一种自然共生的混合培养物及其降解秸秆生产香豆酸酯酶的方法

技术领域

本发明涉及生物技术可再生能源领域，具体为一种自然共生的由厌氧真菌和甲烷菌组成的自然混合培养物及其降解秸秆生产香豆酸酯酶的方法。

背景技术

农作物秸秆是农业废弃物面源污染的主要来源，且我国的农作物秸秆年产量高，常规的处理方法如露天焚烧、掩埋等，污染环境的同时还会造成大量的能源浪费。然而我国的大量秸秆资源处于高消耗、高污染、低利用率状况。木质纤维素是秸秆的主要成分，木质纤维素主要由纤维素、半纤维和木质素组成。木质素和半纤维素结合的共价键将纤维素分子包埋其中，木质素中醚键和碳-碳键形成的具有三维结构高分子芳香类化合物，强的共价键抑制水解酶的作用，导致木质纤维素的降解很困难。常见的预处理木质纤维素的方法有机械法、热处理法、化学处理，均能有效的促进木质纤维素的分解，但这些处理方法成本高，不环保。普通的微生物处理也存在较多缺陷，单一微生物处理效果不好，人工构建的复合菌群效果也不理想，各菌种间存在相互拮抗的表现，导致降解木质纤维素的时间长，效率低。

厌氧真菌在木质纤维素的降解中起重要作用。厌氧真菌通过丰富的菌根体系侵袭一些难以被降解的纤维组织，甚至是植物厚壁组织和维管束组织使植物纤维组织变得疏松从而易于被其它瘤胃微生物降解。厌氧真菌中的大多数种属都能够通过其假根分泌高活性酶，包括纤维素酶、半纤维素酶(主要是木聚糖酶)和酯酶(包括阿魏酸酯酶、乙酰酯酶和香豆酸酯酶)等多种酶，它们协同作用分解利用结构复杂的，晶体状的纤维素、半纤维素和果胶等物质。木质纤维素中的木质素和多糖通过酚酸交联在一起。以酚酸为主的木质素成分是植物细胞壁降解的限制性因素，酚酸中的阿魏酸和香豆酸被认为是细胞壁降解的限制因子。阿魏酸通过酯键与多糖相连，通过醚键与木质素相连，香豆酸即通过酯键也通过醚键与木质素相连，厌氧真菌产生的阿魏酸酯酶和香豆酸酯酶能够打开木质素、阿魏酸、香豆酸和细胞壁多糖交联的酯键结构，减少酯键交联，从而增加木质纤维素的降解。现有研究表明，一些甲烷菌可以利用厌氧真菌的代谢产物，如氢气、甲烷、甲酸等，与厌氧真菌形成稳定的混合培养物，即：厌氧真菌和甲烷菌混合培养物，这个过程促进了厌氧真菌和甲烷菌的生长，同时显著提高了厌氧真菌降解木质纤维素所产生的各种木质纤维素降解酶活性和对木质纤维素的降解能力。

牦牛适应高寒生态条件，耐粗饲、耐严寒、耐低氧的恶劣自然环境。牦牛瘤胃内栖息着独特的，复杂多样，大量的微生物群落协同高效降解野牧草为牦牛提供生存能量和营养物质。漫长的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效降解木质纤维素的天然厌氧发酵罐。放牧牦牛瘤胃内存在着自然的厌氧真菌和甲烷菌混合培养物，它们能够分泌高活性的多糖水解酶和酯酶降解大量野生牧草和冷季干枯牧草为牦牛提供生长的营养，因此从牦牛瘤胃分离厌氧真菌和甲烷菌混合培养物并将其应用于降解廉价木质纤维素底物生产高活性酯酶在工业应用方面具有重要意义。发明人在攻读博士期间首次研究了放牧牦牛瘤胃厌氧真菌和甲烷菌混合培养物分别以小麦秸秆、玉米秸秆和水稻秸秆为底物进行厌氧发酵(魏亚琴.牦牛瘤胃厌氧真菌与甲烷菌混合培养物的多样性及其纤维降解特性研究[D].2016.)，通过检测产气量、多糖水解酶活性、各种酯酶活性、干物质降解率、酚酸释放量、甲烷和乙酸产量来评估厌氧真菌和甲烷菌共培养物降解秸秆功效，其中高效降解以上三大秸秆的厌氧真菌和甲烷菌共培养物N.frontalis Yak16+M.ruminantium，Piromyces Yak18+M.ruminantium和O.joyonii Yak7+M.ruminantium分别降解三大秸秆所产生的香豆酸酯酶活性都低于5.0mU，不能达到产生高酶活香豆酸酯酶的效果。

