的进展和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况下，有效量的药物可以具有以下效果：减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓并优选停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，在一定程度上减缓并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与病症相关的症状中的一种或多种。有效剂量可以单次或多次施用。出于本发明的目的，复合物、核酸分子、无免疫能力细胞或其药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如在临床语境中所理解，一种复合物、核酸分子、无免疫能力细胞或其药物组合物的有效剂量可以与或可以不与另一种复合物、核酸分子、无免疫能力细胞或其药物组合物联合实现。因此，在施用一个或多个治疗剂的语境下，可以考虑“有效剂量”，并且如果单一试剂在与一个或多个其它试剂联合给予的情况下可以或已经获得期望的结果，则其可以被考虑为以有效量给予。

如本文所定义，涉及蛋白质-抑制剂相互作用的术语“抑制”等意指相对于在不存在抑制剂的情况下的蛋白质的活性或功能，负面影响(例如，降低)蛋白质的活性或功能。抑制可以是指疾病或疾病症状的减轻。抑制可以是指特定蛋白质或核酸靶标的活性降低。蛋白质可以是脱氧胞苷激酶。因此，抑制至少部分地包括部分或完全阻断刺激，降低、阻止或延迟激活，或失活、脱敏或下调信号转导或酶活性或蛋白质的量。

术语“调节剂”是指增加或降低靶分子的水平或靶分子的功能或分子靶标的物理状态的组合物。

术语“调节”是根据其普通含义使用的，是指改变或更改一种或多种性质的行为。“调制”是指改变或更改一种或多种性质的过程。例如，靶蛋白的调节剂通过增加或减少来改变靶分子的性质或功能或靶分子的量。疾病调节剂减少靶向疾病的症状、病因或特性。

“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载剂”是指有助于活性剂的施用和对象吸收的物质，并且可以包含在本发明的组合物中，而不会对患者产生显著的不良毒理作用。药学上可接受的赋形剂的非限制性实例包括水、NaCl、生理盐水溶液、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣、甜味剂、增香剂、盐溶液(诸如，林格氏液)、醇、油、明胶、诸如乳糖、直链淀粉或淀粉等碳水化合物、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和着色剂等。这种制剂可以被灭菌，并且如果需要的话，可以与辅助剂混合，诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等，它们不会与本发明的复合物、核酸分子或无免疫能力细胞发生有害的反应。本领域技术人员将认识到，其它药物赋形剂也可用于本发明中。

如本文所使用，术语“施用”意指向对象口服施用，以栓剂形式施用，局部接触、静脉内、肠胃外、腹膜内、肌内、病变内、鞘内、鼻内或皮下施用，或植入缓释装置，例如微型渗透泵。施用可以通过任何途径，包括肠胃外和经粘膜(例如，颊部、舌下、腭部、牙龈、鼻部、阴道、直肠或透皮)。肠胃外施用包括例如静脉内、肌内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其它递送方式包括但不限于使用脂质体调配物、静脉内输注、透皮贴剂等。

“患者”、“对象”、“有需要的患者”和“有需要的对象”在本文中可互换使用，是指患有或易患可以通过施用如本文提供的药物组合物来治疗的疾病或病况的活生物体。非限制性实例包括人、其它哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、奶牛、鹿和其它非哺乳动物。在一些实施方案中，患者是人。“癌症患者”是患有或易发展癌症的患者。

除非另有明确指示，否则如本文所使用的术语“个体”是指哺乳动物，包括但不限于牛、马、猫、兔、犬、啮齿动物或灵长类动物(例如，人)。在一些实施方案中，个体是人。在一些实施方案中，个体是非人灵长类动物，诸如黑猩猩和其它猿和猴物种。在一些实施方案中，个体是农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊和猪；宠物，诸如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠；等等。在一些实施方案中，本发明在人类医学和兽医领域中都有应用。

“疾病”或“病况”是指能够用本文提供的复合物、核酸分子、无免疫能力细胞或方法治疗的患者或对象的生存状态或健康状况。在一些实施方案中，如本文所使用的疾病是指癌症。

如本文所使用，“免疫检查点激动剂”是指导致一个或多个免疫检查点蛋白激活的试剂。例如，免疫检查点激动剂包括但不限于CD47、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA和SIGLEC7。

如本文所使用，“突变”是指核酸分子的序列的改变。突变包括但不限于插入、缺失和取代。

如本文所使用，氨基酸的缩写是常规的，并且可以如下：丙氨酸(A，Ala)；精氨酸(R，Arg)；天冬酰胺(N，Asn)；天冬氨酸(D，Asp)；半胱氨酸(C，Cys)；谷氨酸(E，Glu)；谷氨酰胺(Q，Gln)；甘氨酸(G，Gly)；组氨酸(H，His)；异亮氨酸(I，Ile)；亮氨酸(L，Leu)；赖氨酸(K，Lys)；蛋氨酸(M，Met)；苯丙氨酸(F，Phe)；脯氨酸(P，Pro)；丝氨酸(S，Ser)；苏氨酸(T，Thr)；色氨酸(W，Trp)；酪氨酸(Y，Tyr)；缬氨酸(V，Val)。其它氨基酸包括瓜氨酸(Cit)；同型半胱氨酸(Hey)；羟脯氨酸(Hyp)；鸟氨酸(Orn)；和甲状腺素(Thx)。在生理pH下不带电的氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。

如本文所使用，肽的“锚定残基”是在将肽结合到给定HLA等位基因的沟中起作用的保守氨基酸残基。

如本文和所附权利要求中所使用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代，除非上下文另有明确指示。

应理解，本文描述的本发明的方面和变化包括“由……组成”和/或“基本上由……组成”方面和变化。

合成人白细胞抗原(synHLA)复合物

在一方面，本文提供了一种包含一个或多个人白细胞抗原(HLA)的复合物，其中当所述复合物被一个或多个T细胞询问时，所述一个或多个HLA被抑制引发T细胞应答。

在一些实施方案中，复合物以N末端至C末端的顺序包含：包含肽的区段和包含人HLA 1类重链序列的区段。

在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含一个或多个1类HLA。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-A、HLA-B、HLA-C或其任何组合。在一些实施方案中，人HLA1类重链序列包含HLA-A。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-B。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-A和HLA-B。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-A和HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-A、HLA-B、HLA-C或其任何组合。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-A。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-B。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-A和HLA-B。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-A和HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含多个版本的HLA-A、HLA-B和HLA-C。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-A，其中HLA-A被置换到HLA-B和HLA-C之间。

在一些实施方案中，复合物进一步包含一个或多个免疫检查点激动剂。在一些实施方案中，一个或多个免疫检查点激动剂包括CD47、PD-L1、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、NOX2、PD-1、TIM-3、VISTA、SIGLEC7或其组合。在一些实施方案中，复合物包含CD47。在一些实施方案中，复合物包含PD-L1。在一些实施方案中，复合物包含A2AR。在一些实施方案中，复合物包含B7-H3。在一些实施方案中，复合物包含B7-H4。在一些实施方案中，复合物包含BTLA。在一些实施方案中，复合物包含CTLA-4。在一些实施方案中，复合物包含IDO。在一些实施方案中，复合物包含KIR。在一些实施方案中，复合物包含LAG3。在一些实施方案中，复合物包含NOX2。在一些实施方案中，复合物包含PD-1。在一些实施方案中，复合物包含TIM-3。在一些实施方案中，复合物包括VISTA。在一些实施方案中，复合物包含SIGLEC7。

在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-E或其片段、HLA-F或其片段、HLA-G或其片段或它们的任何组合。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-E或其片段。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-F或其片段。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-G或其片段。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-E或其片段和HLA-F或其片段。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-E或其片段和HLA-G或其片段。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-F或其片段和HLA-G或其片段。在一些实施方案中，人HLA 1类重链序列包含HLA-E或其片段、HLA-F或其片段和HLA-G或其片段。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E或其片段、HLA-F或其片段、HLA-G或其片段或它们的任何组合中的至少一个被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-F或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-G或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E或其片段和HLA-F或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E或其片段和HLA-G或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-F或其片段和HLA-G或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E或其片段、HLA-F或其片段和HLA-G或其片段被抑制引发T细胞应答。

在一些实施方案中，复合物进一步包含被配置成允许检测复合物的表位。在一些实施方案中，表位包含3,5-二硝基水杨酸。

在一些实施方案中，复合物包含人β2-微球蛋白序列。在一些实施方案中，人β2-微球蛋白序列是野生型人β2-微球蛋白序列。

在一些实施方案中，复合物以N末端至C末端的顺序包含：

a.肽；

b.一个或多个连接子中的第一连接子；

c.人β2-微球蛋白序列；

d.一个或多个连接子中的第二连接子；和

e.人HLA 1类重链序列。

在另一方面，本文提供了一种包含一个或多个人白细胞抗原(HLA)的复合物，其中当复合物被一个或多个T细胞询问时，一个或多个HLA被抑制引发T细胞应答，并且其中复合物以N末端至C末端的顺序包含：

a.肽，其中肽不能激活一个或多个T细胞；

b.第一连接子；和

c.包含人HLA 1类重链序列的区段；

其中第一连接子包含被配置成不阻断人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象，并且其中构象被进一步配置成抵抗蛋白水解切割。

在一些实施方案中，复合物包含与下表A中列出的序列具有至少约70％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.9％或约100％同一性的序列。

表A.HLA复合物序列

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肽

在一方面，本文提供了被配置成削弱或抑制HLA活性的肽。

在一些实施方案中，当肽被一个或多个T细胞询问时，肽不引发T细胞应答。在一些实施方案中，肽不能激活一个或多个T细胞。在一些实施方案中，肽能够与一个或多个T细胞的受体结合，并且其中结合不足以激活一个或多个T细胞。

在一些实施方案中，肽被配置成与HLA共价结合。在一些实施方案中，肽被配置成与HLA II类的β链的N末端或HLA 1类的β-2M链的N末端结合。在一些实施方案中，肽被配置成对MHC结合沟具有特异性，但不包含T细胞受体(TCR)识别所需的正确的面向TCR/暴露于溶剂的氨基酸。HLA的MHC结合沟中的特异性“锚定残基”的存在起到锚定结合肽的作用。

在一些实施方案中，肽中的残基可以被改变，以便配置肽，使得TCR不识别和/或与肽结合的MHC(pMHC)结合。尽管TCR与MHC中的残基相互作用，但来自肽的1-3个面向TCR、暴露于溶剂的残基也直接参与TCR相互作用。在一些实施方案中，肽的面向TCR的残基被配置成拮抗TCR相互作用。

在一些实施方案中，肽与人HLA 1类重链序列的一个或多个HLA结合沟结构域残基结合。在一些实施方案中，肽调节人HLA 1类重链序列的构象。在一些实施方案中，构象阻止一个或多个T细胞与人HLA 1类重链序列结合。

在一些实施方案中，结合肽的序列可以影响pMHC的固有柔性。在一些实施方案中，pMHC的构象柔性有利于TCR相互作用。在一些实施方案中，被配置成与HLA结合的肽被进一步配置成增加pMHC的构象可变性并阻止TCR接合。

在一些实施方案中，肽的长度为约8个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为约8个氨基酸至约9个氨基酸、约8个氨基酸至约10个氨基酸、约8个氨基酸至约11个氨基酸、约8个氨基酸至约12个氨基酸、约8个氨基酸至约13个氨基酸、约8个氨基酸至约14个氨基酸、约8个氨基酸至约15个氨基酸、约9个氨基酸至约10个氨基酸、约9个氨基酸至约11个氨基酸、约9个氨基酸至约12个氨基酸、约9个氨基酸至约13个氨基酸、约9个氨基酸至约14个氨基酸、约9个氨基酸至约15个氨基酸、约10个氨基酸至约11个氨基酸、约10个氨基酸至约12个氨基酸、约10个氨基酸至约13个氨基酸、约10个氨基酸至约14个氨基酸、约10个氨基酸至约15个氨基酸、约11个氨基酸至约12个氨基酸、约11个氨基酸至约13个氨基酸、约11个氨基酸至约14个氨基酸、约11个氨基酸至约15个氨基酸、约12个氨基酸至约13个氨基酸、约12个氨基酸至约14个氨基酸、约12个氨基酸至约15个氨基酸、约13个氨基酸至约14个氨基酸、约13个氨基酸至约15个氨基酸或约14个氨基酸至约15个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸或约15个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为至少约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸或约14个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为至多约9个氨基酸、约10个氨基酸、约11个氨基酸、约12个氨基酸、约13个氨基酸、约14个氨基酸或约15个氨基酸。在一些实施方案中，肽包含大于14个氨基酸。

