植物材料分类方法
文献发布时间：2023-06-19 09:24:30
技术领域
本公开总体上涉及将一批植物材料分类为受污染的或未受污染的。该分类基于对与不育性相关联的一种或多种多核苷酸序列的分析。通过执行本文所述的方法，可以确定某批次或分批的植物材料是受污染的还是未受污染的，以确保植物材料的质量或完整性。特别地，本公开使得可以易于确定一批植物材料是否已经被掺杂。
背景技术
商业上准备的烟草种子出售给农民，供他们种植烟草植物。为了确保所生产的烟草的质量，通常期望种子的生产者能够测试烟草植物或由其衍生的烟草产品，以检查其来源于提供给农民的烟草种子。种子生产者还期望能够检查所出售的烟草植物或烟草产品没有被来自其他种源的烟草污染或掺杂，是完全由供应的种子获得的。这有助于确保烟草植物或由其衍生的烟草产品的质量。例如，包含来源于已出售给农民的商业上准备的烟草种子以外的任何烟草种子的烟草的烟草批次或分批可能质量低劣，因而可能必须丢弃。
本领域中需要可以用于检查植物材料(诸如烟草材料)或由其衍生的产品的质量或掺杂的测试。特别地，本领域中需要可以在适合于高通量分析的植物产品生产的任何阶段使用的简化方法。
发明内容
商业上准备的烟草种子通常以非可育形式出售。细胞质雄性不育性 (CMS)是生产用于商业用途的非可育烟草植物的主要方式，并且是不育性的常见遗传来源。CMS是经由回交将普通烟草(Nicotiana tabacum)核基因组转移到同一属的物种的细胞质中而产生的。在商业上，最丰富的不育性来源是来源于香甜烟草(Nicotiana suaveolens)细胞质或粉蓝烟草(Nicotiana glauca)细胞质的。本公开提供了通过分析至少一种(或仅一种)在即将经受分析的植物物种或品种之间具有多态性的多核苷酸序列，使得能够易于将可育植物材料与不育植物材料区分开的方法，所述植物物种或品种至少诸如普通烟草、香甜烟草和粉蓝烟草。如果分析结果指示植物材料的育性不符合预期，则表明植物材料已经被污染或被掺杂，并且例如是不合格的。这种区分可以实现，原因是某些植物物种中的与不育性相关联的某些多核苷酸序列在其中具有不同的多态性(例如，缺失或添加)，使得每个扩增的多核苷酸序列的大小或序列的差异允许鉴定这些多核苷酸序列所来源的物种。在某些实施方案中，可以将普通烟草细胞质(可育材料)与香甜烟草细胞质(不育材料)或粉蓝烟草细胞质(不育材料)区分开。根据该分析的结果，如果不育性的遗传来源与正在测试的这批植物材料的预期的不育性遗传来源相对应，则认为这批植物材料是未受污染的或未掺杂的(例如，合格的)，因为没有迹象表明该植物材料已经被含有不同的不育性遗传来源的植物材料污染。如果不育性的遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源不对应，则认为这批植物材料是受污染的或掺杂的(例如，不合格的)，因为有迹象表明该植物材料已经被含有不同的不育性遗传来源的植物材料污染或掺杂。在一些情况下，不育性的遗传来源可能与这批植物材料的预期的不育性遗传来源不对应，因为不育性的遗传来源是不可检测的。如果发现这批植物材料是未受污染的(例如，合格的)，则可以预期该植物材料免于污染或掺杂，并且由其衍生的植物材料将具有预期的质量或纯度。如果发现这批植物材料是受污染的或掺杂的(例如，不合格的)，则可以预期该植物材料已经被其他植物材料污染，并且由其衍生的植物材料将不具有预期的质量或纯度。在这种情况下，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
本发明可以用于确定不育杂种(诸如不育烟草杂种)中的育性状态。因此，本发明可以应用于对不育杂种(诸如农民田间的不育杂种作物)进行分类。
在一个方面，描述了用于将一批植物材料分类为受污染或未受污染的方法，包括：(i)由这批植物材料提供多核苷酸样品；(ii)使多核苷酸样品与一种或多种扩增引物接触，以扩增与不育性相关联的靶多核苷酸序列；(iii)对该样品执行体外多核苷酸扩增反应，以生成一种或多种扩增产物；(iv)确定一种或多种扩增产物的大小或序列；以及(v)基于在步骤(iv)中确定的一种或多种扩增产物的大小或序列，将所述一种或多种扩增产物的大小或序列与来自已知不育性遗传来源的已知的一种或多种扩增产物的大小或序列进行比较；其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源相对应，则认为这批植物材料是未受污染的；或者其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源不对应，则认为这批植物材料是受污染的。
适宜地，与不育性相关联的靶多核苷酸序列是与细胞质雄性不育性相关联的多核苷酸序列。
适宜地，存在与来自香甜烟草、粉蓝烟草、印度烟草(Nicotiana bigelovii)、皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、麦格隆熄丰烟草(Nicotiana megalosiphon)或波叶烟草(Nicotiana undulata)的不育性相关联的多核苷酸序列表明该植物材料是不育的；适宜地，其中与来自香甜烟草或粉蓝烟草的不育性相关联的多核苷酸序列表明该植物材料是不育的。
适宜地，与不育性相关联的靶多核苷酸序列来自叶绿体或线粒体。
适宜地，与不育性相关联的靶多核苷酸序列是基因间间隔区，适宜地，其中该基因间间隔区是叶绿体或线粒体基因间间隔区。
适宜地，该叶绿体基因间间隔区选自由以下项组成的组：trnH-psbA叶绿体基因间间隔区、trnL-trnF叶绿体基因间间隔区、ndhC-trnV叶绿体基因间间隔区、petA-psbJ叶绿体基因间间隔区、petN-psbM叶绿体基因间间隔区、 psbE-petL叶绿体基因间间隔区、psbM-trnD叶绿体基因间间隔区、rbc1-accD 叶绿体基因间间隔区、rpoD-trnC叶绿体基因间间隔区、rps16-trnQ叶绿体基因间间隔区、trnS-trnG叶绿体基因间间隔区、trnT-psbD叶绿体基因间间隔区、trnW-psaJ叶绿体基因间间隔区或ycf1叶绿体基因间间隔区，或者它们中的两者或更多者的组合，适宜地，其中trnH-psbA叶绿体基因间间隔区包含由SEQ ID NO:1示出的序列或由该序列组成，或者trnL-trnF叶绿体基因间间隔区包含由SEQ ID NO:5示出的序列或由该序列组成。
适宜地，待分类的这批植物材料是普通烟草植物材料。
适宜地，待分类的这批植物材料是普通烟草植物材料，并且其中预期的不育性遗传来源是来自香甜烟草、粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草，适宜地来自香甜烟草或粉蓝烟草的细胞质雄性不育性。
适宜地，待分类的这批植物材料是普通烟草植物材料，并且其中预期的不育性遗传来源是来自香甜烟草的细胞质雄性不育性，并且其中如果步骤 (v)中确定的不育性遗传来源与来自香甜烟草的细胞质雄性不育性相对应，则认为这批植物材料是未受污染的；或者其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与来自香甜烟草的细胞质雄性不育性不对应，则认为这批植物材料是受污染的。
适宜地，用于检查的这批植物材料是普通烟草植物材料，并且其中预期的不育性遗传来源是来自粉蓝烟草的细胞质雄性不育性，并且其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与来自粉蓝烟草的细胞质雄性不育性相对应，则认为这批植物材料是未受污染的；或者其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与来自粉蓝烟草的细胞质雄性不育性不对应，则认为这批植物材料是受污染的。
适宜地，植物材料选自由以下项组成的组：幼苗、种子、植物、植物部分、收获的植物材料、熟化的植物材料或者它们中的两种或更多种的组合。
适宜地，扩增产物的大小使用凝胶电泳，适宜地，琼脂糖凝胶电泳或双向凝胶电泳或毛细管电泳来确定；并且/或者
其中扩增产物的序列使用多核苷酸测序来确定。
还公开了一种用于将一批植物材料分类为受污染或未受污染的方法，包括使用一种或多种对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有特异性的扩增引物。
还公开了两种或更多种对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有特异性的扩增引物用于将一批植物材料分类为受污染或未受污染的用途。
