一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁体系

技术领域

本发明属于菌种发酵技术领域，尤其是涉及一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁系统及其方法技术领域。

背景技术

烟草黑胫病是由烟草疫霉菌引起的严重烟草病害，且广泛的存在于我国的烟草种植行业中。同时，随着近年来烟叶种植布局的优化调整加之大气温室效应的影响，这种病害在全国范围内的影响也是呈逐年递增的趋势。

我国传统的防治方法采用的是施用甲霜·锰锌，但长期的使用使其产生了相应的抗药性。为寻找新的解决方案，有研究发现烟草内生拮抗细菌具有抑制病原菌的功能。通过大量对烟草黑胫病拮抗菌的筛选和鉴定，我们筛选出与施用甲霜·锰锌具有相似功能的防治烟草黑胫病生防菌解淀粉芽孢杆菌YN48菌株，并进一步研究解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的大田应用效果。

在大田实验中，菌株的高效制备是生产应用的核心问题，但由于传统的菌种发酵的专业性强，发酵设备要求高、发酵成本过大、活性不高等诸多因素，使得菌株生产应用受到影响，目前芽孢杆菌相关产品的菌体均以芽孢形式存在，使其货架期能显著提高，但也造成在其应用时芽孢需要在一定条件下萌发后才能形成活性的菌体，进而发挥其生防菌功能，这在一定程度上会影响其应用效果，可见构建结构简单、操作便捷、能高效生产高活性芽孢杆菌菌体的快速扩繁体系是非常必要的。

发明内容

本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种解淀粉芽孢杆菌YN48菌株及其快速扩繁系统及其方法。

本发明采用如下技术方案实现。

一种细菌，所述的细菌菌株为解淀粉芽孢杆菌（

本发明所述细菌的应用为防治烟草黑胫病。

本发明所述细菌的培养基，其特征在于，所述的培养基配方包括蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L；使用NaOH溶液调节培养基至pH为7.0。

本发明所述NaOH溶液的浓度为1-4mol/L。

本发明所述细菌的培养条件为温度为30℃-40℃，维持pH为5.5-7.5，全程通氧发酵。

进一步为，本发明所述的培养条件为温度为34℃。

一种发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的快速扩繁系统，本发明所述的快速扩繁系统包括制氧机1、小型空气压缩机2、空气过滤器3、多头可调节式分气阀4、水质测定仪5、温度探头6、溶氧探头7、pH探头8、蠕动泵9、棉花塞10、加热棒11、曝气头12、发酵桶13；所述的制氧机1、小型空气压缩机2、空气过滤器3、多头可调节式分气阀4依序连接；多头可调节式分气阀4与曝气头12连接；温度探头6、溶氧探头7、pH探头8分别与水质测定仪5连接；水质测定仪5和蠕动泵9设置在发酵桶13一侧；蠕动泵9的泵头、温度探头6、溶氧探头7、pH探头8、加热棒11、曝气头12设置在发酵桶13内部；棉花塞10设置在发酵桶13的桶口处。

一种利用快速扩繁系统发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的方法，本发明所述方法包括如下步骤：

步骤1：在超净工作台内打开解淀粉芽孢杆菌YN48菌株平板，用移液枪往平板上加入5mL无菌水后并多次吸打，使解淀粉芽孢杆菌YN48菌株芽孢悬浮在无菌水中，之后用移液枪吸取悬液打入事先准备好的装有1L LB液体培养基的锥形瓶中，封好瓶口；

步骤2：将锥形瓶放入设置温度为37℃，150r/min的摇床中培养12h；

步骤3：取洁净18.9L桶装水桶作为发酵桶，以发酵体积为15L配制解淀粉芽孢杆菌YN48菌株培养基，蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L，将配好的培养基放入锅中，加水后总体积为1-2L，在电磁炉上加热至沸腾，再持续沸腾5min后倒入发酵桶中；

步骤4：发酵桶内加水定容至13L，用内置加热棒对发酵桶内用水以70℃加热30min，在此期间加入上述煮沸后的培养基，待桶内液体温度降至37℃以下，采取火焰接种法接入步骤1，2中摇好的生物量约为10

