盐酸氨基葡萄糖胶囊的含量测定方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及用液相色谱法测定盐酸氨基葡萄糖胶囊含量的方法。

背景技术

盐酸氨基葡萄糖是一种天然氨基单糖，是蛋白多糖合成的前体物质，可刺激软骨细胞产生具有正常多聚体结构的蛋白多糖，可提高软骨细胞的修复能力，抑制损伤关节软骨的酶，促进软膏基质的修复和重建。全球范围内有片剂、胶囊剂上市。盐酸氨基葡萄糖胶囊临床主要用于治疗和预防全身所有部位的骨关节炎，包括膝关节、肩关节、髋关节、手腕关节、颈及脊椎关节和踝关节等。可缓解和消除骨关节炎的疼痛、肿胀等症状，改善关节活动功能。

盐酸氨基葡萄糖制剂在全球范围内有胶囊剂、片剂、颗粒剂上市，另有盐酸氨基葡萄糖软膏剂、口服液、凝胶剂等新剂型的开发研究、暂未上市；其中胶囊剂仅在香港地区和中国内地地区上市，上市规格为0.75g和0.24g。目前盐酸氨基葡萄糖已成为临床上广泛使用的抗骨关节炎药物，用于治疗和预防全身所有部位的骨关节炎，临床疗效肯定，毒副作用低，在国内外市场应用广泛。盐酸氨基葡萄糖胶囊的化学名为聚(烯丙基胺基-共-N,N’-二烯丙基-1,3-二氨基-2-羟丙烷)碳酸盐，其结构式见下式：

（a）

盐酸氨基葡萄糖胶囊原国家标准WS1-(X-090)-2005Z采用紫外可见分光光度法，方法专属性和重复性均较差，USP39采用HPLC测定，检测波长为195nm，该波长条件下系统干扰大，溶剂影响大，重复性结果较差，针对上述问题，我们采用衍生化反应生成物通过液相-荧光的方法进行检测，该方法专属性好，灵敏度度，结果稳定。

发明内容

本发明目的在于提供盐酸氨基葡萄糖胶囊的含量测定方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现，该方法包括如下步骤：

色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm，以磷酸盐溶液（取磷酸二氢钾4.08g与磷酸2.08g）为流动相 A，乙腈为流动相B，流速为1.5ml/min，柱温为35℃，检测器为荧光检测器，激发波长为390nm，发射波长为475nm，采集时间为30分钟。

空白溶液的制备：取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加0.1mol/L盐酸1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后测定。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

在上述色谱条件下，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算盐酸氨基葡萄糖的含量。

本发明供试品含氨基葡萄糖C

本发明的盐酸氨基葡萄糖胶囊含量测定的优选方法如下：色谱柱AgilentEclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm，以磷酸盐溶液（取磷酸二氢钾4.08g与磷酸2.08g）为流动相 A，乙腈为流动相B，流速为1.5ml/min，柱温为35℃，检测器为荧光检测器，激发波长为390nm，发射波长为475nm，采集时间为30分钟。

空白溶液的制备：取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加0.1mol/L盐酸1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后测定。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

在上述色谱条件下，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图，在与对照品溶液相同保留时间处有相同的峰；对照品溶液中主成分与相邻色谱峰分离度大于1.5。空白溶液中无与盐酸氨基葡萄糖对照品相同的峰出现。

色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm，以磷酸盐溶液（取磷酸二氢钾4.08g与磷酸2.08g）为流动相 A，乙腈为流动相B，流速为1.4ml/min,柱温为35℃，检测器为荧光检测器，激发波长为390nm，发射波长为475nm，采集时间为30分钟。

空白溶液的制备：取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加0.1mol/L盐酸1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后测定。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

在上述色谱条件下，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图，在与对照品溶液相同保留时间处有相同的峰；对照品溶液中主成分与相邻色谱峰分离度大于1.5。空白溶液中无与盐酸氨基葡萄糖对照品相同的峰出现。

本发明供试品含氨基葡萄糖C

色谱条件：色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm，以磷酸盐溶液（取磷酸二氢钾4.08g与磷酸2.08g）为流动相 A，乙腈为流动相B，流速为1.6ml/min,柱温为35℃，检测器为荧光检测器，激发波长为390nm，发射波长为475nm，采集时间为30分钟。

空白溶液的制备：取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加0.1mol/L盐酸1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后测定。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

在上述色谱条件下，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图，在与对照品溶液相同保留时间处有相同的峰；对照品溶液中主成分与相邻色谱峰分离度大于1.5。空白溶液中无与盐酸氨基葡萄糖对照品相同的峰出现。