适宜地，植物材料是不育杂种植物材料，诸如不育杂种烟草材料。
一些优点
有利地，本发明提供了在烟草生产过程的任何阶段的合格性或质量检查，该合格性或质量检查的对象包括：在田间移植之前从种子或幼苗提取的多核苷酸；从田间生长的植物提取的多核苷酸；和/或从熟化室中或购买站处的收获材料提取的多核苷酸。
与不育性相关联的靶多核苷酸序列(诸如基因间间隔区)在例如普通烟草、香甜烟草和粉蓝烟草中的每一者中具有不同的序列，并且可以利用序列中的这种差异来创建简单的测试，以将普通烟草细胞质(可育材料)与普通烟草细胞质(不育材料)、香甜烟草细胞质(不育材料)或粉蓝烟草细胞质 (不育材料)区分开。基于该分析的结果，可以易于确定某批次或分批的植物材料是受污染的或掺杂的，还是未受污染的。
本文所述的方法不需要使用限制性内切酶消化步骤来区分一种或多种扩增产物。这可以使得该方法更快更简单。
另外，本文所述的方法易于使用例如毛细管电泳来适合进行高通量分析。
有利地，可以扩增短的多核苷酸片段，使得可以分析含有降解的多核苷酸的植物材料，因为多核苷酸通常在经处理的植物材料(诸如熟化的植物材料)中破碎成短的片段。适宜地，这些短的多核苷酸片段是500个碱基对或更少。
具体实施方式
本公开中所用的章节标题用于组织目的并且不旨在进行限制。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文所披露的所述材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
如本文所用的术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可以”、“含有”以及它们的变体打算是开放性过渡短语、术语或措辞，不排除额外动作或结构的可能性。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式的“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物。
术语“和/或”意指(a)或(b)或者(a)和(b)两者。
本公开考虑了“包含”本文呈现的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方案，无论是否明确地阐述。
“扩增引物”是用于扩增靶多核苷酸序列的寡核苷酸，诸如与不育性相关联的基因间间隔区，例如，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区。因此，在某些实施方案中，所述一种或多种扩增引物靶向某些基因之间的基因间间隔区中的叶绿体多核苷酸(例如DNA)。一般来讲，这是通过在与靶多核苷酸序列杂交后寡核苷酸的延伸来实现的。扩增引物的至少一部分将与互补靶多核苷酸序列杂交。该部分被称为靶结合序列，它决定了引物的靶特异性。
“互补”是指核苷酸或核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U 和C-G)或Hoogsteen碱基配对。“互补性”是指两个多核苷酸之间共有的性质，使得当它们彼此反平行排列时，每个位置处的核苷酸碱基将是互补的。
术语“预期的不育性遗传来源”是指在进行本文所述的方法或分析之前，预期某批次或分批的植物材料具有的不育性遗传来源。这通常会是预先已知的，因为准备的烟草材料(诸如种子或幼苗)通常以非可育形式出售，而且这种不育性的遗传来源会是已知的。例如，在白肋烟地理区域中，CMS标准往往是香甜烟草CMS来源。在烤烟地理区域中，它往往是粉蓝烟草CMS 来源。在东方烟地理区域中，它往往是可育的普通烟草，因此不使用不育来源。因此，在一些情况下，烟草种子或幼苗以可育形式出售，在这种情况下，当以这种可育形式出售时，将不存在不育性遗传来源。从这些已知的不育性遗传来源获得或可获得的扩增产物的大小或序列也将是已知的，其如本文所述被利用。
术语“同源性”或“相似性”是指通过序列比对进行比较的两个多核苷酸之间的序列相似性程度。被比较的两个离散多核苷酸之间的同源性程度是在可比较位置处的相同或匹配核苷酸的数目的函数。
在两个或更多个多核苷酸的上下文中，“相同”或“同一性”意味着这些序列在特定区域上具有特定百分比的相同残基。百分比可以通过最佳比对两个序列，比较两个序列的指定区域，测定两个序列中存在相同残基的位置数产生匹配位置数，匹配位置数除以指定区域中的位置总数，并且结果乘以100 产生序列一致性百分比来计算。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错端并且指定比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括于计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)视为相当。同一性可以人工鉴定或通过使用计算机序列算法诸如 ClustalW、ClustalX、BLAST、FASTA或Smith-Waterman测定。流行的多重比对程序ClustalW(PolynucleotidesResearch(1994)22,4673-4680； Polynucleotides Research(1997),24,4876-4882)是用于生成多核苷酸的多重比对的合适方式。ClustalW的合适参数可能如下：对于多核苷酸比对：缺口开放罚分＝15.0，缺口延伸罚分＝6.66，并且矩阵＝一致性。对于DNA 和蛋白质比对：ENDGAP＝-1，并且GAPDIST＝4。本领域技术人员将会意识到，可能有必要改变这些和其他参数以达到最佳序列比对。然后，由这样的比对合适地以(N/T)计算一致性百分比，其中N是序列共享一致残基的位置数，T是比较的位置总数，包含缺口但不包括突出端。
术语“分离的”或“纯化的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随其的组分的材料。纯度和均质性通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术测定。如本文所用，术语“纯化的”表示多核苷酸在电泳凝胶中实质上产生一个条带。特别地，这意味着多核苷酸的纯度为至少85％，更优选地至少95％，并且最优选地至少99％。分离的多核苷酸可以从其天然存在的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规多核苷酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。术语还涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。
“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义互补链的序列。因此，多核苷酸也涵盖所描绘的单链的互补链。多核苷酸的许多变体可以用于与给定多核苷酸相同的目的。因此，多核苷酸也涵盖基本上相同的多核苷酸及其互补物。单链提供可以在严格杂交条件下与给定序列杂交的探针。因此，多核苷酸也涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。多核苷酸可以是单链或双链的，或者可以包含双链和单链序列的部分。多核苷酸可以是DNA(基因组DNA和cDNA两者)、RNA或杂交体，其中多核苷酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。多核苷酸可以通过化学合成方法或通过重组方法获得。
单链DNA杂交互补片段的特异性由反应条件的“严格性”决定 (Sambrook等人，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor(1989))。杂交严格度随着形成DNA双螺旋体的倾向降低而增加。在多核苷酸杂交反应中，可以选择严格性以有利于特异性杂交(高严格性)，所述特异性杂交可用于例如从文库中鉴定全长克隆。低特异性交杂(低严格度)可用于鉴别相关但不精确(同源，但不相同)的DNA分子或区段。DNA双链体根据以下因素稳定：(1)互补碱基对的数目；(2)碱基对的类型；(3)反应混合物的盐浓度(离子强度)；(4)反应温度；和(5)存在某些有机溶剂，诸如甲酰胺，其降低DNA双链体稳定性。一般来说，探针越长，适当退火所需的温度越高。常见方法是改变温度；较高相对温度导致较严格的反应条件。在“严格条件”下杂交描述了杂交方案，其中彼此至少60％同源的多核苷酸保持杂交。一般来说，选择严格条件比规定的离子强度和pH 值下的特异性序列的热熔点(Tm)低约5℃。Tm是与给定序列互补的50％探针与给定序列在平衡下杂交的温度(在确定的离子强度、pH和多核苷酸浓度下)。由于给定序列通常过量存在，因此在Tm下，50％的探针处于平衡状态。
