一种箭叶淫羊藿“黔藿1号”的SRAP分子标记引物组合及其应用

技术领域

本发明属于中药材DNA分子鉴定及应用的技术领域，更具体地，利用“相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism, SRAP)”提供的上、下游引物表中分别随机选取若干条（见附表1），自由组合成若干对引物，对“黔藿1号”的DNA进行PCR扩增，从中筛选出重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。建立“黔藿1号”区别于淫羊藿属其他物种的特异性条带。

背景技术

中药材淫羊藿Epimedii folium是小檗科淫羊藿属植物淫羊藿

“黔藿1号”为贵州省非主要农作物和食用菌品种认定专家委员会中药材专业委员会于2021年认定通过的中药材箭叶淫羊藿优良品种，其品质优（叶片总黄酮醇苷含量达到14.8%，是目前发现的淫羊藿属植物中总黄酮醇苷含量最高的一个种）、产量高（以根段茎繁育的种苗在种植2年后田间产量可达到鲜叶360 kg/亩），主要种植于贵州省黔东南、黔南一带。

小檗科淫羊藿属下有41个物种，被历版《中国药典》收载作为中药材淫羊藿的物种仅有淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿和朝鲜淫羊藿4个，巫山淫羊藿被《中国药典》单独收载。淫羊藿属植物野生资源丰富，在我国分布较广，加之淫羊藿属于我国传统大宗药材且下游开发的产品较多，对淫羊藿药材的需求量大，过去主要靠采挖野生资源为主，导致野生资源濒临灭绝状态，同时，因野生资源杂乱，质量参差不齐，导致下游产品质量不稳定，最终疗效不稳定也是必然。随着我国中医药事业的发展，中医药必将走出国门，对中药材质量的要求不断提高，药材基源可追溯，种苗繁育、种植、采收、加工、包装等环节规范化的文件、政策相应出台并实施。“黔藿1号”属于人工选育出的具备特异性、稳定性和一致性的箭叶淫羊藿优良品种，在加工端如何保证所需原料即为“黔藿1号”仍需要一个可操作、易于实施的技术手段。

为保证中药材箭叶淫羊藿质量稳定、临床疗效可靠，需建立一种可明确箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”基源的鉴别方法，以保护“黔藿1号”的真实性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种鉴定箭叶淫羊藿良种“黔藿1号”的SRAP分子标记引物组合及其应用。

本发明所提供的SRAP分子标记引物组合为：

Me18-Em10正向引物： 5'-TGAGTCCTTTCCGGTCC-3'，

Me18-Em10反向引物： 5'-GACTGCGTACGAATTCAT-3'

一种鉴定箭叶淫羊藿良种“黔藿1号”的方法，包括以下步骤：

（1）在“相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)”提供的上、下游引物表中分别随机选取各18条，自由组合成324对引物，对待测样品的DNA进行PCR扩增，从中筛选出重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合；

（2）对PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以筛选重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。

（3）电泳结束后，进行染色、显色，并置于Chemi Doc TM凝胶成像系统下拍照保存。

若聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带显示附图1中的S1泳道图，则为“黔藿1号”这个物种，若不是则为其他物种。

上述鉴定箭叶淫羊藿“黔藿1号”的方法中，聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制方法如下：

20%过硫酸铵溶液的配制：称取20 g过硫酸铵用蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即可；

8%聚丙烯酰胺凝胶配制：首先分别加入32.1 mL 30% Acr-Bis（29:1）、24 mL 5×TBE缓冲液、60.25 mL超纯水、75 µL PAGE胶促凝剂，最后加入750 µL20%过硫酸铵溶液，搅拌混匀，即得；

银染液的配制：称取0.1 g硝酸银加入蒸馏水溶解，定容至1 L；

显色液的配制：称取20 g氢氧化钠加入蒸馏水溶解，定容至1 L，使用前加入3 mL甲醛溶液，即得；

上述鉴定箭叶淫羊藿良种“黔藿1号”的方法中，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对扩增产物进行电泳检测，缓冲液为 0.5×TBE，电压（V）=120 V，电泳时间90 min。