在一些实施方案中，使用异常长的肽来与HLA的MHC结合沟结合抑制了HLA活性。MHC-I通常结合长度为8-10个氨基酸的肽，但也可以结合非典型的更长的肽(例如，13个氨基酸)。这种长肽的末端与锚定残基处的MHC结合沟结合，从而在肽结合位点的中心产生“凸起”。在这种pMHC-TCR复合物中，TCR与MHC的接触相对较少(通常与典型的短肽接触，在这种复合物中，MHC重链主导与TCR的界面)，相反，与TCR的相互作用直接由肽主导。凸起的肽也代表了TCR接合的空间挑战。考虑到这种系统中的肽-TCR相互作用的优势，通过选择凸起处的肽序列，有可能阻止TCR结合。在一些实施方案中，肽被配置成阻断和/或抑制与TCR进行分子接触所需的HLA的氨基酸，和/或肽不包含足以进行TCR结合和/或活动的氨基酸残基。在一些实施方案中，肽被配置成增加HLA在本区域中的构象异质性，从而使HLA不能进行TCR结合和/或活动。在一些实施方案中，肽被配置成进行上述功能的任何组合。

在一些实施方案中，肽通过二硫键与复合物偶联。

在一些实施方案中，复合物进一步包含调节肽。在一些实施方案中，调节肽是凋亡诱导肽。在一些实施方案中，凋亡诱导肽充当复合物的“杀伤开关”。

在一些实施方案中，肽包含与下表B中列出的序列具有至少约70％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.9％或约100％同一性的序列。

表B.用以削弱或抑制HLA活性的肽

连接子

在一些实施方案中，复合物包含肽和人HLA 1类重链序列之间的一个或多个连接子。在一些实施方案中，一个或多个连接子被配置成抵抗蛋白水解切割。在一些实施方案中，一个或多个连接子包含被配置成不阻断人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象。在一些实施方案中，一个或多个连接子是结构稳定的。在一些实施方案中，一个或多个连接子是刚性的。在一些实施方案中，一个或多个连接子具有有限的柔性。在一些实施方案中，一个或多个连接子的结构稳定性、刚性和有限的柔性增加了对蛋白水解降解的抗性。

在一些实施方案中，一个或多个连接子中的连接子被置换到肽和人β2-微球蛋白序列之间、人β2-微球蛋白序列和人HLA 1类重链序列之间，或二者兼而有之。在一些实施方案中，一个或多个连接子中的连接子被置换到肽和人β2-微球蛋白序列之间。在一些实施方案中，一个或多个连接子中的连接子被置换到人β2-微球蛋白序列和人HLA 1类重链序列之间。在一些实施方案中，一个或多个连接子中的第一连接子被置换到肽和人β2-微球蛋白序列之间，并且一个或多个连接子中的第二连接子被置换到人β2-微球蛋白序列和人HLA 1类重链序列之间。在一些实施方案中，第二连接子包含被配置成抵抗蛋白水解切割的构象。在一些实施方案中，第二连接子被进一步配置成不阻断人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点。在一些实施方案中，第二连接子的构象允许KIR与人HLA 1类重链序列结合，从而阻止“丧失自我”免疫应答。在一些实施方案中，第二连接子的构象阻止一个或多个自然杀伤细胞的攻击。

在一些实施方案中，一个或多个连接子中的连接子包含与下表C中列出的序列具有至少约70％、约80％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.9％或约100％同一性的序列。

表C.连接子序列

在一些实施方案中，一个或多个人白细胞抗原(HLA)包含一个或多个突变，其中当复合物被一个或多个CD8细胞询问时，一个或多个突变抑制一个或多个HLA引发T细胞应答。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基115、122、128、194、197、198、212、214、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、243、245、248、262中的一个或多个或其任何组合的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基115的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基122的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基128的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基194的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基197的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基198的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基212的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基214的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基222的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基223的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基224的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基225的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基226的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基227的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基228的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基229的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基230的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基231的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基232的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基233的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基243的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基245的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基248的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基262的突变。

在一些实施方案中，复合物进一步包含抑制补体系统的免疫应答的一个或多个蛋白质或其片段。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段选自CD48、CD59或其组合。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段是CD48。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段是CD59。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段是CD48和CD59。

在一些实施方案中，肽包含选自L、M、S、I、F、T、V和Y的第二氨基酸残基。在一些实施方案中，第二氨基酸残基选自T、V和Y。在一些实施方案中，肽包含选自V、I、F、W、Y、L、R和K的最末氨基酸残基。在一些实施方案中，最末氨基酸残基选自Y、L、R和K。

在一些实施方案中，肽包含选自E、P、L、Q、A、R、H、S、T、V、M、D和K的第二氨基酸残基。在一些实施方案中，第二氨基酸残基选自E、P、L、Q、A、R和H。在一些实施方案中，肽包含选自V、L、F、A、I、Y、M、W、P和R的最末氨基酸残基。在一些实施方案中，最末氨基酸残基选自V、L和F。

在一些实施方案中，肽包含选自A、Y、S、T、V、I、L、F、Q、R、N和W的第二氨基酸残基。在一些实施方案中，第二氨基酸残基选自A和Y。在一些实施方案中，肽包含选自L、V、M、F、Y和I的最末氨基酸残基。在一些实施方案中，最末氨基酸残基是L。

核酸分子

在另一方面，本文提供了一种编码本文提供的复合物的核酸分子。

在一些实施方案中，核酸分子包含内源性HLA基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座或其任何组合中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-B基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-C基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A基因座和HLA-B基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A基因座和HLA-C基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-B基因座和HLA-C基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A基因座、HLA-B基因座和HLA-C基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失是内源性HLA基因座的完全缺失。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码人HLA 1类重链序列的序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-B序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-C序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列和HLA-B序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列和HLA-C序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-B序列和HLA-C序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列和HLA-C序列。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-B序列的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-C序列的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列的多个等位基因和HLA-B序列的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列的多个等位基因和HLA-C序列的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-B序列的多个等位基因和HLA-C序列的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列的多个等位基因、HLA-B序列的多个等位基因和HLA-C序列的多个等位基因。

在一些实施方案中，HLA-A序列的等位基因选自HLA-A*02:01、HLA-A*01:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*24:02、HLA-A*29:02、HLA-A*26:01、HLA-A*32:01、HLA-A*23:01、HLA-A*68:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*34:02、HLA-A*31:01、HLA-A*33:03、HLA-A*02:07、HLA-A*02:06和HLA-A*02:03。

在一些实施方案中，HLA-B序列的等位基因选自HLA-B*44:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-B*40:01、HLA-B*35:01、HLA-B*51:01、HLA-B*15:01、HLA-B*53:01、HLA-B*15:03、HLA-B*58:01、HLA-B*45:01、HLA-B*42:01、HLA-B*44:03、HLA-B*18:01、HLA-B*52:01、HLA-B*14:02、HLA-B*46:01、HLA-B*38:02和HLA-B*15:02。

在一些实施方案中，HLA-C序列的等位基因选自HLA-C*07:01、HLA-C*07:02、HLA-C*04:01、HLA-C*05:01、HLA-C*03:04、HLA-C*06:02、HLA-C*03:03、HLA-C*12:03、HLA-C*08:02、HLA-C*02:02、HLA-C*16:01、HLA-C*17:01、HLA-C*01:02、HLA-C*02:01、HLA-C*08:01、HLA-C*03:02和HLA-C*14:02。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列，其中HLA-A序列被置换到HLA-B序列和HLA-C序列之间。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1700个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1600个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1500个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1400个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1300个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1200个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1100个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1000个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于900个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于800个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于700个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于600个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于500bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于450bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于400bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于350bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于300bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于250bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于200bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于150bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于100bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于50bp。

在一些实施方案中，HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-A序列包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-B序列包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-C序列包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-A序列和HLA-B序列包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-A序列和HLA-C序列包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-B序列和HLA-C序列包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，HLA-A序列、HLA-B序列和HLA-C包含一个或多个侧翼序列。

在一些实施方案中，一个或多个侧翼序列包含内源性HLA序列。在一些实施方案中，一个或多个侧翼序列对一个或多个启动子具有特异性。在一些实施方案中，启动子包含HLA-A启动子、HLA-B启动子、HLA-C启动子或其组合。在一些实施方案中，HLA-A序列包含内源性HLA-A启动子。在一些实施方案中，HLA-B序列包含内源性HLA-B启动子。在一些实施方案中，HLA-C序列包含内源性HLA-C启动子。在一些实施方案中，HLA-A序列包含内源性HLA-A启动子，并且HLA-B序列包含内源性HLA-B启动子。在一些实施方案中，HLA-A序列包含内源性HLA-A启动子，并且HLA-C序列包含内源性HLA-C启动子。在一些实施方案中，HLA-B序列包含内源性HLA-B启动子，并且HLA-C序列包含内源性HLA-C启动子。在一些实施方案中，HLA-A序列包含内源性HLA-A启动子，HLA-B序列包含内源性HLA-B启动子，并且HLA-C序列包含内源性HLA-C启动子。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-B序列的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-C序列的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列或HLA-B序列的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列或HLA-C序列的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-B序列或HLA-C序列的至少一部分。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列、HLA-B序列或HLA-C序列的至少一部分。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码人β2-微球蛋白肽的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码内源性人β2-微球蛋白肽的序列。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码肽的序列。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含一个或多个序列，该一个或多个序列编码在编码肽的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列之间的一个或多个接头。在一些实施方案中，编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的序列被置换到编码肽的序列和编码人β2-微球蛋白肽的序列之间、编码人β2-微球蛋白肽的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列之间，或二者兼而有之。在一些实施方案中，编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的序列被置换到编码肽的序列和编码人β2-微球蛋白肽的序列之间。在一些实施方案中，编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的序列被置换到编码人β2-微球蛋白肽的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列之间。在一些实施方案中，编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的第一序列被置换到编码肽的序列和编码人β2-微球蛋白肽的序列之间，并且编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的第二序列被置换到编码人β2-微球蛋白肽的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列之间。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码一个或多个免疫检查点激动剂的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码CD47的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码PD-L1的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码A2AR的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码B7-H3的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码B7-H4的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码BTLA的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码CTLA-4的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码IDO的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码KIR的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码LAG3的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码NOX2的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码PD-1的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码TIM-3的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码VISTA的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码SIGLEC7的序列。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码与一个或多个免疫检查点激动剂的受体对应的一个或多个敲除蛋白质的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的CD47受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的PD-L1受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的A2AR受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的B7-H3受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的B7-H4受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的BTLA受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的CTLA-4受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的IDO受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的KIR受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的LAG3受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的NOX2受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的PD-1受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的TIM-3受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的VISTA受体的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的SIGLEC7受体的序列。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-E序列或其片段。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-F序列或其片段。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-G序列或其片段。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-E序列或其片段和HLA-F序列或其片段。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-E序列或其片段和HLA-G序列或其片段。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-F序列或其片段和HLA-G序列或其片段。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段和HLA-G序列或其片段。

在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合中的至少一个被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-F序列或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-G序列或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段和HLA-F序列或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段和HLA-G序列或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-F序列或其片段和HLA-G序列或其片段被抑制引发T细胞应答。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段和HLA-G序列或其片段被抑制引发T细胞应答。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码对应于II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)的一个或多个敲除蛋白质的序列。在一些实施方案中，敲除整个II类主要组织相容性复合体反式激活因子(CIITA)基因座。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码调节肽的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码凋亡诱导肽的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码凋亡诱导肽以充当“杀伤开关”的序列。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码表位的序列，该表位被配置成允许检测复合物。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码包含3,5-二硝基水杨酸的表位的序列。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码一个或多个敲除蛋白质的序列。在一些实施方案中，一个或多个敲除蛋白质选自血型A抗原和血型B抗原。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的血型A抗原的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码敲除的血型B抗原的序列。

在一些实施方案中，核酸分子包含：

a.编码肽的序列；

b.编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的编码第一连接子的第一序列；

c.编码人β2-微球蛋白肽的序列；

d.编码一个或多个连接子的一个或多个序列中的编码第二连接子的第二序列；和

e.编码人HLA 1类重链序列的序列。

在另一方面，本文提供了一种核酸分子，其包含编码包含一个或多个1类人白细胞抗原(HLA)蛋白的复合物的序列，其中当复合物被一个或多个T细胞询问时，一个或多个1类HLA蛋白被抑制引发T细胞应答，并且其中核酸分子包含：

a.编码肽的序列，其中肽不能激活一个或多个T细胞；

b.编码第一连接子的第一序列；和

c.编码一个或多个1类HLA蛋白的序列；

其中第一连接子包含被配置成不阻断人HLA 1类重链序列上的一个或多个杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)结合位点的构象，并且其中构象被进一步配置成抵抗蛋白水解切割。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含在编码连接子的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列之间的编码人β2-微球蛋白肽的序列。在一些实施方案中，核酸分子进一步包含在编码连接子的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列之间的编码内源性人β2-微球蛋白肽的序列。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含一个或多个突变，其中当人HLA 1类重链序列被一个或多个CD8细胞询问时，一个或多个突变抑制人HLA 1类重链序列引发T细胞应答。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基115、122、128、194、197、198、212、214、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、243、245、248、262中的一个或多个或其任何组合的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基115的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基122的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基128的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基194的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基197的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基198的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基212的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基214的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基222的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基223的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基224的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基225的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基226的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基227的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基228的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基229的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基230的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基231的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基232的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基233的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基243的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基245的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基248的突变。在一些实施方案中，一个或多个突变包括氨基酸残基262的突变。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码抑制补体系统的免疫应答的一个或多个蛋白质或其片段的序列。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段选自CD48、CD59或其组合。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段是CD48。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段是CD59。在一些实施方案中，一个或多个蛋白质或其片段是CD48和CD59。