“严格杂交条件”是使探针、扩增引物或寡核苷酸仅能够与其特定序列 (诸如特定的靶多核苷酸序列)杂交的条件。严格条件是序列依赖性的并且将不同。严格条件通常包括：(1)低离子强度和高温洗涤，例如15mM氯化钠、1.5mM柠檬酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠，在50℃下；(2)杂交过程中的变性剂，例如，50％(v/v)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液(750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠， pH6.5)，在42℃；或(3)50％甲酰胺。洗涤通常还包含42℃下的5xSSC(0.75 M NaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、 5x邓波特溶液(Denhardt's solution)、超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/mL)、 0.1％SDS以及10％硫酸葡聚糖，以及42℃下的0.2xSSC(氯化钠/柠檬酸钠) 中以及55℃下的50％甲酰胺中，随后由55℃下的含有EDTA的0.1xSSC组成的高严格度洗涤。适当地，条件使得彼此至少约65％、70％、75％、85％、 90％、95％、98％或99％同源的序列通常保持彼此杂交。
“中等严格条件”使用洗涤溶液和较不严格的杂交条件，使得多核苷酸将与多核苷酸的整体，片段、衍生物或类似物杂交。一个实例包含在55℃下在6xSSC、5x邓波特溶液、0.5％SDS以及100μg/mL变性鲑鱼精子DNA 中杂交，随后在37℃下在1xSSC、0.1％SDS中一次或多次洗涤。可以调整温度、离子强度等来适应实验因素，例如探针长度。其他中等严格条件已经进行了描述(参见Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，第 1-3卷，John Wiley&Sons,Inc.,Hoboken,N.J.(1993)；Kriegler,Gene Transfer andExpression:A Laboratory Manual,Stockton Press,New York,N.Y.(1990)； Perbal,APractical Guide to Molecular Cloning，第2版，John Wiley&Sons, New York,N.Y.(1988))。
“低严格条件”使用洗涤溶液和不如中等严格性的较不严格的杂交条件，使得多核苷酸将与多核苷酸的整体，片段、衍生物或类似物杂交。低严格性杂交条件的非限制性实例包括在35％甲酰胺、5xSSC、50mM Tris HCl(pH 7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.2％BSA、100μg/mL变性鲑鱼精子DNA、10％(重量/体积)硫酸葡聚糖在40℃下杂交，然后在2xSSC、25mM Tris HCl(pH 7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS中在50℃下洗涤一次或多次。低严格性的其他条件(诸如跨物种杂交的条件)已进行了充分描述(参见Ausubel等人，1993；Kriegler，1990)。
术语“植物”指处于其生命周期或发育的任何阶段的任何植物及其后代。在一个实施方案中，植物是烟草植物，它指的是属于烟草属的植物。该术语包括提及的完整植物、植物器官、植物组织、植物繁殖体、植物种子、植物细胞及其后代。植物细胞包括(但不限于)来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶子、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉以及花粉粒的细胞。本文描述了烟草植物的合适的种类、栽培种、杂种和品种。本领域技术人员将理解，可以根据本公开使用可获自或可源自植物的多种材料，包括幼苗、种子、植物、植物部分、植物细胞、植物组织、收获的植物材料或熟化的植物材料，或者它们中的两种或更多种的组合。在某些实施方案中，植物材料来源于不育杂种，诸如不育烟草杂种。不育杂种可以是(农民)田间的不育杂种作物的形式，诸如(农民)田间的不育杂种烟草作物。在某些实施方案中，植物材料并非来源于近交系(诸如植物作物的近交系)。因此，本公开可能无法用于对杂种种子进行分类。所以，不需要筛选近交系的育性恢复系版本与不育版本。“多核苷酸”、“多核苷酸序列”或“多核苷酸片段”在本文中可互换使用，并且是指单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以其5'单磷酸酯形式存在)由其如下的单字母名称指代："A"针对腺苷酸或脱氧腺苷酸 (分别针对RNA或DNA)，"C"针对胞苷酸或脱氧胞苷酸，"G"针对鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，"U"针对尿苷酸，"T"针对脱氧胸苷酸，"R"针对嘌呤(A或G)， "Y"针对嘧啶(C或T)，"K"针对G或T，"H"针对A或C或T，"I"针对肌苷并且"N"针对任何核苷酸。多核苷酸可以是(但不限于)基因组DNA、互补DNA(cDNA)、mRNA或反义RNA或其片段。此外，多核苷酸可以是单链或双链的、单链和双链区的混合物、包括DNA和RNA的杂交分子或具有单链和双链区的混合物的杂交分子或其片段。另外，多核苷酸可以由包括 DNA、RNA或两者的三链区或者其片段构成。多核苷酸可以含有一个或多个经修饰的碱基，诸如硫代磷酸酯，并且可以是肽多核苷酸(PNA)。一般来说，多核苷酸可以由分离的或克隆的cDNA片段、基因组DNA、寡核苷酸或个别核苷酸或前述的组合组装。尽管本文描述的多核苷酸显示为DNA 序列，但是多核苷酸包括其相应的RNA序列以及它们的互补(例如，完全互补)的DNA或RNA序列，包括其反向互补物。示例性多核苷酸在所附序列表中列出。
“靶多核苷酸序列”是指待扩增和/或检测的多核苷酸序列，其在本公开的上下文中可以是多核苷酸序列，诸如与不育性相关联的基因间间隔区(例如，与不育性相关联的叶绿体或线粒体基因间间隔区)。靶多核苷酸序列是指待扩增的多核苷酸序列和任何互补的第二链。靶多核苷酸序列可以是单链或双链的，使得一条或两条链可以结合到扩增引物。本文所述的扩增引物被设计成退火到与不育性相关联的基因间间隔区(例如，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区)的区域。
术语“烟草”在总体意义上用于指烟草作物(例如，在田间生长的多种烟草植物而不是水培生长的烟草)、烟草植物及其部分，包括但不限于如本文所述制备和/或获得的根、茎、叶、花和种子。应当理解，烟草是指烟草植物及其产品。
术语“烟草产品”是指消费者烟草产品，包括但不限于吸烟材料(例如，香烟、雪茄和烟斗烟草)、鼻烟、嚼用烟草、口香糖和锭剂，以及用于制造消费者烟草产品的组分、材料和成分。适宜地，这些烟草产品由从烟草收获的烟草的叶和茎制造，并且根据烟草制备中的常规技术对其进行切割、干燥、熟化和/或发酵。
关于多核苷酸的“变体”是指：(i)多核苷酸的一部分或片段；(ii)多核苷酸或其部分的互补物；(iii)与目的多核苷酸或其互补物基本上相同的多核苷酸；或(iv)在严格条件下与目的多核苷酸、其互补物或与其基本上相同的多核苷酸杂交的多核苷酸。设想了本文所述的多核苷酸的变体。
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学与技术术语将具有所属领域普通技术人员通常所理解的含义。例如，与分子生物学、微生物学、植物生物学、遗传学、多核苷酸化学和杂交相关使用的任何命名法以及它们的技术是本领域熟知和常用的那些。术语的含义和范围应该明确；然而在具有任何潜在不明确性的事件中，本文提供的定义优先于任何词典或外来定义。另外，除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
雄性不育