本发明的有益效果：所鉴定的材料不受地域环境的影响，通过一对引物组合可快速的鉴别目标物种。

附图说明

图1是本发明的“黔藿1号”鉴别Me18-Em10引物组合的PAGE凝胶电泳图；

图2是本发明的15份淫羊藿种质DNA凝胶电泳鉴定图。

图3是本发明的15份淫羊藿种质UPGMA聚类图。

实施方式

实施例

本发明所提供的鉴别中药材箭叶淫羊藿优良品种“黔藿1号”的引物对以区别于小檗科淫羊藿属的其他物种的方法的应用，包括以下步骤：

(a)在“相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)”提供的上、下游引物表中分别随机选取各18条（见附表1），自由组合成324对引物，进行PCR扩增，从中筛选出重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。具体的PCR扩增过程包括以下步骤：

(b)利用步骤如下步骤提取小檗科淫羊藿属植物的基因组DNA。

将小檗科淫羊藿属植株的幼嫩组织用75%乙醇擦拭表面，然后用灭菌后的超纯水冲洗，用无菌纸擦拭干净，放入液氮速冻，使用研钵粉碎成细粉，然后采用DNA提取试剂盒Plant DNA Kit (D3485)进行DNA的分离和纯化，提取过程严格按照试剂盒使用说明书提取基因组DNA；

进一步地，吸取步骤(b)中的DNA样品溶液2 µL，以Elution Buffer作为空白溶液，用NANO DROP1000分光光度计检测DNA样品溶液的浓度及纯度，纯度要求在1.8~2.0范围，浓度及纯度判定合格进入下一步操作程序；

(c)进一步地，配制SRAP-PCR扩增体系，体系总体积为25 µL，其中步骤(b)中的DNA样品液1 µL，步骤(a)中的上、下游引物对溶液各1 µL，金牌Mix溶液 22 µL。

(d)进一步地，在PCR扩增仪上设置扩增步骤(c)中的体系，反应程序为94 ℃ 5min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min，4℃保存。

对步骤(d)中的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以筛选重复性好、扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合。具体的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程包括以下步骤：

聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制：

20%过硫酸铵溶液的配制：称取20 g过硫酸铵用蒸馏水溶解，并定容至100 mL，即可。

8%聚丙烯酰胺凝胶配制：首先分别加入32.1 mL 30% Acr-Bis（29:1）、24 mL 5×TBE缓冲液、60.25 mL超纯水、75 µL PAGE胶促凝剂，最后加入750 µL20%过硫酸铵溶液，搅拌混匀，即得。

银染液的配制：称取0.1 g硝酸银加入蒸馏水溶解，定容至1 L。

显色液的配制：称取20 g氢氧化钠加入蒸馏水溶解，定容至1 L，使用前加入3 mL甲醛溶液，即得。

(e)进一步地，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶对步骤(q)中的扩增产物进行电泳检测，缓冲液为 0.5×TBE，电压（V）=120 V，电泳时间90 min。

(f)进一步地，步骤(e)电泳结束后，将玻璃板取下，揭去凹型玻璃板，去掉底部的琼脂糖凝胶，将胶取下放入染色盘中，用蒸馏水冲洗两次，倒入适量的染色液，置于摇床上染色10 min。

(g)进一步地，步骤(f)显色结束后，倒出染色液，蒸馏水冲洗两次，倒入显色液，轻摇至显出清晰条带。

(h)进一步地，步骤(g)结束后，倒出显色液，蒸馏水冲洗两次，置于Chemi Doc TM凝胶成像系统下拍照保存。

更进一步地，若步骤(h)中聚丙烯酰胺凝胶电泳谱带显示附图1中的S1的泳道图，则为“黔藿1号”这个物种，若不是则为小檗科淫羊藿属其他物种。

附表

表1 SRAP-PCR反应引物