在另一方面，本文提供了一种用于生成本文提供的核酸分子的方法，其包括置换对区域进行编码的序列，该区域被配置成接收包含HLA基因座中的缺失的序列、编码人HLA1类重链序列的序列或其任何组合。在一些实施方案中，方法包括置换对区域进行编码的序列，该区域被配置成接收包含HLA基因座中的缺失的序列。在一些实施方案中，方法包括置换对区域进行编码的序列，该区域被配置成接收编码人HLA 1类重链序列的序列。在一些实施方案中，方法包括置换对区域进行编码的序列，该区域被配置成接收包含HLA基因座中的缺失的序列和编码人HLA 1类重链序列的序列。

无免疫能力细胞

在另一方面，本文提供了一种制备无免疫能力细胞的方法，其包括向细胞施用本文提供的复合物或本文提供的核酸分子。

在一些实施方案中，核酸分子被递送到细胞的基因组。在一些实施方案中，细胞与复合物一起孵育。

在一些实施方案中，细胞是干细胞。在一些实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。

在一些实施方案中，无免疫能力细胞适合用于细胞疗法。在一些实施方案中，无免疫能力细胞适合用于施用于对象而不会引起免疫应答。

基因疗法/书写的其它方法

载体和核酸

可以将多种核酸引入到细胞中，用于敲除目的，或用以获得基因的表达以用于其它目的。核酸构建体可以用于产生包含靶核酸序列的转基因细胞。如本文所使用，术语核酸或“核酸分子”包括DNA、RNA和核酸类似物以及双链或单链(即，有义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架处进行修饰，以改善例如核酸的稳定性、杂交或溶解性。碱基部分处的修饰包括脱氧胸苷的脱氧尿苷以及脱氧胞苷的5-甲基-2′-脱氧胞苷和5-溴-2′-脱氧胞苷。糖部分的修饰包括核糖的2′羟基的修饰，以形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸酯骨架可以被修饰以产生吗啉核酸，其中每个碱基部分与六元吗啉环或肽核酸连接，其中脱氧磷酸酯骨架被假肽骨架替代，而四个碱基被保留。参见Summerton和Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187；和Hyrup等人(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5。此外，脱氧磷酸酯骨架可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、亚磷酰胺或烷基磷酸三酯骨架替代。

靶核酸序列可以可操作地连接到调节区，诸如启动子。调节区可以来自任何物种。如本文所使用，可操作地连接是指调节区相对于核酸序列的定位，以允许或促进靶核酸的转录。

任何类型的启动子都可以可操作地连接到靶核酸序列。启动子的实例包括但不限于组织特异性启动子、组成型启动子和对特定刺激有反应或无反应的启动子。合适的组织特异性启动子可以导致核酸转录物在β细胞中的优先表达，并且包括例如人胰岛素启动子。其它组织特异性启动子可以导致例如肝细胞或心脏组织中的优先表达，并且可以分别包括白蛋白或α-肌球蛋白重链启动子。在其它实施方案中，可以使用促进核酸分子的表达而没有显著的组织或时间特异性的启动子(即，组成型启动子)。例如，可以使用β-肌动蛋白启动子，诸如鸡β-肌动蛋白基因启动子、泛素启动子、miniCAGs启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及病毒启动子，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，使用鸡β肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合体作为启动子。参见例如Xu等人(2001)Hum.Gene Ther.12:563；和Kiwaki等人(1996)Hum.Gene Ther.7:821。

诱导型启动子的一个实例是四环素(tet)可调控启动子系统，它可以用于调节核酸的转录。在本系统中，突变的Tet阻遏因子(TetR)融合到单纯疱疹病毒VP 16反式激活因子蛋白的激活结构域，以产生四环素控制的转录激活因子(tTA)，该转录激活因子由tet或多西环素(dox)调节。在不存在抗生素的情况下，转录是最小的，而在存在tet或dox的情况下，诱导了转录。可替代的诱导型系统包括蜕皮素或雷帕霉素系统。蜕皮素是一种昆虫蜕皮激素，其产生由蜕皮素受体的异二聚体和超气门基因(ultraspiracle gene，USP)的产物控制。表达通过用蜕皮素或诸如米乐甾酮A等蜕皮素类似物处理来诱导。向对象施用以触发诱导型系统的试剂被称为诱导剂。

可以用于核酸构建体的其它调节区包括但不限于聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如，内部核糖体进入区段，IRES)、增强子、诱导型元件或内含子。这种调节区可能不是必需的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性、翻译效率等来增加表达。这种调节区可以根据需要包含在核酸构建体中，以获得核酸在细胞中的最佳表达。然而，有时没有这些另外的元件的情况下也可能获得足够的表达。

可以使用编码信号肽或可选择标志物的核酸构建体。可以使用信号肽，使得所编码的多肽被导向特定的细胞位置(例如，细胞表面)。可选择标志物的非限制性实例包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo，G418，APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)和叶黄素-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。这种标志物可用于选择培养中的稳定转化体。其它可选择标志物包括荧光多肽，诸如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

在一些实施方案中，编码可选择标志物的序列的侧翼可以是重组酶的识别序列诸如，例如Cre或Flp。例如，可选择标志物的侧翼可以是loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34bp识别位点)或FRT识别位点，使得可选择标志物可以从构建体切除。参见Orban等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861,关于Cre/lox技术的综述；以及Brand和Dymecki,Dev.Cell(2004)6:7。含有被可选择标志物基因中断的Cre或Flp可激活转基因的转座子也可以用于获得转基因有条件表达的转基因细胞。

在一些实施方案中，靶核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包括编码“标签”的标签序列，“标签”被设计成便于所编码的多肽的后续操纵(例如，便于定位或检测)。可以将标签序列插入编码多肽的核酸序列中，使得所编码的标签位于多肽的羧基或氨基末端。所编码的标签的非限制性实例包括谷胱甘肽S转移酶(GST)和FLAG

在其它实施方案中，靶核酸序列诱导针对靶核酸的RNA干扰，使得靶核酸的表达减少。例如，靶核酸序列可以诱导针对编码囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)多肽的核酸的RNA干扰。例如，与CFTR DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)可以用于减少DNA的表达。siRNA的构建体可以如例如Fire等人(1998)Nature 391:806；Romano和Masino(1992)Mol.Microbiol.6:3343；Cogoni等人(1996)EMBO J.15:3153；Cogoni和Masino(1999)Nature399:166；Misquitta和Paterson(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:1451；以及Kennerdell和Carthew(1998)Cell 95:1017中来产生。shRNA的构建体可以如McIntyre和Fanning(2006)BMC Biotechnology 6:1中来产生。通常，shRNA被转录为含有互补区域的单链RNA分子，其可以退火并形成短发夹。

可以使用多种技术将核酸构建体引入到任何类型的胚胎、胎儿或成体细胞中，包括例如诸如卵母细胞或卵子等生殖细胞、祖细胞、成体或胚胎干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、原始生殖细胞、诸如PK-15细胞等肾细胞、胰岛细胞、β细胞、肝细胞或诸如皮肤成纤维细胞等成纤维细胞。技术的非限制性实例包括使用转座子系统、可以感染细胞的重组病毒、脂质体或其它非病毒方法，诸如电穿孔、显微注射或磷酸钙沉淀，它们能够将核酸递送到细胞。

在转座子系统中，核酸构建体的转录单位，即可操作地连接到靶核酸序列的调节区的侧翼是转座子的反向重复序列。已经开发了数个转座子系统，包括例如SleepingBeauty(参见美国专利第6,613,752号和美国公开号2005/0003542)；Frog Prince(Miskey等人(2003)Nucleic Acids Res.31:6873)；Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology8(增刊1):S7；Minos(Pavlopoulos等人(2007)Genome Biology 8(增刊1):S2)；Hsmar1(Miskey等人(2007))Mol Cell Biol.27:4589)；和Passport，来将核酸引入到细胞中。SleepingBeauty和Passport转座子特别有用。转座酶可以作为蛋白质递送，在与靶核酸相同的核酸构建体上编码，可以在单独的核酸构建体上引入，或者作为mRNA提供(例如，体外转录和加帽的mRNA)。

核酸构建体中还可以包含绝缘子元件，以维持靶核酸的表达并抑制宿主基因的不需要的转录。参见例如美国公开号2004/0203158。通常，绝缘子元件位于转录单位的每一侧的侧翼，并且在转座子的反向重复序列的内部。绝缘子元件的非限制性实例包括基质附着区(MAR)型绝缘子元件和边界型绝缘子元件。参见例如美国专利第6,395,549号、第5,731,178号、第6,100,448号和第5,610,053号以及美国公开号2004/0203158。

核酸可以并入到载体中。载体是一个广义的术语，其包含被设计成从载剂移动到靶DNA中的任何特定DNA区段。载体可以被称为表达载体或载体系统，其是将DNA插入到基因组或其它靶向DNA序列(诸如，附加体、质粒或甚至病毒/噬菌体DNA区段)中所需的一组组分。用于对象中的基因递送的载体系统，诸如病毒载体(例如，逆转录病毒、腺相关病毒和整合噬菌体病毒)和非病毒载体(例如，转座子)具有两个基本组分：1)包含DNA(或逆转录成cDNA的RNA)的载体，和2)转座酶、重组酶或识别载体和DNA靶序列并将载体插入到靶DNA序列中的其它整合酶。载体最通常含有一个或多个表达盒，表达盒包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制和调节另一个DNA序列或mRNA的转录和/或翻译的DNA序列。

许多不同类型的载体是已知的。例如，已知质粒和病毒载体，例如逆转录病毒载体。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点、合适的启动子和任选的增强子，并且还具有任何必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5’侧翼非转录序列。载体的实例包括：质粒(其也可以是另一类型载体的载剂)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如，HIV-1、SIV或FIV)、逆转录病毒(例如，ASV、ALV或MoMLV)和转座子(例如，Sleeping Beauty、P-元件、Tol-2、Frog Prince、piggyBac)。

在其它方面，本文提供了另一种将编码一个或多个人白细胞抗原(HLA)的核酸分子递送到细胞的方法。在一些实施方案中，方法包括经由病毒载体递送编码一个或多个HLA的核酸分子。在一些实施方案中，方法包括经由非病毒载体递送编码一个或多个HLA的核酸分子。在一些实施方案中，病毒载体衍生自慢病毒。

在一些实施方案中，核酸分子包含内源性HLA基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座或其任何组合中的缺失。在一些实施方案中，缺失是内源性HLA基因座的完全缺失。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码人HLA 1类重链序列的序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列，其中HLA-A序列被置换到HLA-B序列和HLA-C序列之间。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1700个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于500bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于250bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于150bp。

在一些实施方案中，HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，一个或多个侧翼序列包含内源性HLA序列。在一些实施方案中，一个或多个侧翼序列对一个或多个启动子具有特异性。在一些实施方案中，启动子包含HLA-A启动子、HLA-B启动子、HLA-C启动子或其组合。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合的至少一部分。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的核酸分子包含HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合中的至少一个被抑制引发T细胞应答。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的核酸分子包含一个或多个突变，其中当包含有包含一个或多个突变的突变型人HLA 1类重链序列的细胞被一个或多个CD8细胞询问时，细胞不引发免疫应答。在一些实施方案中，突变的人HLA 1类重链序列编码在氨基酸残基115、122、128、194、197、198、212、214、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、243、245、248、262中的一个或多个或其任何组合处包含一个或多个突变的HLA。

模板化和非模板化修复

靶向核酸内切酶技术，诸如锌指核酸酶(ZFN)、TAL效应子核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸内切酶cas9(CRISPR/Cas9)，可以用于通过将插入和/或缺失(插入-缺失)引入到物种的基因组中，诸如通过非同源末端连接(NHEJ)来破坏基因功能。然而，通过NHEJ引入的插入-缺失在大小和序列上是可变的，这使得筛选功能性破坏的克隆变得困难，并且不能进行精确的改变。TALEN或CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(HDR)支持在真核细胞中引入限定的核苷酸变化。

可以使用TALEN、锌指核酸酶或其它遗传工程工具，包括各种已知的载体，来对对象进行修饰。通过这种工具进行的遗传修饰可以包括基因失活。术语基因失活是指阻止功能基因产物的形成。基因产物只有在实现其正常(野生型)功能时才具有功能性。遗传修饰对象的材料和方法进一步详述于2012年2月24日提交的美国序列号13/404,662、2012年5月9日提交的序列号13/467,588和2009年11月10日提交的序列号12/622,886中，其出于所有目的由此通过引用并入本文；在冲突的情况下，以本说明书为准。术语反式作用指的是作用于来自不同分子的(即，分子间)靶基因的过程。反式作用元件通常是含有基因的DNA序列。此基因编码用于调节靶基因的蛋白质(或微小RNA或其它可扩散分子)。反式作用基因可能与靶基因在同一条染色体上，但其活性是经由其编码的中间蛋白或RNA实现的。使用显性阴性的基因失活通常涉及反式作用元件。术语顺式调节或顺式作用意指不编码蛋白质或RNA的作用；在基因失活的语境中，这通常意指基因的编码部分或功能基因表达所必需的启动子和/或操纵子的失活。