将雄性不育引入植物中的几种来源是可获得的，并且已经例如通过经由回交将植物基因组转移到相同属的异源物种的细胞质中而产生。细胞质雄性不育性(CMS)是用于植物品种保护和用于杂交生产的一种有利机制。在某些植物(诸如烟草)中，不需要育性恢复系统，因为感兴趣的产品是叶子，而不是像其他作物中那样是种子。
CMS是抑制功能性花粉粒产生的母本遗传性状。它已为人所知100多年，并且在超过150种植物物种中已有报道。CMS表型是由细胞核基因组和细胞质基因组的不相容性引起的，代表了杂种种子生产中的一种有价值的工具。
烟草属细胞质的CMS来源包括来自香甜烟草、粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草和波叶烟草的细胞质。CMS细胞质可以改变生长速率或熟化叶片的化学性质，但却不一定影响产量或叶片质量。
CMS可以以各种方式引入植物中。例如，如果育种或选择已完成并且固定的转化品系是可获得的，那么一种选择是将这些品系与同一品系的不育版本回交。在第一代回交(BC1)之后，转化的性状/基因对于所有种子都将是杂合的。该品系与第一代雄性不育子代的第二次回交(BC2)就1个基因而言将产生具有期望的转化性状的不育优良品系的1/2，就2个基因而言将产生具有期望的转化性状的不育优良品系的1/4，以此类推。BC2品系可以通过每次添加来自可育的转化优良亲本的花粉来维持。这2代(或3代，以产生足够的种子)的时间选择通常为1年至1.5年。在这种情况下，不需要使用分子标志物或标志物辅助选择。
另一方面，如果正在进行优良品系的转化，则可以将标志物辅助选择项目的BC1或BC2植物与CMS优良品种杂交。这允许平行地开发相同品种的不育版本和可育版本，并且由于不育对应物总是通过与可育转化品系回交来维持，所以随着世代的发展，与转化品系相比，它在遗传上将越来越接近。在这种情形下，CMS和转化的优良品系可以几乎同时准备就绪。预期CMS 转化品系的可用性可能延迟6个月。
某些地理区域倾向于拥有它们自己优选的CMS遗传来源。例如，在白肋烟地理区域中，CMS标准往往是香甜烟草CMS来源。在烤烟地理区域中，它往往是粉蓝烟草CMS来源。在东方烟地理区域中，它往往是可育的普通烟草，因此不使用不育来源。
根据本公开，使用一种或多种(适宜地，两种或更多种)扩增引物从两种或更多种植物物种或品种(诸如烟草属物种)扩增与不育性相关联的一种或多种多核苷酸序列。与不育性相关联的相同的一种或多种多核苷酸序列通常从两种或更多种植物物种或品种扩增。在一个实施方案中，与来自植物物种或品种的不育性相关联的一种或多种多核苷酸序列是与不育性相关联的基因间间隔区序列。在一个实施方案中，与不育性相关联的一种或多种多核苷酸序列是与CMS相关联的一种或多种多核苷酸序列。在一个实施方案中，与不育性相关联的一种或多种多核苷酸序列是与CMS相关联的基因间间隔区序列。本文描述了与不育性相关联的其他序列。基于该分析的结果，可以易于确定某批次或分批的植物材料是否受污染或掺杂，或者某批次或分批的植物材料是否未受污染或未掺杂。
与不育性相关联的多核苷酸序列
根据本公开，在本公开中使用的与不育性相关联的(诸如与CMS相关联的)一种或多种多核苷酸序列将需要存在于植物的各种物种或品种中。扩增的一种或多种多核苷酸序列的大小或序列在各种物种或品种的每一者中将需要可检测地不同，使得可以检测大小或序列的差异。换句话讲，所述一种或多种多核苷酸序列在植物物种或品种之间将需要是多态性的。例如，可以使用来自叶绿体或线粒体的任何一种或多种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在植物物种(诸如普通烟草、香甜烟草和粉蓝烟草)之间是多态性的。此类一种或多种多态性序列可以通过例如对植物物种的细胞器测序来容易地鉴定。在某些实施方案中，使用叶绿体或线粒体基因间序列，因为基因间序列中的多态性通常比基因中的多态性更大。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的一种或多种多核苷酸序列来自香甜烟草、粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草。在一个实施方案中，与不育性相关联的多核苷酸序列是与不育性相关联的基因间间隔区。
在一个实施方案中，与不育性相关联的基因间间隔区是与不育性相关联的叶绿体或线粒体基因间间隔区。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的基因间间隔区是与香甜烟草、粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草相关联的叶绿体基因间间隔区。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的基因间间隔区是与香甜烟草、粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草相关联的线粒体基因间间隔区。在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是trnH-psbA基因间间隔区序列(GenBank登录号FJ493313.1)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。来自普通烟草的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区由SEQ ID NO:1示出。来自普通烟草的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的扩增部分的实例由SEQ ID NO:2示出。示例性的正向扩增引物序列和反向扩增引物序列分别由SEQ ID No:3和SEQ ID No:4示出。本领域技术人员将易于理解，以SEQID NO:2示出的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的扩增部分仅仅是一个实例，并且可以容忍该扩增部分的序列中的变化。重要的考虑因素是，选择要扩增的片段在其他植物物种中可以具有不同的大小或序列。在以SEQ ID NO:2示出的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的扩增部分的上下文中，来自普通烟草的扩增部分预期为约483bp。来自香甜烟草的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的扩增部分预期为约477bp。来自粉蓝烟草的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的扩增部分预期为约467bp。因此，来自每个物种的扩增部分的大小是不同的，这允许将扩增片段的大小或序列用作标志物，以鉴定叶绿体基因间间隔区来源于哪个植物物种。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 trnL-trnF叶绿体基因间间隔区。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。来自普通烟草的trnL-trnF叶绿体基因间间隔区由SEQ ID NO:5示出。来自粉蓝烟草的对应序列以Genbank登录号AJ577414公开。来自香甜烟草的对应序列以Genbank登录号AJ577410公开。来自普通烟草的trnL-trnF叶绿体基因间间隔区的扩增部分的实例由SEQ ID NO:6示出。示例性的正向扩增引物序列和反向扩增引物序列分别由SEQ ID No:7和SEQ ID No:8示出。由于与上述相同的原因，扩增部分的序列和扩增引物的序列仅是示例性的。来自普通烟草的trnL-trnF叶绿体基因间间隔区的扩增部分预期为约483bp。来自香甜烟草的trnL-trnF叶绿体基因间间隔区的扩增部分预期为约477bp。来自粉蓝烟草的trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的扩增部分预期为约467 bp。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是atpH-atpI叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank登录号：KU199713.1)的核苷酸14192-15350)。