针对现有技术存在的问题，发明人继续致力于高活性的共培养筛选及发酵秸秆产生高酶活的酶、产气量等，发明人意外的从青藏高原青海省海南州的放牧牦牛瘤胃中分离出自然共生的由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)组成的混合培养物YakQH5，所述的混合培养物分别以小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆和高粱秸秆为底物厌氧发酵生产高酶活的香豆酸酯酶，取得了意想不到的效果。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的第一目的是提供一种自然共生的由厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)组成的自然混合培养物，所述的混合培养物命名为YakQH5，所述的混合培养物于2020年3月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19299，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，电话：010-64807355。

优选地，所述的厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)的ITS序列如SEQ ID No.1所示，所述的甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的16S rDNA序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的第二目的是提供一种发酵秸秆生产香豆酸酯酶的方法，所述的方法中使用所述的混合培养物YakQH5为发酵菌剂。

优选地，所述的生产香豆酸酯酶的方法，包括如下步骤：

(1)混合培养物YakQH5菌剂的制备：以10％v/v接种量向以小麦秸秆为底物的厌氧培养基中接入混合培养物YakQH5，加入复合抗生素厌氧培养72小时即得到高活力的菌剂；

(2)生产香豆酸酯酶：吸取步骤(1)所得菌剂以10％v/v接种量分别接入以1％w/v秸秆为底物的厌氧培养基中，加入1％v/v复合抗生素厌氧培养。

优选地，所述的步骤(1)中厌氧培养的温度为39℃，时间为72小时；所述的步骤(2)中厌氧培养的温度为39℃，时间为120小时。

优选地，所述的复合抗生素为青霉素钠和硫酸链霉素，在厌氧培养基上的浓度分别为1600IU/mL和2000IU/mL。

优选地，厌氧培养基配方为：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO

优选地，所述的盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH

优选地，所述的步骤(2)加入秸秆底物后除氧，充入二氧化碳，高温高压灭菌。

优选地，所述的步骤(2)加入的秸秆为小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆和高粱秸秆的任一种或几种。

优选地，所述的步骤(2)加入的秸秆为高粱秸秆。

本发明的有益效果是：①本发明中采用的厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的混合培养物YakQH5是从牦牛瘤胃液中分离获得的，牦牛瘤胃中的微生物协同降解低质野草为牦牛提供生存必需的营养物质，使牦牛适应青藏高原的严酷环境而生存。长期的自然选择和进化使牦牛瘤胃成为一个高效木质纤维素降解酶系统，与人工混合的厌氧真菌和甲烷菌混合培养物相比，牦牛瘤胃自然存在的厌氧真菌和甲烷菌混合培养物具有高效降解木质纤维素的显著优势。②采用厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的混合培养物YakQH5厌氧发酵降解5种秸秆(小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆和高粱秸秆)，其中降解高粱秸秆(即以高粱秸秆为底物)产生的香豆酸酯酶的活性可达到20.5mU。③在发酵过程中添加复合抗生素，可防止混合培养物体系不受细菌污染，提高厌氧发酵效率。④本发明中采用的混合培养物可以通过保藏在体外存活传代，便于推广，为生产提供了极大的方便。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的培养基如下：

分离纯化培养基：在液体基本厌氧培养基中添加1.0g/L葡萄糖，不加秸秆。

琼脂滚管培养基：在液体基本培养基中添加1.0g/L葡糖糖和20g/L琼脂粉。

秸秆培养基：在液体基本培养基中添加1％(w/v)的粉碎风干的小麦秸秆。

厌氧培养基的配方：酵母膏1.0g，蛋白胨1.0g，NaHCO

盐溶液I配制步骤如下：NaCl 6g，(NH

盐溶液II配制步骤如下：4g K

传代培养基：在液体基本培养基中添加1％w/v的粉碎风干的小麦秸秆。然后除氧后灭菌。

除氧方法：厌氧管或厌氧瓶通过针头接入带有真空泵和高纯CO

复合抗生素：医用青霉素钠0.48g(80万单位)与医用硫酸链霉素1g(100万单位)溶解于5mL液体培养基中，使得青霉素和硫酸链霉素的终浓度分别达到1600IU/mL和2000IU/mL。

厌氧发酵罐又称厌氧发酵瓶，是在一个密闭罐体内完成料液的发酵、沼气产生的过程，主要用来满足微生物的生活条件，使它们在合适的环境中生活，以达到发酵旺盛，产气量高的目的。