本领域已知的各种技术可以用于将核酸构建体引入到非人和人中以产生建立者系(founder line)，其中核酸构建体整合到基因组中。这些技术包括但不限于原核显微注射(美国专利第4,873,191号)、逆转录病毒介导的基因向生殖细胞系中的转移(Van derPutten等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6148-1652)、胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等人(1989)Cell 56,313-321)、胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3,1803-1814)、精子介导的基因转移(Lavitrano等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230-14235；Lavitrano等人(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)、以及诸如卵丘或乳腺细胞等体细胞或成体、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，并随后进行核移植(Wilmut等人(1997)Nature 385,810-813；和Wakayama等人(1998)Nature 394,369-374)。原核显微注射、精子介导的基因转移和体细胞核转移是特别有用的技术，以及细胞质注射、原始生殖细胞移植(Brinster)和胚泡嵌合体生产，由此生殖细胞在胚胎中繁殖。

TALEN、锌指核酸酶、CRISPR核酸酶(例如，CRISPR/Cas9)和重组酶融合蛋白可以在有或没有模板的情况下使用。模板是添加到细胞中用于细胞修复机制的外源性DNA，其用作修复DNA中的双链断裂(DSB)的向导(模板)。这个过程通常被称为同源定向修复(HDR)。没有模板的过程涉及制造DSB和提供细胞机制来进行通常不太完美的修复，以便进行插入或缺失(插入-缺失)。被称为非同源末端连接(NHEJ)的细胞途径通常介导DSB的非模板化修复。术语NHEJ通常用来是指所有这类非模板化修复，无论是否涉及NHEJ或替代细胞途径。

靶向核酸酶系统

基因组编辑工具，诸如转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)和锌指核酸酶(ZFN)已经影响了多种生物体中的生物技术、基因疗法和功能基因组研究的领域。最近，RNA引导的核酸内切酶(RGEN)被互补的RNA分子导向它们的靶位点。Cas9/CRISPR系统就是RGEN。tracrRNA是另一个这样的工具。这些是靶向核酸酶系统的实例：这些系统具有将核酸酶定位到靶位点的DNA结合成员。然后，位点被核酸酶切割。TALEN和ZFN具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在靶DNA上找到彼此的同源物。DNA结合成员在染色体DNA中具有同源序列。DNA结合成员通常根据预期的同源序列进行设计，以便在预期位点或其附近获得溶核作用。某些实施方案无限制地适用于所有这样的系统；包括最小化核酸酶再切割的实施方案、在预期残基处精确制造SNP的实施方案、在预期残基上精确制造插入-缺失的实施方案以及将所渗入的等位基因在DNA结合位点处的放置。

锌指核酸酶(ZFN)

锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合结构域融合到DNA切割结构域而生成的人工限制性酶。锌指结构域可以被工程改造成靶向期望的DNA序列，并且这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。通过利用内源性DNA修复机制，这些试剂可以用于改变高等生物体的基因组。ZFN可以用于失活基因的方法中。

锌指DNA结合结构域具有大约30个氨基酸，并且折叠成稳定的结构。每个指主要与DNA底物中的三联体结合。关键位置处的氨基酸残基参与了大多数与DNA位点的序列特异性相互作用。这些氨基酸可以改变，同时维持其余的氨基酸以保持必要的结构。与更长的DNA序列的结合是通过串联连接数个结构域来实现的。其它功能，如非特异性FokI切割结构域(N)、转录激活因子结构域(A)、转录阻遏因子结构域(R)和甲基化酶(M)，可以融合到ZFP，以分别形成ZFN、锌指转录激活因子(ZFA)、锌指转录阻遏因子(ZFR)和锌指甲基化酶(ZFM)。

转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)

如本文所使用，术语TALEN是广义的，并且包括无需另一TALEN的帮助即可以切割双链DNA的单体TALEN，例如如Beurdeley,M.等人Compact designer TALENs forefficient genome engineering.Nat.Commun.4:1762doi:10.1038/ncomms2782(2013)中。术语TALEN也用于指被工程改造成一起工作以切割同一位点处的DNA的一对TALEN中的一个或两个成员。一起工作的TALEN可以被称为左TALEN和右TALEN，这是指DNA或TALEN对的利手性。

在一些实施方案中，可以使用单体TALEN。TALEN通常跨具有间隔子的二分识别位点起二聚体的作用，使得两个TAL效应子结构域各自融合到FokI限制性酶的催化结构域，每个所得的TALEN的DNA识别位点被间隔子序列分开，并且每个TALEN单体与识别位点的结合允许FokI二聚化并在间隔子内产生双链断裂。然而，也可以构建单体TALEN，使得单个TAL效应子融合到不需要二聚化来发挥功能的核酸酶。例如，一种此类核酸酶是FokI的单链变体，其中两个单体被表达为单一多肽。其它天然存在的或经工程改造的单体核酸酶也可以起到这种作用。用于单体TALEN的DNA识别结构域可以衍生自天然存在的TAL效应子。可替代地，DNA识别结构域可以被工程改造成识别特异性DNA靶标。经工程改造的单链TALEN可能更容易构建和部署，因为它们只需要一个经工程改造的DNA识别结构域。二聚DNA序列特异性核酸酶可以使用两个不同的DNA结合结构域(例如，一个TAL效应子结合结构域和来自另一类型分子的一个结合结构域)来生成。TALEN可以跨具有间隔子的二分识别位点起二聚体的作用。这种核酸酶结构也可以用于由例如一个TALEN单体和一个锌指核酸酶单体生成的靶标特异性核酸酶。在这种情况下，TALEN和锌指核酸酶单体的DNA识别位点可以通过适当长度的间隔子分开。两个单体的结合可以允许FokI二聚化并在间隔子序列内产生双链断裂。除了锌指之外的DNA结合结构域，诸如同源结构域、myb重复序列或亮氨酸拉链，也可以融合到FokI，并作为TALEN单体的伴侣来产生功能性核酸酶。

在一些实施方案中，TAL效应子可以用于将其它蛋白结构域(例如，非核酸酶蛋白结构域)靶向特异性核苷酸序列。例如，TAL效应子可以连接到蛋白结构域，蛋白结构域来自但不限于DNA 20相互作用酶(例如，甲基化酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶或连接酶)、转录激活因子或阻遏因子、或与诸如组蛋白等其它蛋白质相互作用或对其进行修饰的蛋白质。这种TAL效应子融合的应用包括例如产生或修饰表观遗传调节元件，在DNA中进行位点特异性插入、缺失或修复，控制基因表达，以及修饰染色质结构。

可以选择或改变靶序列的间隔子来调节TALEN特异性和活性。间隔子长度的灵活性表明，可以选择间隔子长度来以高特异性靶向特定序列。此外，对于不同的间隔子长度，已经观察到活性的变化，这表明可以选择间隔子长度以实现期望水平的TALEN活性。

替代实施方案使用替代的mRNA聚合酶和同源结合位点，诸如T7或SP6。其它实施方案涉及使用UTR序列的几种改变中的任何一种；这些可能有利于mRNA的翻译。一些实例是：在3′UTR中添加细胞质多聚腺苷酸化元件结合位点，或者用来自人、猪、牛、绵羊、山羊、斑马鱼、来自包含B-球蛋白的基因的UTR序列替换非洲爪蟾β-球蛋白UTR。可以选择来自基因的UTR来调节胚胎发育或细胞中的表达。可能有用的UTR的一些实例包括β-肌动蛋白、DEAH(SEQ ID NO:527)、TPT1、ZF42、SKP1、TKT、TP3、DDX5、EIF3A、DDX39、GAPDH、CDK1、Hsp90ab1、Ybx1 fEif4b Rps27a Stra13、Myc、Paf1和Foxo1或CHUK。这种载体或mRNA改进可以用于指导异位TALEN的特殊或暂时表达，以研究期望开发阶段的基因缺失。

在一些实施方案中，可以使用单体TALEN。TALEN通常跨具有间隔子的二分识别位点起二聚体的作用，使得两个TAL效应子结构域各自融合到FokI限制性酶的催化结构域，每个所得的TALEN的DNA识别位点被间隔子序列分开，并且每个TALEN单体与识别位点的结合允许FokI二聚化并在间隔子内产生双链断裂。然而，也可以构建单体TALEN，使得单个TAL效应子融合到不需要二聚化来发挥功能的核酸酶。例如，一种此类核酸酶是FokI的单链变体，其中两个单体被表达为单一多肽。其它天然存在的或经工程改造的单体核酸酶也可以起到这种作用。用于单体TALEN的DNA识别结构域可以衍生自天然存在的TAL效应子。可替代地，DNA识别结构域可以被工程改造成识别特异性DNA靶标。经工程改造的单链TALEN可能更容易构建和部署，因为它们只需要一个经工程改造的DNA识别结构域。二聚DNA序列特异性核酸酶可以使用两个不同的DNA结合结构域(例如，一个TAL效应子结合结构域和来自另一类型分子的一个结合结构域)来生成。TALEN可以跨具有间隔子的二分识别位点起二聚体的作用。这种核酸酶结构也可以用于由例如一个TALEN单体和一个锌指核酸酶单体生成的靶标特异性核酸酶。在这种情况下，TALEN和锌指核酸酶单体的DNA识别位点可以通过适当长度的间隔子分开。两个单体的结合可以允许FokI二聚化并在间隔子序列内产生双链断裂。除了锌指之外的DNA结合结构域，诸如同源结构域、myb重复序列或亮氨酸拉链，也可以融合到FokI，并作为TALEN单体的伴侣来产生功能性核酸酶。

术语核酸酶包括核酸外切酶和核酸内切酶。术语核酸内切酶是指能够催化DNA或RNA分子(优选DNA分子)内的核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型或变体酶。核酸内切酶的非限制性实例包括II型限制性核酸内切酶，诸如FokI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCl、EcoRI、BglII和AhwI。当通常具有长度为约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点时，核酸内切酶还包括稀切核酸内切酶。稀切核酸内切酶在限定位点处诱导DNA双链断裂(DSB)。稀切核酸内切酶可以例如是归巢核酸内切酶，其是一种嵌合锌指核酸酶(ZFN)，由经工程改造的锌指结构域与诸如FokI等限制性酶或化学核酸内切酶的催化结构域融合产生。在化学核酸内切酶中，化学或肽切割酶缀合到核酸聚合物或识别特异性靶序列的另一DNA，从而将切割活性靶向特异性序列。化学核酸内切酶还涵盖合成核酸酶，如邻菲咯啉(一种DNA切割分子)和三链体形成寡核苷酸(TFO)的缀合物，已知其可结合特异性DNA序列。这种化学核酸内切酶包括在根据本发明的术语“核酸内切酶”中。这种核酸内切酶的实例包括I-See I、I-Chu L I-Cre I、I-Csm I、PI-See L PI-Tti L PI-Mtu I、I-Ceu I、I-See IL 1-See III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr L PI-Aae I、PI-Bsu I、PI-Dha I、PI-Dra LPI-May L PI-Meh I、PI-Mfu L PI-Mfl I、PI-Mga L PI-Mgo I、PI-Min L PI-Mka L PI-Mle I、PI-Mma I、PI-30Msh L PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-PfuL PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp L PI-Fae L PI-Mja I、PI-Pho L PI-Tag L PI-Thy I、PI-Tko I、PI-Tsp I、I-Msol。

通过TALEN或其它工具进行的遗传修饰可以例如选自插入、缺失、外源性核酸片段的插入和取代。术语“插入”被广泛地用于意指字面上的插入到染色体中或使用外源性序列作为模板进行修复。通常，标识靶DNA位点，并产生将与位点特异性结合的TALEN对。TALEN被递送到细胞或胚胎，例如作为蛋白质、mRNA或通过编码TALEN的载体。TALEN切割DNA以产生双链断裂，双链断裂随后被修复，这通常导致插入-缺失的产生或掺入伴随外源性核酸中含有的序列或多态性，外源性核酸被插入到染色体中或作为模板以用修饰序列对断裂进行修复。这种模板驱动的修复是改变染色体的有用过程，并且提供了对细胞染色体的有效改变。

术语外源性核酸意指添加到细胞或胚胎中的核酸，无论核酸与细胞中天然的核酸序列是否相同。在一些情况下，外源性核酸的序列不同于细胞内天然存在的任何核酸序列。术语核酸片段是广义的，并且包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA或其部分。

细胞的遗传修饰也可以包括报道基因的插入。报道基因可以是例如荧光标志物，例如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。报道基因可以是选择标志物，例如嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo，G418，APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)或叶黄素-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。报道基因、选择标志物和/或一个或多个TALEN的载体可以是质粒，