步骤5：将霉菌素、伊曲康唑、消泡剂加入到发酵桶内，放入灭菌后的恒温加热棒、补料管、曝气头、温度探头、pH探头、溶氧探头；用灭菌后的棉花塞封住罐口；

步骤6：打开制氧机开关，控制进氧量在5L/min以上；打开恒温加热棒开关，设置恒温温度在34℃；打开小型空气压缩机开关，增大通氧压力，利用通入的氧气使发酵桶内液体翻腾，从而实现搅拌效果；

步骤7：在此期间监测发酵时的溶氧、pH、温度变化情况，在pH低于5.5时用蠕动泵进行补碱，在溶氧值百分比低于1%时逐渐增大氧气供应量；发酵期间温度不应高于37℃；

步骤8：发酵期间利用蠕动泵吸取发酵桶内菌液，在显微镜下制片观察解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的生长状况并利用精子计数板在显微镜下进行计数；在发酵指数生长期过后，观察到溶氧值回升用蠕动泵补入20g/L葡萄糖；

步骤9：当发酵时间超过12h后，溶氧值开始回升，用蠕动泵吸取桶内发酵液，利用精子计数板在显微镜下计数，计数值在5.0×10

本发明上述步骤5中的灭菌具体为：除恒温加热棒、温度探头、pH探头、溶氧探头采用清水及酒精清洗消毒；其余在高压蒸汽灭菌锅下115℃，20min，或在沸水中煮沸10-15min的方式进行灭菌操作。

本发明的有益效果为，

（1）采用快速扩繁体系进行解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的发酵，设备较少，操作简单，降低了操作的复杂性。

（2）无大功率或大功耗用电器，常温常压下发酵，操作过程无绝对硬性规程，操作的缓适性强，可以在乡村田间等不同环境进行技术调整，适用于绝大部分大田发酵的场所。

（3）基于本菌株生长速度快，本发明集成流加补料等高密度发酵技术、高生物量接种和添加真菌生长抑制剂，使发酵过程很大程度杜绝污染，发酵产物生物量大，发酵所需时间短。

（4）在大田旁直接进行发酵，下罐菌液可直接应用到所需处，无货架期，菌种活性高，极大程度提高了菌液的作用效果。

总之本发明方法设备简洁，操作简便，发酵菌体生物量大，无污染，能够实现短时间内的高密度发酵，使菌体在最佳活性时应用在大田实验中。

下面结合附图及其具体实施方式本发明做进一步解释。

附图说明

图1是快速扩繁体系的设备连接图；

图2是解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的发酵生长曲线图（补料）；

图3是解淀粉芽孢杆菌YN48菌株菌剂的发酵生长曲线图（不补料）。

图中标号为：1-制氧机，2-小型空气压缩机，3-空气过滤器（0.01μm），4-多头可调节式分气阀，5-水质测定仪，6-温度探头，7-溶氧探头，8- pH探头，9-蠕动泵，10-棉花塞，11-加热棒，12-曝气头，13-发酵桶。

具体实施方式

一种细菌，所述的细菌菌株为解淀粉芽孢杆菌（

本发明所述细菌的应用为防治烟草黑胫病。

本发明所述细菌的培养基，其特征在于，所述的培养基配方包括蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L；使用NaOH溶液调节培养基至pH为7.0。

本发明所述NaOH溶液的浓度为1-4mol/L。

本发明所述细菌的培养条件为温度为30℃-40℃，维持pH为5.5-7.5，全程通氧发酵。

进一步为，本发明所述的培养条件为温度为34℃。

一种发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的快速扩繁系统，本发明所述的快速扩繁系统包括制氧机1、小型空气压缩机2、空气过滤器3、多头可调节式分气阀4、水质测定仪5、温度探头6、溶氧探头7、pH探头8、蠕动泵9、棉花塞10、加热棒11、曝气头12、发酵桶13；所述的制氧机1、小型空气压缩机2、空气过滤器3、多头可调节式分气阀4依序连接；多头可调节式分气阀4与曝气头12连接；温度探头6、溶氧探头7、pH探头8分别与水质测定仪5连接；水质测定仪5和蠕动泵9设置在发酵桶13一侧；蠕动泵9的泵头、温度探头6、溶氧探头7、pH探头8、加热棒11、曝气头12设置在发酵桶13内部；棉花塞10设置在发酵桶13的桶口处。