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography\HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。

3-(N-吗啉基)丙磺酸简称MOPS，分子式为C

Leagene MOPS电泳缓冲液(1X，RNase free)主要由MOPS、乙酸钠、EDTA组成，经RNase free处理，主要用于RNA电泳。

伍丰分析仪器：购自伍丰科学仪器有限公司，中国。

实施例一、菌株筛选与鉴定

1.牦牛瘤胃液的采集

研究地点位于青海省海南州藏族自治区兴海县放牧牧场，年均温-1-1.3℃，最高气温26℃，最低气温-30℃，海拔3100-4300m，属寒冷高原气候类型，温度变化剧烈，日照强，雨量充沛，高寒草甸是主要草地类型。野生牧草主要包括羊茅、嵩草、藏嵩草、细叶嵩草等是该地区的主要优势物种。

以采食天然牧草，无补饲的全放牧牦牛中的20头健康公牦牛(年龄4-5岁，体重250±50kg)为实验动物。用不锈钢胃管一头通过开口器插入瘤胃，另一头接抽空气设备抽吸出胃管内空气形成负压后瘤胃食糜液从不锈钢胃管中流出，迅速用无菌注射器分别吸取1mL瘤胃食糜液接种到9mL厌氧真菌液体培养基中，并置39℃恒温培养。

2.厌氧真菌和甲烷菌混合培养物的分离

本实施例采用亨盖特滚管技术选育厌氧真菌和甲烷菌混合培养物菌株。

用无菌注射器吸取1mL牦牛瘤胃食糜样品，接种到39℃预热的9mL液体基本培养基中，即制成10

甲烷的测定法：使用气相色谱仪(GC522，伍丰仪器，中国)，配置有GPS101柱(2m×3mm)，热导检测器，汽化室250℃，柱温100℃，检测器温度150℃，载气为氮气。

混合培养物的传代：用无菌注射器吸取1mL混合培养物到厌氧管中的9mL小麦秸秆培养基，4天传代1次。

3.厌氧真菌的形态学鉴定

用普通光学显微镜观察固体琼脂管培养基中培养2-3天的菌株菌体形态、假根、菌丝、孢子囊和孢子梗，用相差显微镜(BX41-PHD-P11，上海，中国)观察菌株在无秸秆，添加葡萄糖为底物的液体培养基中培养2-3天的菌体形态、孢子囊、孢子梗、假根、菌丝体和游动孢子鞭毛及运动状态，根据菌株的形态学特征对其做出种属鉴定。

4.厌氧真菌的分子生物学鉴定

4.1厌氧真菌总DNA的提取

采用液氮研磨菌体后使用天根植物基因组试剂盒(天根生化科技，北京)提取总DNA。

(1)10mL混合培养物菌液接种到90mL，无秸秆，添加0.1％(w/v)葡萄糖的液体培养基中培养4-5天后将菌液移到离心管后12000×g离心5min，弃上清，收集菌体沉淀转入研钵，加入液氮将菌体快速充分研磨成粉末。

(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％(w/v)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品。

(3)加入700μL氯仿，充分混匀，12000×g离心5min。

(4)将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12000×g离心30s，弃掉废液。(吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。

(6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW(使用前检查是否已加入无水乙醇)，10000×g离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

(8)重复操作步骤(7)。

(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000×g离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CB3转入干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000×g离心2min，将溶液收集到离心管中。

(11)将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000×g离心2min。

(12)DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

4.2厌氧真菌ITS1序列的扩增

利用厌氧真菌ITS1专用引物Neo18S For(5’-AAT CCT TCG GAT TGG CT-3’)和Neo5.8S Rev(5’-CGA GAA CCA AGA GAT CCA-3’)扩增厌氧真菌的ITS1全序列(Edwards等，2008)。使用MyCycler PCR仪(Bio-rad，美国)进行扩增，PCR反应缓冲液(总体积10μL)包括40mM Tricine-KOH(pH 8.0),16mM KCI，3.5mM MgC1

由以上鉴定可知：自然的厌氧真菌和甲烷菌混合培养物YakQH5中的厌氧真菌属于单中心生长类型，内生型的球型孢子囊(50×100μm)，假根高度分枝，菌丝体无隔，多鞭毛的游动孢子的Neocallimastix属厌氧真菌，分子生物学进一步鉴定为Neocallimastixfrontalis属菌株。其ITS1序列如SEQ ID No:1所示。