TALEN可以被导向多个DNA位点。位点可以被数千或更多个碱基对分开。DNA可以通过细胞机制重新连接，从而导致位点之间的整个区域的缺失。实施方案包括例如位点分隔的距离为1-5兆碱基，或染色体的50％至80％，或约100至约1,000,000个碱基对；技术人员将立即了解，明确陈述的范围内的所有范围和值都是考虑在内的，例如约1,000至约10,000个碱基对或约500至约500,000个碱基对。可替代地，可以将外源性DNA添加到细胞或胚胎中，以进行外源性DNA的插入，或进行位点之间的DNA的模板驱动修复。多个位点处的修饰可以用于制造经遗传修饰的细胞、胚胎、偶蹄动物和家畜。可以选择一个或多个基因进行完全或至少部分缺失，包括性成熟基因或其顺式作用因子。

重组酶

本发明的实施方案包括与重组酶或与DNA重组相关的其它DNA结合蛋白一起施用一个或多个TALEN。重组酶与核酸片段形成细丝，并且实际上搜索细胞DNA以找到与序列基本上同源的DNA序列。TALEN重组酶实施方案的一个实施方案包括将重组酶与用作HDR模板的核酸序列组合。HDR模板序列与供TALEN/TALEN对切割的靶向位点有很大的同源性。如本文所述，HDR模板通过等位基因的放置、插入-缺失的产生、外源性DNA的插入或其它改变，为天然DNA提供了改变。TALEN通过本文描述的方法作为蛋白质、mRNA或通过使用载体放置在细胞或胚胎中。重组酶与HDR模板组合以形成细丝并放置到细胞中。重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板可以作为蛋白质、mRNA或用编码重组酶的载体放置在细胞或胚胎中。术语重组酶是指一种遗传重组酶，其在细胞中酶促催化两条相对较长的DNA链之间相对较短的DNA片段的连接。重组酶包括Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre和FLP。Cre重组酶是来自P1噬菌体的I型拓扑异构酶，其催化loxP位点之间的DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是在沙门氏菌属细菌中发现的由198个氨基酸组成的21kD蛋白质。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖活性位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是人基因。由此基因编码的蛋白质是RAD51蛋白家族的成员，其有助于修复DNA双链断裂。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51基因同源。Cre重组酶是在实验中用于删除侧接loxP位点的特异性序列的酶。FLP是指衍生自面包酵母酿酒酵母的2μ质粒的翻转酶重组酶(FLP或Flp)。

在本文中，“RecA”或“RecA蛋白”是指具有基本上全部或大部分相同功能的RecA样重组蛋白家族，特别是：(i)将寡核苷酸或多核苷酸适当地定位在其同源靶标上以便随后通过DNA聚合酶延伸的能力；(ii)在拓扑上为DNA合成准备双链体核酸的能力；和(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物有效发现互补序列并与其结合的能力。最具特征的RecA蛋白来自大肠杆菌；除了蛋白质的原始等位基因形式外，还标识了许多突变的RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇、包括人在内的哺乳动物和植物。这些蛋白质包括例如Recl、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2和DMC1。重组蛋白的一个实施方案是大肠杆菌的RecA蛋白。可替代地，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白、来自另一细菌来源的RecA蛋白或来自另一生物体的同源重组蛋白。

已知RecA的重组酶活性在通过同源重组修复双链断裂期间催化链交换(McGrew和Knight,2003；Radding等人,1981；Seitz等人,1998)。也已证明了RecA可催化蛋白水解，例如LexA和X阻遏因子蛋白的蛋白水解，并具有DNA依赖性ATP酶活性。在因电离辐射或一些其它损伤导致双链断裂后，核酸外切酶回切(chew back)DNA末端5’至3’，从而暴露一条DNA链(Cox,1999；McGrew和Knight,2003)。单链DNA通过单链结合蛋白(SSB)变得稳定。结合SSB后，RecA结合单链(ss)DNA并形成螺旋核蛋白细丝(称为细丝或联会前细丝)。在DNA修复期间，RecA的同源搜索功能将细丝导向同源DNA，并催化同源碱基配对和链交换。这导致DNA异源双链体的形成。在链侵入后，DNA聚合酶基于同源DNA模板延长ssDNA以修复DNA断裂，并且形成了交换结构或霍利迪连结体。RecA还表现出参与交换结构的迁移的运动功能(Campbell和Davis,1999)。

重组酶活性包括许多不同的功能。例如，具有重组酶活性的多肽序列能够以非序列特异性的方式与单链DNA结合以形成核蛋白细丝。这种重组酶结合的核蛋白细丝能够以非序列特异性的方式与双链DNA分子相互作用，在双链分子中寻找与细丝中的序列同源的序列，并且当发现这种序列时，置换双链分子的一条链以允许细丝中的序列和双链分子的一条链中的互补序列之间的碱基配对。这些步骤统称为“联会”。

因此，重组酶活性包括但不限于单链DNA结合、联会、同源性搜索、单链DNA的双链体侵入、异源双链体形成、ATP水解和蛋白水解。原型重组酶是来自大肠杆菌的RecA蛋白。参见例如美国专利第4,888,274号。原核RecA样蛋白在沙门氏菌属、芽孢杆菌属和变形杆菌属物种中也有描述。来自水生栖热菌的热稳定RecA蛋白已描述于美国专利第5,510,473号中。已描述了RecA的噬菌体T4同源物，即UvsX蛋白。具有改变的重组酶活性的RecA突变体已描述于例如美国专利第6,774,213号；第7,176,007号和第7,294,494号中。植物RecA同源物描述于例如美国专利第5,674,992号；第6,388,169号和第6,809,183号中。含有重组酶活性的RecA片段已描述于例如美国专利第5,731,411号中。已描述了具有增强的重组酶活性的突变体RecA蛋白诸如，例如RecA803。参见例如Madiraju等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:6592-6596。

也具有重组酶活性的RecA的真核同源物是Rad51蛋白，其首先在酵母酿酒酵母中标识。参见Bishop等人,(1992)Cell 69:439-56；Shinohara等人,(1992)Cell:457-70；Aboussekhra等人,(1992)Mol.Cell.Biol.72,3224-3234和Basile等人,(1992)Mol.Cell.Biol.12,3235-3246。植物Rad51序列描述于美国专利第6,541,684号；第6,720,478号；第6,905,857号和第7,034,117号中。与RecA同源的另一酵母蛋白是Dmcl蛋白。已描述了除大肠杆菌和酿酒酵母之外的生物体中的RecA/Rad51同源物。Morita等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6577-6580；Shinohara等人(1993)Nature Genet.4:239-243；Heyer(1994)Experientia 50:223-233；Maeshima等人(1995)Gene160:195-200；美国专利第6,541,684号和第6,905,857号。

具有重组酶活性的蛋白质的其它描述可见于例如Fugisawa等人(1985)Nucl.Acids Res.13:7473；Hsieh等人(1986)Cell 44:885；Hsieh等人(1989)J.Biol.Chem.264:5089；Fishel等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3683；Cassuto等人(1987)Mol.Gen.Genet.208:10；Ganea等人(1987)Mol.Cell Biol.7:3124；Moore等人(1990)J.Biol.Chem.:11108；Keene等人(1984)Nucl.Acids Res.12:3057；Kimiec(1984)Cold Spring Harbor Symp.48:675；Kimeic(1986)Cell 44:545；Kolodner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5560；Sugino等人(1985)Proc.Natl.Acad,Sci.USA 85:3683；Halbrook等人(1989)J.Biol.Chem.264:21403；Eisen等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7481；McCarthy等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5854；和Lowenhaupt等人(1989)J.Biol.Chem.264:20568，其通过引用并入本文。另参见Brendel等人(1997)J.Mol.Evol.44:528。

具有重组酶活性的蛋白质的实例包括recA、recA803、uvsX以及其它recA突变体和recA样重组酶(Roca(1990)Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.25:415)、(Kolodner等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:5560；Tishkoff等人(1991)Molec.Cell.Biol.11:2593)、RuvC(Dunderdale等人(1991)Nature 354:506)、DST2、KEM1和XRN1(Dykstra等人(1991)Molec.Cell.Biol.11:2583)、STPa/DST1(Clark等人(1991)Molec.Cell.Biol.11:2576)、HPP-1(Moore等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:9067)、其它真核重组酶(Bishop等人(1992)Cell 69:439；和Shinohara等人(1992)Cell69:457)；通过引用并入本文。

具有重组酶活性的体外进化的蛋白质已描述于美国专利第6,686,515号中。与重组酶相关的其它出版物包括例如美国专利第7,732,585号、第7,361,641号、第7,144,734号中。关于重组酶的综述，参见Cox(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:8173-8180。

可以形成核蛋白细丝或“细丝”。在形成具有重组酶的结构的语境中，术语细丝是本领域技术人员已知的术语。然后，如此形成的核蛋白细丝可以例如与另一核酸接触或引入到细胞中。用于形成核蛋白细丝的方法是本领域熟知的，其中细丝包含具有重组酶活性的多肽序列和核酸。参见例如Cui等人(2003)Marine Biotechnol.5:174-184以及美国专利第4,888,274号；第5,763,240号；第5,948,653号和第7,199,281号，其公开内容出于公开用于将重组酶与核酸结合以形成核蛋白细丝的示例性技术通过引用并入。

通常，具有重组酶活性的分子与线性单链核酸接触。线性单链核酸可以是探针。制备这种单链核酸的方法是已知的。反应混合物通常含有镁离子。任选地，反应混合物被缓冲，并且任选地还含有ATP、dATP或不可水解的ATP类似物诸如，例如γ-硫代-ATP(ATP-γ-S)或γ-硫代-GTP(GTP-γ-S)。反应混合物也可以任选地含有ATP生成系统。双链DNA分子可以在细丝形成之前或期间变性(例如，通过热或碱)。重组酶与核酸的摩尔比的优化在本领域的技术范围内。例如，可以将一系列不同浓度的重组酶添加到恒定量的核酸中，并通过琼脂糖或丙烯酰胺凝胶中的迁移率来测定细丝形成。因为结合的蛋白质延缓了多核苷酸的电泳迁移率，所以通过核酸的迁移率延缓证明了细丝形成。最大延缓程度或以延缓的迁移率迁移的最大核酸量可以用于指示最佳重组酶:核酸比。蛋白质-DNA缔合也可以通过测量多核苷酸与硝酸纤维素结合的能力来定量。

在其它方面，本文提供了将编码一个或多个人白细胞抗原(HLA)的核酸分子递送到细胞的另外的方法。在一些实施方案中，方法包括经由转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)递送编码一个或多个HLA的核酸分子。在一些实施方案中，方法包括经由锌指核酸酶(ZFN)递送编码一个或多个HLA的核酸分子。在一些实施方案中，方法包括通过成簇的规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关核酸内切酶cas9(CRISPR/Cas9)递送编码一个或多个HLA的核酸分子。

在一些实施方案中，核酸分子包含内源性HLA基因座中的缺失。在一些实施方案中，缺失包括内源性HLA-A、HLA-B或HLA-C基因座或其任何组合中的缺失。在一些实施方案中，缺失是内源性HLA基因座的完全缺失。

在一些实施方案中，核酸分子进一步包含编码人HLA 1类重链序列的序列。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其任何组合的多个等位基因。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含HLA-A序列，其中HLA-A序列被置换到HLA-B序列和HLA-C序列之间。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于1700个碱基对(bp)。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于500bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于250bp。在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列包含少于150bp。

在一些实施方案中，HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合包含一个或多个侧翼序列。在一些实施方案中，一个或多个侧翼序列包含内源性HLA序列。在一些实施方案中，一个或多个侧翼序列对一个或多个启动子具有特异性。在一些实施方案中，启动子包含HLA-A启动子、HLA-B启动子、HLA-C启动子或其组合。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的序列不包含HLA-A序列、HLA-B序列、HLA-C序列或其组合的至少一部分。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的核酸分子包含HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合。在一些实施方案中，当复合物被一个或多个T细胞询问时，HLA-E序列或其片段、HLA-F序列或其片段、HLA-G序列或其片段或它们的任何组合中的至少一个被抑制引发T细胞应答。

在一些实施方案中，编码人HLA 1类重链序列的核酸分子包含一个或多个突变，其中当包含有包含一个或多个突变的突变的人HLA 1类重链序列的细胞被一个或多个CD8细胞询问时，细胞不引发免疫应答。在一些实施方案中，突变的人HLA 1类重链序列编码在氨基酸残基115、122、128、194、197、198、212、214、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、243、245、248、262中的一个或多个或其任何组合处包含一个或多个突变的HLA。

治疗方法

另一方面，本文提供了一种治疗有需要的对象中的疾病或病症的方法，其包括施用治疗有效量的本文提供的核酸分子或本文提供的无免疫能力细胞。

在一些实施方案中，疾病是自身免疫性疾病。在一些实施方案中，疾病是1型糖尿病。在一些实施方案中，疾病是类风湿性关节炎。在一些实施方案中，疾病是银屑病。在一些实施方案中，疾病是银屑病性关节炎。在一些实施方案中，疾病是多发性硬化症。在一些实施方案中，疾病是系统性红斑狼疮。在一些实施方案中，疾病是炎性肠病。在一些实施方案中，疾病是阿狄森氏病。在一些实施方案中，疾病是格雷夫斯病。在一些实施方案中，疾病是舍格伦综合征。在一些实施方案中，疾病是桥本甲状腺炎。在一些实施方案中，疾病是重症肌无力。在一些实施方案中，疾病是自身免疫性血管炎。在一些实施方案中，疾病是恶性贫血。在一些实施方案中，疾病是乳糜泻。在一些实施方案中，疾病是血管炎。