这种叶绿体基因间间隔区与 CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 ndhC-trnV叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸52761-53848)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 petA-psbJ叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank登录号：KU199713.1)的核苷酸65390-66456)。这种叶绿体基因间间隔区与 CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 petN-psbM叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸29720-30853)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 psbE-petL叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸67222-68386)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 psbM-trnD叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸30957-32028)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 rbc1-accD叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸59121-59886)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 rpoD-trnC叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸27604-28889)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 rps16-trnQ叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸6302-7508)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 trnS-trnG叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank登录号：KU199713.1)的核苷酸8811-9591)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS 相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 trnT-psbD叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸33345-34563)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是 trnW-psaJ叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸68981-69658)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS相关联。
在另一个实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区是ycf1叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank登录号： KU199713.1)的核苷酸125979-131687)。这种叶绿体基因间间隔区与CMS 相关联。
在某些实施方案中，与不育性相关联的叶绿体基因间间隔区不是 TrnH-TrnK叶绿体基因间间隔区(普通烟草栽培品种TN90质体(GenBank 登录号：KU199713.1)的核苷酸168-1900)。
扩增
根据本公开，提供了来自某批次或分批的植物材料的多核苷酸样品用于分析。植物材料可以是例如幼苗、种子、植物、植物部分、收获的植物材料或熟化的植物材料，或者它们中的两种或更多种的组合。适宜地，植物材料是不育杂种植物材料。更适宜地，植物材料是不育杂种烟草材料。
使多核苷酸样品与能够扩增与不育性相关联的靶多核苷酸序列的一种或多种扩增引物接触。然后对样品进行体外多核苷酸扩增反应，以生成扩增产物。
在本公开中使用的扩增方法是本领域熟知的，并且包括例如复制酶介导的扩增、聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增 (SDA)、嗜热性链置换扩增(tSDA)、自动维持序列复制(3SR)、转录介导的或转录相关的扩增(TMA)、基于多核苷酸序列的扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)。此类扩增方法是本领域熟知的，并且易于根据本公开使用。扩增技术可以是等温的并且在恒定温度下进行，也可以是需要在高温与低温之间循环的热技术。在某些实施方案中，使用PCR是优选的。
对于要进行的体外多核苷酸扩增反应，需要使用一种或多种，适宜地，两种或更多种扩增引物。扩增引物的设计可以针对每种扩增方法进行优化。由于不需要特殊的序列或结构来驱动扩增反应，因此用于PCR的扩增引物可以仅由模板结合序列组成。然而，其他扩增反应可能需要除了靶结合序列之外的更专门的核苷酸序列，以便反应继续进行。例如，在SDA测定中使用的扩增引物还包含位于靶结合序列5'端的限制性核酸内切酶识别位点。扩增引物还可以包含3'-OH基团，当扩增引物的模板结合序列退火到靶多核苷酸序列时，该基团能够通过DNA聚合酶延伸。相比之下，用于3SR和NASBA 的扩增引物在5'端附近包含RNA聚合酶启动子。该启动子附加到靶结合序列，并且用来通过指导模板的多个RNA拷贝的转录来驱动扩增反应。特定的扩增反应所必需的除了靶结合序列之外的此类序列在本领域中是熟知的。
在设计用于本公开的扩增引物时，将考虑本领域中已知的一般问题。例如，当使用包含大量GC重复序列和AT重复序列的靶多核苷酸序列设计引物时，应注意将潜在的二聚体相互作用减至最小，以避免引物自杂交。通常应避免可以与其自身形成四个或更多个连续键或者与其他引物形成八个或更多个链间键的引物。尤其应避免可以形成3'二聚体的引物，因为在该引物的3'端杂交，即使是暂时杂交，由于聚合酶作用和引物破坏，也将导致引物延伸。可以在引物设计中使用某些计算机软件程序来避免这些问题。还筛选了引物组合以获得最佳条件。
如本领域已知的，互补和部分互补的多核苷酸序列的退火或杂交也可以通过调节反应条件以增加或降低严格性(例如，调节缓冲液的温度或盐含量) 来获得。
描述了包含与待扩增的靶多核苷酸序列互补的约10个或更多个连续多核苷酸的多核苷酸扩增引物。这些引物可以包含约15、20、25、30、40、45 或50个更多的连续多核苷酸或者由其组成，所述连续多核苷酸与本文所述的一种或多种靶多核苷酸序列杂交(例如，特异性杂交)。在一些实施方案中，这些引物可以包含约10至50个连续核苷酸、约10至40个连续核苷酸、约10至30个连续核苷酸或者约15至30个连续核苷酸，或者由其组成。所述一种或多种扩增引物可以被设计并且用于扩增或检测部分或全部靶多核苷酸序列。举具体的实例来说，可以在PCR方案中使用两种扩增引物来扩增靶多核苷酸序列。PCR也可以使用来源于多核苷酸序列的一种引物和与多核苷酸序列上游或下游序列杂交的第二种引物进行，所述多核苷酸序列诸如启动子序列、mRNA前体的3'端或来源于载体的序列。因此，在一些实施方案中，使用一对扩增引物，它们中的每一者退火到双链靶多核苷酸序列的两条链中的一条。在这种情况下，扩增是指数级的，因为正义链和反义链在后续轮次的扩增中均充当相对引物的模板。当使用单个扩增引物时，扩增是线性的，因为只有一条链充当引物延伸的模板。