一种利用快速扩繁系统发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的方法，本发明所述方法包括如下步骤：

步骤1：在超净工作台内打开解淀粉芽孢杆菌YN48菌株平板，用移液枪往平板上加入5mL无菌水后并多次吸打，使解淀粉芽孢杆菌YN48菌株芽孢悬浮在无菌水中，之后用移液枪吸取悬液打入事先准备好的装有1L LB液体培养基的锥形瓶中，封好瓶口；

步骤2：将锥形瓶放入设置温度为37℃，150r/min的摇床中培养12h；

步骤3：取洁净18.9L桶装水桶作为发酵桶，以发酵体积为15L配制解淀粉芽孢杆菌YN48菌株培养基，蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L，将配好的培养基放入锅中，加水后总体积为1-2L，在电磁炉上加热至沸腾，再持续沸腾5min后倒入发酵桶中；

步骤4：发酵桶内加水定容至13L，用内置加热棒对发酵桶内用水以70℃加热30min，在此期间加入上述煮沸后的培养基，待桶内液体温度降至37℃以下，采取火焰接种法接入步骤1，2中摇好的生物量约为10

步骤5：将霉菌素、伊曲康唑、消泡剂加入到发酵桶内，放入灭菌后的恒温加热棒、补料管、曝气头、温度探头、pH探头、溶氧探头；用灭菌后的棉花塞封住罐口；

步骤6：打开制氧机开关，控制进氧量在5L/min以上；打开恒温加热棒开关，设置恒温温度在34℃；打开小型空气压缩机开关，增大通氧压力，利用通入的氧气使发酵桶内液体翻腾，从而实现搅拌效果；

步骤7：在此期间监测发酵时的溶氧、pH、温度变化情况，在pH低于5.5时用蠕动泵进行补碱，在溶氧值百分比低于1%时逐渐增大氧气供应量；发酵期间温度不应高于37℃；

步骤8：发酵期间利用蠕动泵吸取发酵桶内菌液，在显微镜下制片观察解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的生长状况并利用精子计数板在显微镜下进行计数；在发酵指数生长期过后，观察到溶氧值回升用蠕动泵补入20g/L葡萄糖；

步骤9：当发酵时间超过12h后，溶氧值开始回升，用蠕动泵吸取桶内发酵液，利用精子计数板在显微镜下计数，计数值在5.0×10

本发明上述步骤5中的灭菌具体为：除恒温加热棒、温度探头、pH探头、溶氧探头采用清水及酒精清洗消毒；其余在高压蒸汽灭菌锅下115℃，20min，或在沸水中煮沸10-15min的方式进行灭菌操作。

本发明以微生物发酵桶为模型，结合微生物高密度发酵技术及生防菌的发酵特性，构建含温度、pH、溶氧检测及补料功能的扩繁体系，实现生防菌解淀粉芽孢杆菌YN48菌株非芽孢、而以高活性活菌体形式的高效发酵生产。

本发明提供了设备简便、发酵所需时间更短、通过对培养基进行常温加热消毒即可接种，添加真菌抑菌剂抑制真菌污染，使操作过程不用高压灭菌而更加简单，持续的通氧发酵能显著提高发酵效率，所发酵的菌液生物量大，能够一定程度上实现高密度发酵。

本发明采用技术方案实施如下。

(1)构建生防菌解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的快速扩繁体系，其主要由制氧机、小型空气压缩机、发酵桶、控温加热棒、pH和溶氧探头及管线等构成。溶氧是芽孢杆菌好氧发酵的限制因子，以制氧机供应93%以上氧含量的空气对提高发酵效率具有重要作用；空气过滤器实现对空气的过滤除菌，避免污染；小型空气压缩机实现给气体增压有利于曝气和发酵桶内的发酵液搅拌；发酵桶用于装载培养基；控温加热棒放置于发酵桶内，用于对培养基进行加热消毒，以及发酵阶段用于保温；pH和溶氧探头用于监测发酵液的溶氧和pH变化。