在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，疾病是肺癌。在一些实施方案中，疾病是乳腺癌。在一些实施方案中，疾病是结肠直肠癌。在一些实施方案中，疾病是前列腺癌。在一些实施方案中，疾病是皮肤癌。在一些实施方案中，疾病是胃癌。在一些实施方案中，疾病是白血病。在一些实施方案中，疾病是淋巴瘤。在一些实施方案中，疾病是膀胱癌。在一些实施方案中，疾病是肾癌。在一些实施方案中，疾病是子宫内膜癌。在一些实施方案中，疾病是胰腺癌。在一些实施方案中，疾病是甲状腺癌。在一些实施方案中，疾病是肝癌。在一些实施方案中，疾病是卵巢癌。在一些实施方案中，疾病是宫颈癌。

在一些实施方案中，疾病是退行性疾病。在一些实施方案中，疾病是阿尔茨海默病。在一些实施方案中，疾病是肌萎缩性侧索硬化。在一些实施方案中，疾病是弗里德里希共济失调。在一些实施方案中，疾病是亨廷顿病。在一些实施方案中，疾病是路易体病。在一些实施方案中，疾病是帕金森病。在一些实施方案中，疾病是脊髓性肌萎缩。在一些实施方案中，疾病是多发性硬化症。在一些实施方案中，疾病是肌营养不良。在一些实施方案中，疾病是囊性纤维化。在一些实施方案中，疾病是克罗伊茨费尔特-雅各布(Creutzfeldt-Jakob)病。在一些实施方案中，疾病是泰伊-萨克斯二氏(Tay-Sachs)病。

在一些实施方案中，施用本文提供的无免疫能力细胞治疗疾病或病症而不引发免疫应答。

当将如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞施用于人类对象中时，剂量通常由医生确定，剂量通常根据个体对象的年龄、体重和反应以及对象的症状的严重程度而有所不同。

所采用的实际剂量可以取决于对象的需要和所治疗病况的严重程度而有所不同。特定情况下的适当剂量的确定在本领域的技术范围内。通常，治疗以小于如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的最佳剂量的较小剂量开始。此后，剂量少量增加，直到达到这种情况下的最佳效果。

如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞，以及其它化疗剂和/或放射疗法(如果适用的话)的施用的量和频率将根据主治临床医师(医生)考虑如对象的年龄、状况和大小以及所治疗疾病的严重程度等因素的判断而进行调节。

化疗剂和/或放射疗法可以根据本领域熟知的治疗方案来施用。对本领域技术人员来说显而易见的是，化疗剂和/或放射疗法的施用可以取决于所治疗疾病以及化疗剂和/或放射疗法对疾病的已知效果而有所不同。此外，根据熟练的临床医师的知识，治疗方案(例如，剂量和施用次数)可以根据观察到的所施用治疗剂(即，抗肿瘤剂或放射)对对象的效果以及根据观察到的疾病对所施用治疗剂的反应而有所不同。

此外，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞通常不需要在与化疗剂相同的药物组合物中施用，并且由于不同的物理和化学特性，可以通过不同的途径施用。在可能的情况下，同一药物组合物中的施用方式和施用合理性的确定完全在熟练的临床医师的知识范围内。可以根据本领域已知的既定方案进行初始施用，然后基于观察到的效果，可以由熟练的临床医师修改剂量、施用方式和施用次数。

如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞(以及在适用的情况下，化疗剂和/或放射)的具体选择将取决于主治医生的诊断和他们对对象的状况的判断以及适当的治疗方案。

如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞(以及在适用的情况下，化疗剂和/或放射)可以并行(例如，同时、基本上同时或在同一治疗方案中)或顺序施用，这取决于增殖性疾病的性质、对象的状况以及待与如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞联合(即，在单一治疗方案中)施用的化疗剂和/或放射的实际选择。

在组合应用和使用中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞以及化疗剂和/或放射不需要同时或基本上同时施用，并且如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞以及化疗剂和/或放射的初始施用顺序可能并不重要。因此，可以首先施用如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞，然后再施用化疗剂和/或放射；或者可以首先施用化疗剂和/或放射，然后再施用如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞。这种交替施用可以在单一治疗方案期间重复进行。在治疗方案期间，每个治疗剂的施用顺序和施用重复次数的确定，在评估所治疗的疾病和对象的状况后，完全在熟练的医生的知识范围内。例如，可以首先施用化疗剂和/或放射，然后通过施用如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞继续治疗，在确定有利的情况下，接着施用化疗剂和/或放射等，直到治疗方案完成。

因此，根据经验和知识，执业医生可以随着治疗的进行根据个体对象的需要修改施用如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的每个方案以进行治疗。

使用方法

在另一方面，本文提供了一种抑制人白细胞抗原(HLA)的方法，其包括将HLA与不包含T细胞受体结合残基或片段的肽接触。

在一些实施方案中，肽与HLA的一个或多个HLA结合沟结构域残基结合。在一些实施方案中，肽调节HLA的构象。在一些实施方案中，构象阻止T细胞结合HLA。

在一些实施方案中，HLA是合成的。

治疗功效

主治临床医师在判断治疗在施用剂量下是否有效时，将考虑对象的总体健康状况以及更明确的体征，诸如疾病相关症状的缓解、肿瘤生长的抑制、肿瘤的实际缩小或转移的抑制。肿瘤的大小可以通过标准方法测量，诸如放射学研究，例如CAT或MRI扫描，并且连续的测量可以用于判断肿瘤的生长是否被延缓或甚至逆转。诸如疼痛等疾病相关症状的缓解和整体状况的改善也可以用于帮助判断治疗的有效性。

在一些实施方案中，基于治疗诸如癌症等增殖性病症的效果来测量治疗功效。通常，本发明的方法和组合物在治疗增殖性病症(例如，无论是良性还是恶性)方面的治疗功效可以通过所述方法和组合物促进肿瘤细胞增殖的抑制、肿瘤血管形成的抑制、肿瘤细胞的根除、肿瘤生长速率的降低和/或至少一个肿瘤的大小的减小的程度来测量。本文讨论了在确定治疗功效时应考虑的几个参数。临床医师可以确定特定情况下的参数的适当组合。本发明的方法在治疗癌症(例如，减小肿瘤大小或根除癌细胞)中的进展可以使用任何合适的方法来确定，诸如目前在临床中用于追踪肿瘤大小和癌症进展的那些方法。用于评价本发明方法和组合物对癌症的治疗的主要功效参数优选是肿瘤的大小的减小。可以使用任何合适的技术来计算肿瘤大小，诸如测量尺寸，或者使用可用的计算机软件来估计肿瘤体积，计算机软件是诸如在维克森林大学开发的FreeFlight软件，其能够精确估计肿瘤体积。肿瘤大小可以通过使用例如CT、超声、SPECT、螺旋CT、MRI、照片等的肿瘤可视化来确定。在治疗期结束后手术切除肿瘤的实施方案中，肿瘤组织的存在和肿瘤大小可以通过待切除组织的大体分析和/或切除组织的病理学分析来确定。

在一些期望的实施方案中，由于本发明的方法和组合物，肿瘤的生长被稳定(即，一个或多个肿瘤的大小增加不超过1％、5％、10％、15％或20％，并且/或者不转移)。在一些实施方案中，肿瘤被稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更长时间。在一些实施方案中，肿瘤被稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间。在一些实施方案中，肿瘤被稳定至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间。优选地，本发明的方法将肿瘤的大小减小至少约5％(例如，至少约10％、15％、20％或25％)。更优选地，肿瘤大小被减小至少约30％(例如，至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％)。甚至更优选地，肿瘤大小被减小至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％或95％)。最优选地，肿瘤被完全消除，或被减小到检测水平以下。在一些实施方案中，对象在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或更长时间内保持无肿瘤(例如，缓解中)。在一些实施方案中，对象在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月或更长时间内保持无肿瘤。在一些实施方案中，对象在治疗后至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年或更长时间内保持无肿瘤。

在一些实施方案中，本发明的方法在减小肿瘤大小方面的功效可以通过在治疗期结束后测量手术切除肿瘤的坏死(即，死亡)组织的百分比来确定。在一些进一步的实施方案中，如果切除组织的坏死百分比大于约20％(例如，至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)，更优选约90％或更大(例如，约90％、95％或100％)，则治疗是治疗有效的。最优选地，切除组织的坏死百分比是100％，也就是说，不存在或检测不到肿瘤组织。

本发明的方法的功效可以由许多次要参数来确定。次要参数的实例包括但不限于新肿瘤的检测、肿瘤抗原或标志物(例如，CEA、PSA或CA-125)的检测、活检、手术降期(即，肿瘤的手术期从不可切除转变为可切除)、PET扫描、存活率、无疾病进展存活率、疾病进展时间、生活质量评定(诸如，临床受益反应评定)等，所有这些都可以指出人类癌症的总体进展(或消退)。活检在检测组织内的癌细胞的根除方面特别有用。放射免疫检测(RAID)用于使用血清水平的由肿瘤产生的和/或与肿瘤相关的标志物(抗原)(“肿瘤标记物”或“肿瘤相关抗原”)对肿瘤进行定位和分期，并且可以用作复发的治疗前诊断预测、治疗后诊断指标以及治疗功效的治疗后指标。可以被评估为治疗功效指标的肿瘤标志物或肿瘤相关抗原的实例包括但不限于癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原(PSA)、CA-125、CA19-9、神经节苷脂分子(例如，GM2、GD2和GD3)、MART-1、热休克蛋白(例如，gp96)、唾液酸Tn(STn)、酪氨酸酶、MUC-1、HER-2/neu、c-erb-B2、KSA、PSMA、p53、RAS、EGF-R、VEGF、MAGE和gp100。其它肿瘤相关抗原是本领域已知的。与内窥镜检测系统组合的RAID技术也可以有效地将小肿瘤与周围组织区分开来(参见例如美国专利第4,932,412号)。

在另外的期望实施方案中，根据本发明的方法治疗人类患者中的癌症通过下列结果中的一个或多个证明：(a)肿瘤完全消失(即，完全反应)，(b)与治疗前的肿瘤的大小相比，在治疗期结束后的至少四周内，肿瘤的大小减小约25％至约50％，(c)与治疗期之前的肿瘤大小相比，在治疗期结束后的至少四周内，肿瘤的大小减小至少约50％，和(d)与治疗期之前的肿瘤相关抗原水平相比，在治疗期结束后约4-12周，特异性肿瘤相关抗原水平降低至少2％(例如，降低约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)。尽管肿瘤相关抗原水平降低至少2％是优选的，但肿瘤相关抗原水平的任何降低都是通过本发明的方法治疗患者中的癌症的证据。例如，关于不可切除的局部晚期胰腺癌，治疗可以通过以下证明：与治疗期之前的CA19-9水平相比，在治疗期结束后4-12周，CA19-9肿瘤相关抗原水平降低至少10％。类似地，关于局部晚期直肠癌，治疗可以通过以下证明：与治疗期之前的CEA水平相比，在治疗期结束后4-12周，CEA肿瘤相关抗原水平降低至少10％。

关于生活质量评定，诸如临床受益反应标准，根据本发明的治疗的治疗益处可以在疼痛强度、镇痛剂消耗和/或卡诺夫斯基健康状况量表评分方面得以证明。可替代地或另外地，人类患者中的癌症的治疗通过以下证明：(a)与治疗前患者报告的疼痛强度相比，诸如在治疗结束后12周内的任何连续四周期间，患者报告的疼痛强度降低至少50％(例如，降低至少60％、70％、80％、90％或100％)，(b)与治疗前患者报告的镇痛剂消耗相比，诸如在治疗结束后12周内的任何连续四周期间，患者报告的镇痛剂消耗降低至少50％(例如，降低至少60％、70％、80％、90％，或100％)，和/或(c)与治疗期之前患者报告的卡诺夫斯基健康状况量表评分相比，诸如在治疗期结束后12周内的任何连续四周期间，患者报告的卡诺夫斯基健康状况量表评分增加至少20分(例如，增加至少30分、50分、70分或90分)。

人类患者中的增殖性病症(例如，癌症，无论是良性还是恶性)的治疗理想地由前述结果中的一个或多个(以任何组合)证明，但所引用的测试和/或其它测试的替代或另外的结果也可以证明治疗功效。

在一些实施方案中，作为本发明的方法的结果，肿瘤大小减小，优选在对象中没有显著的不良事件。不良事件由国家癌症研究所(NCI)的癌症疗法评估计划(CTEP)进行分类或“分级”，其中0级代表最低的不良副作用，而4级代表最严重的不良事件。理想地，本发明的方法与最低的不良事件相关，例如0级、1级或2级不良事件，如由CTEP/NCI分级。然而，如本文所讨论，肿瘤大小的减小虽然是优选的，但不是必需的，因为尽管肿瘤细胞被根除，但肿瘤的实际大小可能不会缩小。癌细胞的根除足以实现治疗效果。同样地，肿瘤大小的任何减小都足以实现治疗效果。