本文所述的扩增引物可以与其靶多核苷酸序列100％互补。然而，基于上述的引物设计条件，引物和探针可以与靶多核苷酸序列结合，即使它们与这些区域的互补性小于100％。必需的互补程度取决于多种因素，包括结合条件的严格性。取决于所采用的严格条件，这些扩增引物可以被修饰以在其序列中包括不同的碱基，并且仍然充分互补以结合到靶区域。如本文所用，充分互补包括70％或更高的互补性。在优选的实施方案中，这些扩增引物与其靶多核苷酸序列的互补性在扩增引物的结合部分的长度上至少为80％。更优选地，这些扩增引物与其靶多核苷酸序列的互补性为90％或更高。
适宜地，如本文所述，根据本公开的扩增引物被设计成特异性扩增与不育性相关联的多核苷酸序列。适宜地，这些扩增引物被设计成使得它们相对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有至少90％、95％或100％的互补性。
设计在本公开中使用的扩增引物时，重要的是将它们设计成使得可以从多于一种不同的植物物种或品种扩增与不育性相关联的靶多核苷酸序列。因此，所述一种或多种扩增引物的序列将与来自多于一种不同的植物物种或品种的与不育性相关联的多核苷酸序列至少90％、95％或100％互补。设计在本公开中使用的扩增引物时，同样重要的是将它们设计成使得被扩增的序列在从每个不同的植物物种或品种扩增时将具有不同的大小或序列。因此，在一个实施方案中，扩增引物被配置为扩增烟草属内的多态性序列。因此，然后可以将扩增产物的大小或序列用作标志物，以便破译扩增产物来源于哪个植物物种或品种。扩增产物的大小通常被设计成500个碱基对或更小，适宜地，400个碱基对或更小，适宜地，300个碱基对或更小，或者适宜地，200 个碱基对或更小。
根据本公开的一个实施方案，使用叶绿体或线粒体基因间间隔区可以是有利的，因为高等植物中的叶绿体或线粒体基因组高度保守，这对于遗传研究具有一些实际意义。因此，可以基于叶绿体或线粒体DNA的保守编码序列来设计通用PCR引物对，以扩增来自不同植物物种的DNA。
适宜地，不需要限制性内切酶消化步骤来区分一种或多种扩增产物。这可以使得该方法更快更简单。
生成的扩增产物可以通过本领域已知的任何方法来检测。扩增产物可以通过使用常规技术与标记的探针杂交来检测，例如，在位于扩增引物之间的序列处与扩增的多核苷酸杂交的一种技术。期望地，扩增产物通过其大小或其序列来检测，如下文更全面地讨论的。
适宜地，在确定扩增产物的大小和/或序列之前，不对扩增产物进行任何处理就直接分析扩增产物。因此，例如，在确定扩增产物的大小和/或序列之前，不消化(例如，用限制性核酸内切酶)扩增产物。有利地，这使得该方法更快更简单。
用于确定扩增产物的序列的方法
扩增的序列在序列上可以有至少1个核苷酸、至少2个核苷酸、至少3 个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸或至少10个核苷酸的差异。适宜地，扩增的序列在序列上可以有至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少 7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸或至少10个核苷酸的差异。适宜地，扩增的序列在序列上可以有至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸或至少50个核苷酸的差异。
本领域有各种方法可用于测定扩增产物的序列。本领域有各种方法可用于确定扩增产物中一种或多种多态性的存在，包括确定一种或多种单核苷酸多态性的存在或不存在。此类方法包括扩增产物的直接测序、扩增产物多态性测定、多核苷酸杂交测定和基于计算机的方法。商业上可获得的方法，用于执行这些方法的试剂盒或服务是广泛可获得的，并且是技术人员熟知的。
对于直接测序方法，使用任何合适的方法对扩增产物进行测序(诸如手动测序或自动测序)，其中测定扩增产物的核苷酸序列。为了测定扩增产物的序列，首先使多核苷酸样品经历测序反应(诸如Sanger双脱氧测序)。该方法依赖于在模板指导下核苷酸通过DNA聚合酶从含有脱氧核苷酸和双脱氧核苷酸的混合物掺入到退火的引物上。由于酶不能催化链的进一步延伸，因此双脱氧核苷酸的掺入导致链终止。反应产物的分离导致延伸产物的“阶梯”，其中每个延伸产物终止于与模板中同其相对的核苷酸互补的特定双脱氧核苷酸。延伸产物可以以几种方式检测，包括例如在反应中包含荧光标记的引物、脱氧核苷酸三磷酸或双脱氧核苷酸三磷酸。然后可以通过多种手段 (最通常地通过毛细管凝胶电泳和/或聚丙烯酰胺凝胶电泳等)来分析测序反应产物。
一种或多种多态性也可以使用多核苷酸扩增测定来确定，其中寡核苷酸引物被设计成特异性地扩增含有一种或多种多态性的片段。
一种或多种多态性也可以使用片段长度多态性测定来检测，其中使用酶(诸如限制性核酸内切酶)生成基于在一系列位置处切割DNA的独特DNA 带型。来自含有一种或多种多态性的样品的DNA片段将具有与野生型序列不同的带型。
一种或多种多态性也可以通过片段大小分析来检测。
一种或多种多态性也可以使用限制性片段长度多态性测定(RPLP)来检测。首先使用PCR将感兴趣的区域分离。然后用已知用于产生独特长度片段以提供给定多态性的限制性内切酶切割PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳将限制性内切酶消化的PCR产物分离，并且通过溴化乙锭染色或本领域已知的其他方法可视化，然后与对照(诸如野生型)进行比较。
一种或多种多态性也可以使用切割酶片段长度多态性测定来检测，如例如US 5,888,750中所述。
一种或多种多态性也可以使用杂交测定来检测，其中多态性的存在或不存在是基于来自样品的DNA与互补DNA分子(诸如寡核苷酸探针)杂交的能力来确定的。多种杂交测定是可用的。杂交的多核苷酸可以使用附接到样品多核苷酸的一种或多种标记来检测。这些标记可以通过本领域技术人员熟知的多种手段中的任一种来掺入。
一种或多种多态性也可以使用DNA芯片杂交测定来检测，其中将一系列寡核苷酸探针附连到固体载体。这些寡核苷酸探针被设计成对于给定的单核苷酸多态性而言是独特的。使感兴趣的DNA样品与DNA芯片接触并且检测杂交(参见例如US 6,045,996)。可以对扩增产物进行标记并且与阵列一起温育，然后插入扫描仪中，在其中可以检测和收集杂交的模式。由于每个探针在阵列上的序列和位置是已知的，因此可以确定施加于探针阵列的靶多核苷酸的身份。
如US 6,068,818中所述，可以使用含有电子捕获探针的DNA微芯片来检测一种或多种多态性。
如WO00/39587中所述，也可以使用用于检测多态性的微珠阵列来检测一种或多种多态性。
用于确定扩增产物的大小的方法
扩增的一种或多种多核苷酸的大小差异可以是至少1个核苷酸、至少2 个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸或至少10个核苷酸。适宜地，扩增的一种或多种多核苷酸的大小差异可以是至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸或至少10个核苷酸。适宜地，扩增的一种或多种多核苷酸的大小差异可以是至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸或至少50个核苷酸。
扩增的多核苷酸可以使用本领域熟知的方法基于大小来分析，这些方法诸如凝胶电泳、阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱、脉冲场电泳、筛分凝胶电泳、毛细管电泳或Southern分析。
凝胶电泳是一种经常用于基于大小分离多核苷酸分子的技术。该凝胶通常由海藻多糖琼脂糖组成，或者为了分离较小的核片段，可以使用聚丙烯酰胺凝胶。为了分析，将多核苷酸样品放入凝胶中形成的孔中，并且施加电场。多核苷酸的负电荷将导致多核苷酸通过凝胶向正极迁移。凝胶的组成改变了分子的迁移速度，因此实现了分离。本文设想的凝胶电泳的变化包括脉冲场凝胶电泳和筛分琼脂糖凝胶电泳。
另一种可能有用的分析规程是通过Southern分析对扩增的核片段进行分析。
在一个优选的实施方案中，通过毛细管凝胶电泳分析扩增的多核苷酸。毛细管的物理特性对于解析样品中的感兴趣组分很重要，并且通常内径小于 100μm，长度为20cm至100cm，尽管毛细管不必限于这些尺寸。可以使用各种聚合物网络，包括那些由纤维素材料、聚环氧乙烷、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素或甲基纤维素组成的网络。聚合物网络通常悬浮在生物缓冲液中。可以通过各种技术(诸如电动进样或流体动力进样)将样品引入毛细管的入口中。
对一批植物材料进行分类