本发明供试品含氨基葡萄糖C6H13O5N.HCl 应为标示量的95%-105%。

盐酸氨基葡萄糖胶囊由如下方法制成：由盐酸氨基葡萄糖为主药，微晶纤维素为填充剂，经制粒，总混，胶囊填充，包装即得。

本发明质量控制方法依据试验结果表明其重复性良好，线性关系良好，精密度良好，溶液稳定性好，回收率良好，线性范围广。

以下通过实施例形式再对本发明的内容作进一步详细说明，但不应就此理解为本发明上述主题范围内仅限于以下实施例。在不脱离本发明上述技术前提下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的相应替换或变更的修改，均包括在本发明的范围内。

实施例1 专属性试验

色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm，以磷酸盐溶液（取磷酸二氢钾4.08g与磷酸2.08g）为流动相 A，乙腈为流动相B，流速为1.5ml/min,柱温为35℃，检测器为荧光检测器，激发波长为390nm，发射波长为475nm，采集时间为30分钟。

空白溶液的制备：取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加0.1mol/L盐酸1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后测定。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

供试品溶液的制备：精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，照“空白溶液的制备”项下同法操作，即得。

在上述色谱条件下，精密吸取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品溶液色谱图，在与对照品溶液相同保留时间处有相同的峰；对照品溶液中主成分与相邻色谱峰分离度应不小于1.5。空白溶液中应无与盐酸氨基葡萄糖对照品相同的峰出现。

结果表明：供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱相同保留时间处，有相同的峰，对照品溶液中主成分与相邻色谱峰的分离度不小于1.5，空白溶液中无与盐酸氨基葡萄糖对照品相同的峰，即空白不干扰。

实施例2 线性关系试验

取对照品贮备液（2mg/ml），分别用0.1mol/L盐酸稀释成4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml不同浓度的对照品溶液，作为对照品工作液。取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，再分别加入不同浓度的对照品工作液1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后，分别吸取各对照溶液10ul，注入液相色谱仪。计算浓度值与峰面积值的线性方程及回归系数，结果见表1。

表1线性关系试验数据表

回归方程：y = 122921.2392 x + 127299.1463，相关系数R²= 0.9997。

试验结果表明，在0.40μg/ml-4.00μg/ml 范围内，溶液浓度的值与相应峰面积值的线性关系良好。

实施例3 精密度试验

精密吸取对照品溶液（20μg/ml）10ul 注入色谱仪，重复测定6 次，计算其精密度，结果见表2。

表2 精密度试验数据表

试验结果表明，精密度良好。

实施例4 稳定性试验

精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后，分别于0 小时、2小时、4 小时、8 小时、10小时精密吸取10μl 注入色谱仪，结果见表3。

表3 稳定性试验数据表

试验结果表明，溶液在10 小时内稳定。

实施例5 重复性试验

精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时，作为供试品溶液，依此方法重复制备样品6份。另取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时，作为对照品溶液，精密吸取10μl对照品溶液、供试品溶液注入色谱仪，结果见表4。

表4 重复性试验数据表

试验结果表明，本方法重复性较好。

实施例6 回收率试验

取对照品贮备液（2mg/ml），分别用0.1mol/L盐酸稀释成16μg/ml、20μg/ml、24μg/ml不同浓度的对照品溶液，作为对照品工作液。取0.037mol/L硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，再分别加入不同浓度的对照品工作液1ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时后，每个浓度平行配制3份，作为供试品溶液。另取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时，作为对照品溶液。分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。计算回收率。考察相对标准偏差，结果见表5。

表5 回收率试验数据表

试验结果表明，本方法回收率良好。

实施例7 耐用性试验

通过改变流动相比例、流速、柱温来评估测定条件微小变动时，测定结果不受影响的承受程度。在每个条件下，精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时，作为供试品溶液。另取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时，作为对照品溶液，精密吸取10μl对照品溶液、供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图，对照品溶液中主成分与相邻色谱峰分离度应不小于1.5。结果见表6。

表6 耐用性试验数据表

试验结果表明，本方法耐用性良好。

实施例8 含量测定试验

色谱柱Agilent Eclipse XDB-C18，4.6×150mm，5μm，以磷酸盐溶液（取磷酸二氢钾4.08g与磷酸2.08g）为流动相 A，乙腈为流动相B，流速为1.5ml/min，柱温为35℃，检测器为荧光检测器，激发波长为390nm，发射波长为475nm，采集时间为30分钟。

供试品溶液的制备：精密称取本品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为供试品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加供试品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时。

对照品溶液的制备：精密称取盐酸氨基葡萄糖对照品100mg，置50ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取1ml，置100ml量瓶中，作为对照品工作液。取0.037mol/L的硼砂溶液2.0ml，加水1.0ml，加对照品工作液1.0ml，加衍生化试液1.0ml，涡旋混合20秒钟，静置3分钟后，加乙腈-水（1:1）5ml，混匀，放置2小时。精密吸取10μl对照品溶液、供试品溶液注入色谱仪，记录色谱图，对结果进行评价。结果见表7。

使用上述检测方法对三批样品进行含量测定，结果见表7。

表7 盐酸氨基葡萄糖胶囊含量测定结果