人类中的各种癌症的检测、监测和评级进一步描述于2001年癌症事实和数据(Cancer Facts and Figures 2001),美国癌症协会,纽约,纽约州和国际专利申请WO 01/24684中。因此，临床医师可以使用标准测试来确定本发明的方法的各个实施方案在治疗癌症中的功效。然而，除了肿瘤的大小和扩散，临床医师在评估治疗功效时还可能考虑患者的生活质量和存活。

在一些实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的施用提供了改善的治疗功效。可以使用本领域已知的任何方法来测量改善的功效，包括但不限于本文所述的那些方法。在一些实施方案中，改善的治疗功效是使用合适量度(例如，肿瘤大小减小、肿瘤大小稳定的持续时间、无转移事件的持续时间、无疾病存活的持续时间)的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、100％、110％、120％、150％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、1000％或更多的改善。改善的功效也可以表达为倍数改善，诸如使用合适量度(例如，肿瘤大小减小、肿瘤大小稳定的持续时间、无转移事件的持续时间、无疾病存活的持续时间)的至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1000倍、10000倍或更多倍。

药物组合物和调配物

本公开提供了包括药物组合物在内的组合物，其包含如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞。

在一些实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞被调配成药物组合物。在具体的实施方案中，使用一种或多种生理学上可接受的载剂以常规方式调配药物组合物，载剂包括赋形剂和助剂，赋形剂和助剂有助于将如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞加工成可以药用的制剂。合适的调配物取决于所选择的施用途径。任何药学上可接受的技术、载剂和赋形剂都适当用于调配本文所述的药物组合物：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第十九版(Easton,Pa.:Mack Publishing Company,1995)；Hoover,John E.,Remington’sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pennsylvania1975；Liberman,H.A.和Lachman,L.编,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Decker,NewYork,N.Y.,1980；和Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第七版(Lippincott Williams和Wilkins 1999)。

本文提供了药物组合物，其包含如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞以及药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂。在某些实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞作为药物组合物施用，其中如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞与其它活性成分混合，如在组合疗法中。在具体的实施方案中，药物组合物包含如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞。

如本文所使用的药物组合物是指如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞与其它化学组分诸如载剂、稳定剂、稀释剂、分散剂、混悬剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。在某些实施方案中，药物组合物有助于将如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞施用于生物体。在一些实施方案中，在实践本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞以药物组合物的形式施用于患有待治疗疾病或病况的哺乳动物。在具体的实施方案中，哺乳动物是人。在某些实施方案中，治疗有效量取决于疾病的严重程度、对象的年龄和相对健康状况以及其它因素而有所不同。如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞单独使用，或作为混合物的组分与一种或多种治疗剂组合使用。

在一个实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞在水性溶液中调配。在具体的实施方案中，仅举例来说，水性溶液选自生理相容的缓冲液，诸如汉克氏液、林格氏液或生理盐水缓冲液。在其它实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞被调配用于经粘膜施用。在具体的实施方案中，透粘膜调配物包含适合待渗透的屏障的渗透剂。在如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞被调配用于其它肠胃外注射的其它实施方案中，合适的调配物包括水性或非水性溶液。在具体的实施方案中，这种溶液包括生理相容的缓冲液和/或赋形剂。

在其它实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞被调配用于肠胃外注射，包括适合于快速浓注或连续输注的调配物。在具体的实施方案中，注射用调配物以单位剂型(例如，安瓿)或多剂量容器的形式存在。任选地，在注射调配物中添加防腐剂。在其它实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的药物组合物被调配成适合于肠胃外注射的形式，如油性或水性媒剂中的无菌混悬液、溶液或乳液。肠胃外注射调配物任选地含有调配剂，诸如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。在具体的实施方案中，肠胃外施用的药物调配物包括水溶性形式的如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的水性溶液。在另外的实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的混悬液被制备成合适的油性注射混悬液。仅举例来说，用于本文所述的药物组合物的合适的亲脂性溶剂或媒剂包括诸如芝麻油等脂肪油、或诸如油酸乙酯或甘油三酯的合成脂肪酸酯、或脂质体。在某些具体的实施方案中，水性注射混悬液含有增加混悬液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬液含有合适的稳定剂或增加如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的溶解度以允许制备高度浓缩溶液的试剂。可替代地，在其它实施方案中，活性成分为粉末形式以在使用前用合适的媒剂(例如，无菌无热原水)复原。

在某些实施方案中，使用一种或多种生理学上可接受的载剂以任何常规方式调配药物组合物，载剂包括赋形剂和助剂，赋形剂和助剂有助于将如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞加工成可以药用的制剂。合适的调配物取决于所选择的施用途径。任何药学上可接受的技术、载剂和赋形剂都任选地适当使用。包含如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的药物组合物是以常规方式制造的，诸如仅举例来说，借助常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸、磨细、乳化、包封、包埋或压缩工艺。

在一些实施方案中，包含如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的药物组合物示例性地采取液体形式，其中试剂存在于溶液、混悬液或两者中。通常，当组合物作为溶液或混悬液施用时，试剂的第一部分存在于溶液中，而试剂的第二部分以微粒形式存在于液体基质中的混悬液中。在一些实施方案中，液体组合物包括凝胶调配物。在其它实施方案中，液体组合物是水性的。

在某些实施方案中，有用的水性混悬液含有一种或多种聚合物作为混悬剂。有用的聚合物包括水溶性聚合物，诸如纤维素聚合物，例如羟丙基甲基纤维素；和水不溶性聚合物，诸如交联的含羧基聚合物。本文所述的某些药物组合物包含粘膜粘附聚合物，其例如选自羧甲基纤维素、卡波姆(丙烯酸聚合物)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚丙烯酰胺、聚卡波非、丙烯酸/丙烯酸丁酯共聚物、海藻酸钠和葡聚糖。

有用的药物组合物还任选地包含增溶剂，以有助于如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞的溶解性。术语“增溶剂”通常包括导致形成试剂的胶束溶液或真实溶液的试剂。某些可接受的非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯80，可用作增溶剂；眼科可接受的二醇、聚二醇，例如聚乙二醇400和乙二醇醚也是如此。

此外，有用的药物组合物任选地包含一种或多种pH调节剂或缓冲剂，包括酸，诸如乙酸、硼酸、柠檬酸、乳酸、磷酸和盐酸；碱，诸如氢氧化钠、磷酸钠、硼酸钠、柠檬酸钠、乙酸钠、乳酸钠和三羟甲基氨基甲烷；以及缓冲液，诸如柠檬酸盐/葡萄糖、碳酸氢钠和氯化铵。这种酸、碱和缓冲液的含量需将组合物的pH保持在可接受的范围内。

此外，有用的组合物还任选地包含一种或多种盐，其量需使组合物的重量渗透摩尔浓度在可接受的范围内。这些盐包括具有钠、钾或铵阳离子和氯离子、柠檬酸根、抗坏血酸根、硼酸根、磷酸根、碳酸氢根、硫酸根、硫代硫酸根或亚硫酸氢根阴离子的盐；合适的盐包括氯化钠、氯化钾、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠和硫酸铵。

其它有用的药物组合物任选地包含一种或多种防腐剂以抑制微生物活性。合适的防腐剂包括含汞物质，诸如硼酸苯汞和硫柳汞；稳定的二氧化氯；和季铵化合物，诸如苯扎氯铵、溴化十六烷基三甲铵和氯化十六烷基吡啶。

其它有用的组合物包含一种或多种表面活性剂以增强物理稳定性或用于其它目的。合适的非离子表面活性剂包括聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和植物油，例如聚氧乙烯(60)氢化蓖麻油；和聚氧乙烯烷基醚和烷基苯基醚，例如辛基酚聚醚10、辛基酚聚醚40。

其它有用的组合物包含一种或多种抗氧化剂以在需要的情况下增强化学稳定性。仅举例来说，合适的抗氧化剂包括抗坏血酸和焦亚硫酸钠。

在某些实施方案中，水性混悬液组合物被包装在单剂量不可再封闭的容器中。可替代地，使用多剂量可再封闭的容器，在这种情况下，通常在组合物中包含防腐剂。

在替代实施方案中，采用了其它递送系统。脂质体和乳液是本文可用的递送媒剂或载剂的实例。在另外的实施方案中，如本文提供的一种或多种复合物、核酸分子或无免疫能力细胞使用持续释放系统递送，诸如含有治疗剂的固体疏水聚合物的半透性基质。本文可用各种持续释放材料。根据于治疗试剂的化学性质和生物稳定性，采用了另外的蛋白质稳定策略。

在某些实施方案中，本文所述的调配物包含一种或多种抗氧化剂、金属螯合剂、含巯基化合物和/或其它通用稳定剂。这种稳定剂的实例包括但不限于：(a)约0.5％至约2％w/v甘油，(b)约0.1％至约1％w/v蛋氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v单硫代甘油，(d)约1mM至约10mM EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v聚山梨醇酯80，(g)0.001％至0.05％w/v聚山梨醇酯20，(h)精氨酸，(i)肝素，(j)葡聚糖硫酸酯，(k)环糊精，(l)戊聚糖多硫酸酯及其它类肝素，(m)二价阳离子，诸如镁和锌；或(n)其组合。

施用途径

合适的施用途径包括但不限于口服、静脉内、直肠、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部、经粘膜、透皮、阴道、耳部、鼻部和局部施用。此外，仅举例来说，肠胃外递送包括肌内、皮下、静脉内、髓内注射以及鞘内、直接心室内、腹膜内、淋巴内和鼻内注射。

在某些实施方案中，包含如本文提供的无免疫能力细胞的组合物以局部而非全身方式施用，例如经由将组合物直接注射到器官中，通常以储库制剂或持续释放调配物的形式。在具体实施方案中，长效调配物通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。此外，在其它实施方案中，组合物在靶向药物递送系统中，例如在用器官特异性抗体包被的脂质体中递送。在这种实施方案中，脂质体被靶向器官并由器官选择性摄取。在其它实施方案中，包含如本文提供的无免疫能力细胞的组合物以快速释放调配物的形式、延长释放调配物的形式或中间释放调配物的形式提供。

试剂盒和制品

为了用于本文所述的治疗应用，还提供了试剂盒和制品。在一些实施方案中，这种试剂盒包括载具、包装或容器，其被分隔以容纳一个或多个容器，诸如小瓶、管等，容器中的每一个包含在本文所述的方法中使用的单独元件中的一个。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器由诸如玻璃或塑料等各种材料形成。

本文提供的制品含有包装材料。用于包装药物产品的包装材料包括可见于例如美国专利第5,323,907号、第5,052,558号和第5,033,252号中的那些。药物包装材料的实例包括但不限于泡罩包装、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶和适合于所选调配物和预期施用和治疗方式的任何包装材料。例如，容器包含本文所述的一种或多种核酸分子或无免疫能力细胞，其任选地为组合物的形式。容器任选地具有无菌接入口(例如，容器是静脉注射液袋或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的小瓶)。这种试剂盒任选地包含组合物以及标识说明或标签或与其在本文所述的方法中的用途相关的说明书。

例如，试剂盒通常包含一个或多个另外的容器，每个容器装有从商业和使用者的角度来看使用本文所述的组合物所需的各种材料(诸如，试剂，其任选地为浓缩形式；和/或装置)中的一种或多种。这种材料的非限制性实例包括但不限于缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器；列出内容物和/或使用说明的载具、包装、容器、小瓶和/或管标签，以及附有使用说明的包装插页。通常还将包括一套说明。标签任选地位于容器上或与容器相关联。例如，当形成标签的字母、数字或其它字符附着、模制或蚀刻到容器本身中时，标签位于容器上；当标签存在于同时起容器保持作用的容具或载具中时，标签与容器相关联，例如作为包装插页。此外，标签用于指示内容物应使用于某一具体的治疗应用。此外，标签指示内容物的使用指南，诸如在本文所述的方法中的使用指南。在某些实施方案中，药物组合物存在于含有一种或多种单位剂型的包装或分配器装置中，单位剂型包含本文提供的一种或多种复合物、核酸分子、无免疫能力细胞或其药物组合物。包装例如含有金属或塑料箔，诸如泡罩包装。或者，包装或分配器装置附有施用说明。或者，包装或分配器附有与容器相关联的呈管理药物制造、使用或销售的政府机构规定的形式的药品说明，药品说明反映了机构对用于人类或兽医施用的药物形式的批准。例如，这种说明是美国食品药品监督管理局批准的处方药标签或批准的产品插页。在一些实施方案中，制备了在相容药物载剂中调配的包含无免疫能力细胞的组合物，将其置于合适的容器中，并进行标记以用于治疗所指示的病况。

实施例

实施例1：肽的锚定氨基酸的标识

大多数HLA 1类等位基因优先结合9聚体至12聚体肽，并且大多数等位基因容纳在第二和最后位置具有锚定残基的肽，因为这些残基被埋在肽结合沟中。

对9聚体肽进行分析，以确定HLA-A、HLA-B和HLA-C的所有等位基因的肽结合偏好性。确定第二(例如，P2)和最后(例如，9聚体的P9)位置的锚定残基的氨基酸多样性。更长的肽也结合在这些锚定位置处，其中额外的长度通过在肽结合沟中间凸出或在肽结合沟外悬垂来容纳。