基于根据本公开执行的分析结果，一批植物材料可以被分类为受污染的或掺杂的，或者未受污染的或未掺杂的。适宜地，植物材料被分类为由不同来源的植物材料污染的或掺杂的，或者未由不同来源的植物材料污染的或掺杂的。不同来源的植物材料可以是预期可育的植物材料，或缺乏预期的不育性来源的植物材料，或具有明显不同的不育性遗传来源的植物材料。
通常，在执行该方法或分析之前，某批次或分批的植物材料的育性状态会是已知的。一般来讲，准备的烟草材料(诸如种子或幼苗)通常以非可育形式出售，而且准备的烟草种子的这种不育性的遗传来源会是已知的。烟草的种子或幼苗也可以以可育形式出售。例如，在白肋烟地理区域中，CMS 标准往往是香甜烟草CMS来源。在烤烟地理区域中，它往往是粉蓝烟草CMS 来源。在东方烟地理区域中，它往往是可育的普通烟草，因此不使用不育来源。
因此，举例来说，在商业上供应的烟草种子中的不育来源可以是来自香甜烟草细胞质的CMS。根据本公开的方法，一旦已确定了与来自这批植物材料的不育性相关联的一种或多种多核苷酸的扩增的一种或多种靶多核苷酸序列的大小或序列，就可以将其与来自已知不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较。然后，根据该步骤的结果，如果不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源相对应，则认为这批植物材料是未受污染的或未掺杂的。如果不育性遗传来源与这批植物材料的不育性遗传来源不对应，则认为这批植物材料是受污染的或掺杂的。如果发现这批植物材料是未受污染的或未掺杂的，那么可以预期该植物材料免于污染，并且由其衍生的植物材料将具有预期的质量或纯度。如果发现这批植物材料是受污染的或掺杂的，则可以预期该植物材料已经被来自其他来源的植物材料污染，并且由其衍生的植物材料将不具有预期的质量或纯度。在这种情况下，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
举另外的实例来说，一批供试的植物材料可以具有来自香甜烟草细胞质的CMS不育性来源。从该植物材料提取多核苷酸样品，并且扩增与CMS 相关联的细胞质基因间间隔区的一种或多种靶多核苷酸序列。确定一种或多种扩增产物的大小或序列，并且基于所述一种或多种扩增产物的大小或序列，通过将扩增产物的大小或序列与来自与CMS相关联的相同细胞质基因间间隔区的扩增产物的大小或序列进行比较，鉴定不育性遗传来源。因此，在该实例的上下文中，一种或多种扩增产物的大小或序列将与来自烟草中使用的已知CMS不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列仅与来自香甜烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，则可以确定植物材料是未受污染的或未掺杂的。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列与来自香甜烟草细胞质的CMS不育性来源不对应，则可以确定植物材料是受污染的或掺杂的。因此，例如，一种或多种扩增产物的大小或序列可以与来自粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，或者扩增产物的大小或序列可以与普通烟草细胞质相对应，从而表明存在可育烟草材料。在该实例中，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
举另外的实例来说，一批供试的植物材料可以具有来自粉蓝烟草细胞质的CMS不育性。从该植物材料提取多核苷酸样品，并且扩增与CMS相关联的细胞质基因间间隔区的一种或多种靶多核苷酸序列。确定一种或多种扩增产物的大小或序列，并且基于所述一种或多种扩增产物的大小或序列，通过将所述一种或多种扩增产物的大小或序列与来自与CMS相关联的相同细胞质基因间间隔区的扩增产物的大小或序列进行比较，鉴定不育性遗传来源。因此，在该实例的上下文中，一种或多种扩增产物的大小或序列将与来自烟草中使用的已知CMS不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列仅与来自粉蓝烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，则可以确定植物材料是未受污染的或未掺杂的。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列与来自粉蓝烟草细胞质的CMS不育性来源不对应，则可以确定植物材料是受污染的或掺杂的。因此，例如，一种或多种扩增产物的大小或序列可以与来自香甜烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，或者一种或多种扩增产物的大小或序列可以与普通烟草细胞质相对应，从而表明存在可育烟草材料。在该实例中，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
举另外的实例来说，一批供试的植物材料可以是可育的普通烟草。从该植物材料提取多核苷酸样品，并且扩增与CMS相关联的细胞质基因间间隔区的一种或多种靶多核苷酸序列。确定一种或多种扩增产物的大小或序列，并且基于所述一种或多种扩增产物的大小或序列，通过将所述一种或多种扩增产物的大小或序列与来自与CMS相关联的相同细胞质基因间间隔区的扩增产物的大小或序列进行比较，鉴定不育性遗传来源。在该实例中，将预期在未受污染的或未掺杂的植物材料中将不会获得扩增产物，这是因为该植物材料不具有CMS遗传来源。如果从扩增步骤确定不存在扩增产物，则可以确定植物材料是未受污染的或未掺杂的。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物获自CMS不育性来源，则可以确定植物材料是受污染的或掺杂的。在该实例中，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
还公开了一种用于将一批植物材料分类为受污染或未受污染的方法，包括使用一种或多种对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有特异性的扩增引物。
还公开了两种或更多种对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有特异性的扩增引物用于将一批植物材料分类为受污染或未受污染的用途。
可以获得多种扩增产物，这指示样品中存在多种不同的不育性遗传来源。通常，这将指示污染或掺杂。
确定合格性
基于根据本公开执行的分析的结果，可以确定某批次或分批的植物材料的合格性。在确定某批次或分批的植物材料的合格性时，可以确定该批次或分批的植物材料是否符合标准。例如，某些地理区域具有标准化的CMS遗传来源。例如，在白肋烟地理区域中，CMS标准往往是香甜烟草CMS来源。在烤烟地理区域中，CMS标准往往是粉蓝烟草CMS来源。在东方烟地理区域中，CMS标准往往是可育的普通烟草，因此不使用不育来源。因此，在另一方面，提供了用于检查一批植物材料的合格性的方法，包括：(i)由这批植物材料提供多核苷酸样品；(ii)使多核苷酸样品与扩增引物接触，以扩增与不育性相关联的一种或多种靶多核苷酸序列；(iii)对该样品执行体外多核苷酸扩增反应，以生成一种或多种扩增产物；(iv)确定一种或多种扩增产物的大小或序列；以及(v)基于在步骤(iv)中确定的扩增产物的大小或序列，将所述一种或多种扩增产物的大小或序列与来自已知不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较；其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源相对应，则认为这批植物材料是合格的；或者其中如果步骤(v)中确定的不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源不对应，则认为这批植物材料是不合格的。