(2)本体系中使用的解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的培养基成份为：蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L、调节pH为7.0；本体系中使用的NaOH溶液浓度为1-4mol/L，用于调节发酵过程中的酸碱度；消泡剂用于发酵过程消泡；本体系中使用的真菌抑菌剂含制霉菌素、伊曲康唑，使用时添加至发酵液中使其终浓度均达到80-150μg/mL，用于抑制发酵过程中可能出现的真菌污染。

(3) 设备的组装，设备搭建以及具体连接方式

实验设备、器械清洗，灭菌：使用ddH

设备的连接：主体设备可分为加氧设备和发酵设备。加氧设备的出气口连接小型空气压缩机，再连接空气过滤器，空气自小型空气压缩机打出后经空气过滤器进行过滤，进而通过发酵液底部的曝气头增加与发酵液的接触面积，提高空气的利用效率，如果发酵体积较大时，可选用功率更大的增氧设备；发酵设备中，主要由制氧机通过曝气头传导氧气翻动水体进行水体搅拌。水质测定仪的温度探头、溶氧探头、pH探头悬浮于发酵液的中心，对发酵过程进行实时监测；在发酵过程中的温度控制需要加入两根恒温加热棒，维持温度在34℃左右。

发酵设备图安装连接说明：

①将设备（1）制氧机放置在平地处，使用灭好菌的管线从制氧机的出气口接出，连接到设备（2）小型小型空气压缩机上，从小型空气压缩机出来的空气经过空气过滤器（3）后到达多头可调节式分气阀（4）；再将灭好菌的管线连接曝气头（13）与多头可调节式分气阀（4）连接好，曝气头放入发酵桶内。

②安装好发酵监测设备水质测定仪（5），接出的温度探头（6）、溶氧探头（7）、pH探头（8）放入发酵容器内（可以用矿泉水桶）。

③安装好蠕动泵（9），连接好的管线接入发酵容器内。

④将通好电的加热棒（11）接入发酵容器内。

⑤用灭过菌的棉花塞（10）封住发酵容器口。

此时，设备安装连接完毕。

以下的操作如无特殊说明均为实验室常规操作，所用试剂及仪器设备均可于市面购买获得，所用菌株由云南大学生物资源保护与利用重点实验室莫明和教授提供。

本发明利用快速扩繁体系发酵解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的方法如下：

实例1：解淀粉芽孢杆菌YN48菌株芽孢的活化

1．在超净工作台内打开解淀粉芽孢杆菌YN48菌株平板，用移液枪往平板上加入5mL无菌水后并多次吸打，使解淀粉芽孢杆菌YN48菌株芽孢悬浮在无菌水中，之后用移液枪吸取悬液打入事先准备好的装有1L LB液体培养基的锥形瓶中，封好瓶口；

2．将锥形瓶放入设置温度为37℃，150r/min的摇床中培养12h；

3．对锥形瓶中的发酵液进行采样，制片，利用血球计数板在显微镜下计数，计数值为1.7×10

实例2：解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的补料发酵

1．取洁净18.9L桶装水桶作为发酵桶，以发酵体积为15L配制解淀粉芽孢杆菌YN48菌株培养基，蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L，将配好的培养基放入锅中（加水后总体积约为1-2L），在电磁炉上加热至沸腾，再持续沸腾5min后倒入发酵桶中；

2．发酵桶内加水定容至13L，用内置加热棒对发酵桶内用水以70℃加热30min，在此期间加入煮沸后的培养基，待桶内液体温度降至37℃以下，采取火焰接种法接入步骤1，2中摇好解淀粉芽孢杆菌YN48菌液，配制3mol/L NaOH溶液，调节桶内pH为7.0；