所研究的HLA-A等位基因包含HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:02、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:05、HLA-A*02:06、HLA-A*02:07、HLA-A*02:11、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01、HLA-A*11:02、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*24:07、HLA-A*25:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*34:01、HLA-A*34:02、HLA-A*36:01、HLA-A*66:01、HLA-A*68:01、HLA-A*68:02和HLA-A*74:01。

每个所研究的HLA-A等位基因的保守锚定残基总结于表1中：

表1：每个HLA-A等位基因的保守锚定残基

所研究的HLA-A等位基因中的第二氨基酸锚定残基的频率总结于表2中：

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表2：HLA-A的第二氨基酸锚定残基的频率

所研究的HLA-A等位基因中的最末氨基酸锚定残基的频率总结于表3中：

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表3：HLA-A的最末氨基酸锚定残基的频率

所研究的HLA-B等位基因包含HLA-B*07:02、HLA-B*07:04、HLA-B*08:01、HLA-B*13:01、HLA-B*13:02、HLA-B*14:02、HLA-B*15:01、HLA-B*15:02、HLA-B*15:03、HLA-B*15:10、HLA-B*15:17、HLA-B*18:01、HLA-B*27:05、HLA-B*35:01、HLA-B*35:03、HLA-B*35:07、HLA-B*37:01、HLA-B*38:01、HLA-B*38:02、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*40:06、HLA-B*42:01、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HLA-B*45:01、HLA-B*46:01、HLA-B*49:01、HLA-B*50:01、HLA-B*51:01、HLA-B*52:01、HLA-B*53:01、HLA-B*54:01、HLA-B*55:01、HLA-B*55:02、HLA-B*56:01、HLA-B*57:01、HLA-B*57:03、HLA-B*58:01和HLA-B*58:02。

每个所研究的HLA-B等位基因的保守锚定残基总结于表4中：

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表4：每个HLA-B等位基因的保守锚定残基

所研究的HLA-B等位基因中的第二氨基酸锚定残基的频率总结于表5中：

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表5：HLA-B的第二氨基酸锚定残基的频率

所研究的HLA-B等位基因中的最末氨基酸锚定残基的频率总结于表6中：

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表6：HLA-B的最末氨基酸锚定残基的频率

所研究的HLA-C等位基因包含HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*03:02、HLA-C*03:03、HLA-C*03:04、HLA-C*04:01、HLA-C*04:03、HLA-C*05:01、HLA-C*06:02、HLA-C*07:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:04、HLA-C*08:01、HLA-C*08:02、HLA-C*12:02、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02、HLA-C*14:03、HLA-C*15:02、HLA-C*16:01和HLA-C*17:01。

每个所研究的HLA-C等位基因的保守锚定残基总结于表7中：

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表7：每个HLA-C等位基因的保守锚定残基

所研究的HLA-C等位基因中的第二氨基酸锚定残基的频率总结于表8中：

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表8：HLA-C的第二氨基酸锚定残基的频率

所研究的HLA-C等位基因中的最末氨基酸锚定残基的频率总结于表9中：

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表9：HLA-C的最末氨基酸锚定残基的频率

实施例2：核酸分子的制备

根据本领域已知的方法制备包含合成HLA序列的核酸分子。例如，使用核苷亚磷酰胺通过固相寡核苷酸合成制备核酸分子。可替代地，使用核苷亚磷酰胺通过固相寡核苷酸合成制备核酸分子的部分，并根据本领域已知的方法将所述部分装配成完整的核酸分子。例如，使用核酸内切酶介导的装配、位点特异性重组或基于长重叠的装配来装配所述部分。

实施例3：复合物的制备

根据制备重组质粒的已知程序制备包含有包含合成HLA序列的核酸分子的重组质粒。例如，用限制性酶切割质粒，并经由使用DNA连接酶将包含合成HLA序列的核酸分子引入到质粒中。

重组质粒随后被转化到细胞群中。根据本领域已知的方法，诸如使用选择抗生素来选择成功转化的细胞。培养所选择的细胞并诱导其产生复合物。随后裂解细胞，并根据本领域已知的蛋白质纯化技术纯化复合物，蛋白质纯化技术是诸如尺寸排阻色谱法、疏水相互作用色谱法、离子交换色谱法、自由流动电泳、免疫亲和色谱法、免疫沉淀或高效液相色谱法。

可替代地，根据本领域已知的方法通过固相肽合成制备复合物。

实施例4：无免疫能力细胞的制备

根据本领域已知的方法，通过将实施例2的核酸分子引入到细胞的基因组中来制备无免疫能力细胞，诸如无免疫能力干细胞。例如，经由病毒载体将核酸分子递送到细胞。可替代地，经由非病毒方法将核酸分子递送到细胞，诸如使用裸DNA注射、电穿孔、基因枪、声致穿孔、磁转染、阳离子脂质体、树枝状聚合物、无机纳米颗粒、CRISPR、mRNA或siRNA。

可替代地，通过将细胞与实施例3的复合物一起孵育来制备无免疫能力细胞，诸如无免疫能力干细胞。

实施例5：免疫细胞增殖测定

培养免疫细胞，例如T细胞，并将其与实施例4的无免疫能力细胞和放射性标记的核苷酸，诸如

实施例6：疾病或病症的治疗

将实施例4的无免疫能力细胞施用于患有疾病或病症的患者。根据疾病或病症的治疗护理标准来监测患者的状况。

实施例7：将synHLA构建体转基因克隆到B2Mnull EBV和K562细胞中

β2M

使用CRISPR/Cas9来突变2个EBV系(9031和JK)中的β2M。用Cas9复合物转染EBV细胞，并分选HLA I类低/阴性EBV细胞。使细胞生长，并且确认不存在表面HLA I类。

NK细胞系的生成和测试K562和/或β2M

在存在IL-2、IL-15和IL-21的情况下分选NK细胞(CD3

在K562和/或EBV转化的B细胞系中表达synHLA蛋白

将编码如本文所述的synHLA构建体的synHLA基因克隆到慢病毒载体(pRRLSIN)或EBV附加型载体(pCE)中。构建编码已针对哺乳动物细胞中的表达进行密码子优化的synHLA的基因块。此基因可以用例如注入克隆法克隆到pRRLSIN或pCE中。可以对构建体进行测序以确认序列是正确的，并制备质粒。可以使用pRRLSIN来制造用于转导K562细胞的慢病毒。将pCE在EBV细胞中电穿孔，并通过抗生素选择来选择的转染细胞。针对synHLA构建体对转导的K562进行染色，并通过FACS分选进行选择。在存在抗体的情况下选择转染的EBV细胞(WT和β2M/HLA I类

确定表达synHLA的EBV细胞或K562细胞是否可以激活抗原特异性CD8

使用EBV转化的B细胞系：在有或没有HLA I类的情况下；以及有或没有synHLA的情况下，或使用用合适的HLA I类构建体转导的K562，测试以下：用同源肽脉冲，上述流感MP

实施例8：HLA复合物的重组细菌表达

在细菌中重组表达HLA复合物，包括如本文所述的合成HLA复合物(synHLA)(例如，表10中列出的那些)。简言之，用编码如本文所述的synHLA构建体序列的核酸转染细菌细胞。可以从细菌中分离和纯化蛋白质。如果蛋白质作为包涵体存在，则蛋白质可以被重折叠(例如，通过用离液剂变性并转移到稀释的水性环境中)。在重折叠步骤之后，可以纯化重折叠的蛋白质(例如，通过固定化金属亲和色谱法)。可以在存在或不存在还原剂(例如，二硫苏糖醇；DTT)的情况下将分离的蛋白质(例如，1μg)进行SDS-PAGE并可视化(例如，使用考马斯蓝染色)。

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表10.HLA复合物序列

实施例9：合成HLA构建体在细菌中的表达

如本文所述的合成HLA蛋白(SYNC4-1，SEQ ID NO:18；SYNA1-1，SEQ ID NO:14；SYNC5-1，SEQ ID NO:19；SYNC6-1，SEQ ID NO:20；SCTC1-1，SEQ ID NO:4)如实施例8所述进行表达、分离、重折叠、纯化和分析。简言之，将编码合成HLA蛋白的DNA插入到表达载体中，然后在抗生素选择下引入到细菌中。蛋白质构建体格式如图1所述，但是没有N末端信号肽和用于纯化的另外的C末端hexa-His标签。使具有适当序列的细胞生长至对数中期，并用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。通过离心收获细胞，使用高压匀浆器裂解，并离心以分离可溶性和不溶性级分。洗涤含有合成HLA蛋白的不溶性包涵体，并重悬于变性缓冲液中。通过在重折叠缓冲液中稀释随后再在4℃下孵育至多72小时，从包涵体制剂中重折叠合成HLA蛋白。通过IMAC、尺寸排阻和/或离子交换的组合来纯化所得蛋白质。

每个构建体的SDS-PAGE分析结果示出在图10和11中。通过SDS-PAGE进行的分离及随后的考马斯蓝染色示出，SYNA1-1在非还原条件下作为单一条带迁移，表明二硫键形成的同质性(图10)。SYNA1-1含有HLA-A02支架。含有HLA-C07支架的合成HLA蛋白SCTC1-1、SYNC4-1、SYNC5-1和SYNC6-1在非还原条件下作为多个物种迁移(图10和11)。这表明存在多种二硫键键合的蛋白质。这可能是HLA-C07结构域中存在额外的不成对半胱氨酸的结果。

实施例10：调节二硫键形成的可能性

如实施例9中所述，HLA-C07结构域中存在的半胱氨酸被突变为另一氨基酸，从而潜在地降低或消除了形成错配二硫化物的可能性，并因此改善了蛋白质表达。可以引入其它突变来改善表达和/或重折叠，如本文描述的技术所测量。

实施例11：热稳定性测定

通过在Bio-Rad CFX96

SYNC4-1的解链曲线示出了明显的两步式解折叠事件(图12A)，对应于42.6℃和57.2℃的T

与KIR2DL2解链曲线和一阶导数(图13)相比，两个最大值进一步密集为一个最大值，左侧有一个轻微的肩峰，分别对应于58.8℃和57.6℃的T

与SYNC1-1相反，具有流感肽GILGFVFTL和可能干扰KIR结合的相对长的连接子序列的SYNA1-1在与KIR2DL2组合时(图14)没有导致向右移动，指示KIR2DL2没有增加SYNA1-1的热稳定性(SYNA1-1 T

实施例12：可溶性合成HLA蛋白与免疫受体的相互作用

为了研究可溶性合成HLA蛋白逃避免疫系统的能力，检查了它们与免疫受体的相互作用。测试重组免疫受体，诸如自然杀伤细胞上的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)以及T细胞上的T细胞受体和CD8辅受体。使用标准的蛋白质-蛋白质相互作用技术，诸如表面等离子体共振、酶联免疫吸附测定(ELISA)、热解链测定和圆二色谱法来研究这种相互作用。当与对照相比时，具有特异性突变的可溶性合成HLA蛋白表现出与重组免疫受体的结合受损。

为了检查可溶性合成HLA蛋白与细胞表面处的免疫受体的相互作用，使用了竞争性细胞测定。在这些测定中，可溶性合成HLA蛋白与表达野生型I类HLA分子的哺乳动物细胞一起孵育。然后，测量野生型细胞在存在免疫细胞(例如，T细胞和/或NK细胞)的情况下的存活能力。当与对照相比时，具有特异性突变的可溶性HLA蛋白与免疫细胞上的受体的反应性更低，从而导致野生型哺乳动物细胞的杀伤增加。

实施例13：由单独的转录单位生产可溶性合成HLA蛋白

将编码合成HLA蛋白的DNA插入到载体中，然后在抗生素选择下引入到细菌中。构建体格式如图15所述。简言之，肽和β-2微球蛋白结构域被表达为由连接子连接的单一蛋白质，而HLA重链结构域作为单独的蛋白质产生。这可能在相同或不同的细胞内。使具有适当构建体的细胞生长至对数中期，并用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。通过离心收获细胞，使用细胞破碎机裂解，并离心以分离可溶性和不溶性级分。洗涤含有合成HLA蛋白的适当结构域的不溶性包涵体，并重悬于变性缓冲液中。在重折叠步骤期间，将肽和β-2微球蛋白与HLA重链结构域组合。通过IMAC、尺寸排阻和/或离子交换的组合来纯化所得的重折叠蛋白质。可替代地，使用类似的纯化技术从可溶性级分直接纯化重折叠的蛋白质。

尽管本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，这些实施方案仅仅作为实例提供。这并不意味着本发明受说明书中提供的具体实施例的限制。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文的实施方案的描述和说明并不旨在以限制的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文阐述的特定描绘、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。应理解，在实践本发明时，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。因此，经考虑，本发明还应涵盖任何此类替代、修改、变化或等同物。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等同物范围内的方法和结构。