5.甲烷菌的鉴定

5.1甲烷菌的多样性分析

厌氧真菌和甲烷菌共培养物5mL，10000×g离心10min，沉淀用1mL PBS漂洗，离心后沉淀置于-20℃保存。甲烷菌DNA提取法同前面厌氧真菌DNA提取方法。

PCR-DGGE技术检测厌氧真菌及甲烷菌共培养中和每一株厌氧真菌共存的甲烷菌的多样性。所用引物为519f/915r GC，PCR反应混合液及反应程序参照Coolen等(2004)的方法。DGGE(DCode DGGE系统，Bio-rad，美国)采用6％聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺是37：1(w/w)，100％变性胶含有7mol/L尿素和40％(v/v)甲酰胺。变性胶浓度为30％-75％。电泳条件为：60℃水温，200电泳10min，然后85V电泳16h。DGGE凝胶经过固定，银染，显影，固定后，用SQ-GS 800型扫描仪(Bio-rad，美国)扫描保存。

5.2甲烷菌的分子生物学鉴定

以甲烷菌16SrDNA通用引物Met86F(5’-GCT CAG TAA CAC GTG G-3’)和Met1340R(5’-CGG TGT GTG CAA GGA G-3’)用来扩增甲烷菌的16SrDNA序列(Wright&Pimm，2003)。PCR反应体系(总体积50μL)包括200nM上下游引物，大约0.3mg纯化的DNA，1×Taq反应缓冲液，每个dNTP 200uM，2mM MgCl

扩增出的厌氧真菌ITS1和甲烷菌16SrDNA片段经琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察后纯化回收PCR产物，将PCR产物送华大基因公司测序。

由以上鉴定可知：DGGE电泳和16S rRNA基因结果证明在这一个厌氧真菌和甲烷菌自然混合培养物YakQH5中，一株厌氧真菌只和一株甲烷菌相联系，符合“一对一”模式。这一株厌氧真菌Neocallimastix frontalis上自然粘附了一株甲烷菌，并测定出甲烷菌的16SrDNA序列如SEQ ID No:2所示，经分子生物学鉴定甲烷菌为Methanobrevibactergottschalkii属菌株。

实施例二、厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibacter gottschalkii)的混合培养物YakQH5菌剂的制备

吸取1mL厌氧真菌(Neocallimastix frontalis)和甲烷菌(Methanobrevibactergottschalkii)的混合培养物YakQH5接种到亨氏厌氧管中的9mL以风干粉碎的小麦秸秆为底物的厌氧培养基中，同时加入0.1mL复合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培养72h，即达到生长高峰，此时发酵液为高活力菌剂。

实施例三、混合培养物YakQH5厌氧发酵降解秸秆生产香豆酸酯酶

在100mL体积厌氧发酵瓶中盛45mL液体基本培养基，分别以0.5g干燥粉碎后的小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、燕麦秸秆和高粱秸秆作为底物。除氧，高压灭菌。把实施例一得到的混合培养物YakQH5用无菌注射器吸取5mL分别接种到上述加有秸秆的厌氧培养基中，同时加入0.5mL复合抗生素(1600IU/mL青霉素和2000IU/mL硫酸链霉素)，39℃厌氧培养5天。共设置3个平行实验，隔24h测定厌氧瓶中的香豆酸酯酶活性。

香豆酸酯酶活性通过高效液相色谱法测定：将100mg去淀粉后的小麦麸悬浮在1mLpH 6.8的100mM MOPS缓冲液中，加入酶液(即1mL上述发酵液上清液)，在39℃恒温20min，煮沸样品3min终止作用。上清液中香豆酸浓度的测定通过HPLC(Waters,USA)配备伍丰分析仪器，对称反相C18柱(250×4.6mm,5μm,pH 2-8,Waters,USA)。根据标准曲线计算香豆酸酯酶的活性。

一个酶活性的单位定义为：在上述条件下，每毫升每分钟释放1.0μmol对香豆酸所需的酶量。

表1自然混合培养物YakQH5以5种秸秆为底物5天培养期内香豆酸酯酶活性

注：

实验结果如表1所示，混合培养物YakQH5在5天培养期内分别降解5种秸秆产生香豆酸酯酶活性达到的最高值分别为：以小麦秸秆为底物香豆酸酯酶活性为2.3mU，以玉米秸秆为底物的香豆酸酯酶活性为4.9mU，以水稻秸秆为底物的香豆酸酯酶活性为2.8mU，以燕麦秸秆为底物的香豆酸酯酶活性为3.6mU，以高粱秸秆为底物的香豆酸酯酶活性高达20.5mU，具有重要工业应用价值。