3．将霉菌素，伊曲康唑，消泡剂加入到发酵桶内，放入灭菌后的恒温加热棒、补料管、曝气头、温度探头、pH探头、溶氧探头；用灭菌后的棉花塞封住罐口；

上述灭菌操作，除恒温加热棒、温度探头、pH探头、溶氧探头是采用清水及酒精清洗消毒外，其余都是在高压蒸汽灭菌锅下115℃，20min（如果没有灭菌锅灭菌条件，也可采用在沸水中煮沸10-15min的方式进行灭菌操作）。

4．打开制氧机开关，控制进氧量在5L/min；打开恒温加热棒开关，设置恒温温度在34℃；打开小型空气压缩机开关，增大通氧压力，利用通入的氧气使发酵桶内液体翻腾，从而实现搅拌效果；

5．在此期间监测发酵时的溶氧、pH、温度变化情况，在pH低于5.5时用蠕动泵进行补碱，在溶氧值百分比低于1%时逐渐增大氧气供应量；发酵期间温度不应高于37℃；

6．发酵期间利用蠕动泵吸取发酵桶内菌液，在显微镜下制片观察解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的生长状况并利用精子计数板在显微镜下进行计数。在发酵指数生长期过后，观察到溶氧值回升可以用蠕动泵补入20g/L葡萄糖；本次实验于发酵6h，10h时分别进行一次补料；

7．当发酵时间超过15h后，溶氧值开始回升，用蠕动泵吸取桶内发酵液，利用精子计数板在显微镜下计数，计数值为1.34×10

实例3：解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的不补料发酵

1．取洁净18.9L桶装水桶作为发酵桶，以发酵体积为15L配制解淀粉芽孢杆菌YN48菌株培养基，蔗糖20g/L、葡萄糖10g/L、氯化钠10g/L、酵母粉10g/L，磷酸氢二铵1g/L、磷酸二氢钾0.6g/L、硫酸锰0.25g/L，将配好的培养基放入锅中（加水后总体积约为1-2L），在电磁炉上加热至沸腾，再持续沸腾5min后倒入发酵桶中；

2．发酵桶内加水定容至13L，用内置加热棒对发酵桶内用水以70℃加热30min，在此期间加入煮沸后的培养基，待桶内液体温度降至37℃以下，采取火焰接种法接入步骤1，2中摇好解淀粉芽孢杆菌YN48菌液，配制3mol/L NaOH溶液，调节桶内pH为7.0；

3．将霉菌素，伊曲康唑，消泡剂加入到发酵桶内，放入灭菌后的恒温加热棒、补料管、曝气头、温度探头、pH探头、溶氧探头；用灭菌后的棉花塞封住罐口；

上述灭菌操作，除恒温加热棒、温度探头、pH探头、溶氧探头是采用清水及酒精清洗消毒外，其余都是在高压蒸汽灭菌锅下115℃，20min（如果没有灭菌锅灭菌条件，也可采用在沸水中煮沸10-15min的方式进行灭菌操作）。

4．打开制氧机开关，控制进氧量在5L/min；打开恒温加热棒开关，设置恒温温度在34℃；打开小型空气压缩机开关，增大通氧压力，利用通入的氧气使发酵桶内液体翻腾，从而实现搅拌效果；

5．在此期间监测发酵时的溶氧、pH、温度变化情况，在溶氧值百分比低于1%时逐渐增大氧气供应量；发酵期间温度不应高于37℃；本次实验无任何补料操作；

6．发酵期间利用蠕动泵吸取发酵桶内菌液，在显微镜下制片观察解淀粉芽孢杆菌YN48菌株的生长状况并利用精子计数板在显微镜下进行计数。

7．当发酵时间超过13h后，溶氧值开始回升，用蠕动泵吸取桶内发酵液，利用精子计数板在显微镜下计数，计数值为5.4×10

本发明方法中控制器为常规控制器，制氧机、空气压缩机、蠕动泵、补料蠕动泵、恒温加热棒，按常规方法控制上述组件的开闭。

以上所述的仅是本发明的部分具体实施例，方案中公知的具体内容或常识在此未作过多描述。应当指出，上述实施例不以任何方式限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。