根据该方法，一旦已确定了与来自这批植物材料的不育性相关联的扩增的一种或多种靶多核苷酸序列的大小或序列，就可以将其与来自已知不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较。然后，根据该步骤的结果，如果不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源相对应，则认为这批植物材料是合格的(例如，未掺杂的)。如果不育性遗传来源与这批植物材料的预期的不育性遗传来源不对应，则认为这批植物材料是不合格的 (例如，掺杂的)。如果发现这批植物材料是合格的，则可以预期该植物材料免于污染或掺杂，并且由其衍生的植物材料将具有预期的质量或纯度。如果发现这批植物材料是不合格的或掺杂的，则可以预期该植物材料已经被来自其他来源的植物材料污染，并且由其衍生的植物材料将不具有预期的质量或纯度。在这种情况下，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
举例来说，一批供试的植物材料可以具有来自香甜烟草细胞质的预期的 CMS遗传来源。从该植物材料提取多核苷酸样品，并且扩增与CMS相关联的细胞质基因间间隔区的一种或多种靶多核苷酸序列。确定一种或多种扩增产物的大小或序列，并且基于扩增产物的大小或序列，通过将所述一种或多种扩增产物的大小或序列与来自与CMS相关联的相同细胞质基因间间隔区的扩增产物的大小或序列进行比较，鉴定不育性遗传来源。因此，在该实例的上下文中，一种或多种扩增产物的大小或序列将与来自烟草中使用的已知 CMS不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列仅与来自香甜烟草细胞质的 CMS不育性来源相对应，则可以确定植物材料是合格的或未掺杂的。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列与来自香甜烟草细胞质的CMS不育性来源不对应，则可以确定植物材料是不合格的或掺杂的。因此，例如，一种或多种扩增产物的大小或序列可以与来自粉蓝烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，或者一种或多种扩增产物的大小或序列可以与普通烟草细胞质相对应，从而表明存在可育烟草材料。在该实例中，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
举另外的实例来说，一批供试的植物材料可以具有来自粉蓝烟草细胞质的预期的CMS遗传来源。从该植物材料提取多核苷酸样品，并且扩增与CMS 相关联的细胞质基因间间隔区的一种或多种靶多核苷酸序列。确定一种或多种扩增产物的大小或序列，并且基于所述一种或多种扩增产物的大小或序列，通过将所述一种或多种扩增产物的大小或序列与来自与CMS相关联的相同细胞质基因间间隔区的扩增产物的大小或序列进行比较，鉴定不育性遗传来源。因此，在该实例的上下文中，一种或多种扩增产物的大小或序列将与来自烟草中使用的已知CMS不育性遗传来源的已知扩增产物的大小或序列进行比较。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列仅与来自粉蓝烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，则可以确定植物材料是合格的或未掺杂的。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物的大小或序列与来自粉蓝烟草细胞质的CMS不育性来源不对应，则可以确定植物材料是不合格的或掺杂的。因此，例如，扩增产物的大小或序列可以与来自香甜烟草、印度烟草、皱叶烟草、麦格隆熄丰烟草或波叶烟草细胞质的CMS不育性来源相对应，或者扩增产物的大小或序列可以与普通烟草细胞质相对应，从而表明存在可育烟草材料。在该实例中，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
举另外的实例来说，一批供试的植物材料可以是可育的普通烟草。从该植物材料提取多核苷酸样品，并且扩增与CMS相关联的细胞质基因间间隔区的一种或多种靶多核苷酸序列。确定一种或多种扩增产物的大小或序列，并且基于所述一种或多种扩增产物的大小或序列，通过将扩增产物的大小或序列与来自与CMS相关联的相同细胞质基因间间隔区的扩增产物的大小或序列进行比较，鉴定不育性遗传来源。在该实例中，将预期在合格的植物材料中将不会获得扩增产物，这是因为该植物材料不具有CMS遗传来源。如果从扩增步骤确定不存在扩增产物，则可以确定植物材料是合格的。如果从扩增步骤确定一种或多种扩增产物获自CMS不育性来源，则可以确定植物材料是不合格的。在该实例中，由于无法保证该植物材料的质量或纯度，可能需要将其丢弃或销毁。
可以获得多种扩增产物，这指示样品中存在多种不同的不育性遗传来源。通常，这将指示污染或掺杂。
还公开了用于检查一批植物材料的合格性的方法，包括使用一种或多种对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有特异性的扩增引物。
还公开了两种或更多种对于与不育性相关联的多核苷酸序列具有特异性的扩增引物用于检查一批植物材料的合格性的用途。
植物
适合在本公开中使用的植物和由其衍生的植物材料包括单子叶植物和双子叶植物。合适的物种可以包括烟草属的成员，包括黄花烟草(N.rustica) 和普通烟草(N.tabacum)(例如，LA B21、LN KY171、TI 1406、Basma、 Galpao、Perique、Beinhart 1000-1和Petico)。其他物种包括无茎烟草(N. acaulis)、尖叶烟草(N.acuminata)、非洲烟草(N.africana)、花叶烟草 (N.alata)、阿米基诺氏烟草(N.ameghinoi)、抱茎烟草(N.amplexicaulis)、阿伦兹氏烟草(N.arentsii)、渐狭叶烟草(N.attenuata)、阿姆布吉烟草(N. azambujae)、贝纳莫特氏烟草(N.benavidesii)、本赛姆氏烟草(N. benthamiana)、印度烟草(N.bigelovii)、博内里烟草(N.bonariensis)、洞生烟草(N.cavicola)、克利夫兰氏烟草(N.clevelandii)、心叶烟草(N. cordifolia)、伞床烟草(N.corymbosa)、迪伯纳氏烟草(N.debneyi)、木丝烟草(N.excelsior)、福尔吉特氏烟草(N.forgetiana)、香烟草(N.fragrans)、粉蓝烟草(N.glauca)、粘烟草(N.glutinosa)、古特斯比氏烟草(N.goodspeedii)、哥西氏烟草(N.gossei)、杂交烟草(N.hybrid)、因古儿巴烟草(N.ingulba)、卡瓦卡米氏烟草(N.kawakamii)、奈特氏烟草(N. knightiana)、郎氏烟草(N.Iangsdorffii)、渐尖叶烟草(N.linearis)、长花烟草(N.Iongiflora)、海滨烟草(N.maritima)、特大管烟草(N. megalosiphon)、摩西氏烟草(N.miersii)、夜花烟草(N.noctiflora)、裸茎烟草(N.nudicaulis)、欧布斯特烟草(N.obtusifolia)、西方烟草(N.occidentalis)、西方亚种香芥烟草(N.occidentalis subsp.hesperis)、耳状烟草(N.otophora)、圆维烟草(N.paniculata)、少花烟草(N.pauciflora)、矮牵牛状烟草(N.petunioides)、蓝茉莉叶烟草(N.plumbaginifolia)、夸德瑞伍氏烟草(N.quadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(N.raimondii)、波缘烟草 (N.repanda)、莲座烟草(N.rosulata)、莲座亚种因古儿巴烟草(N.rosulata subsp.ingulba)、圆叶烟草(N.rotundifolia)、赛特氏烟草(N.setchellii)、拟似烟草(N.simulans)、前叶烟草(N.solanifolia)、斯佩格茨氏烟草(N. spegazzinii)、斯托可通氏烟草(N.stocktonii)、香甜烟草(N.suaveolens)、美花烟草(N.sylvestris)、拟穗状烟草(N.thyrsiflora)、绒毛烟草(N. tomentosa)、绒毛状烟草(N.tomentosiformis)、三角叶烟草(N.trigonophylla)、荫生烟草(N.umbratica)、波叶烟草(N.undulata)、颤毛烟草(N.velutina)、序叶烟草(N.wigandioides)和花烟草(N.x sanderae)。
在一个实施方案中，设想使用普通烟草品种。
普通烟草品种包括白肋烟型烟草、黑烟型烟草、烤烟型烟草和东方型烟草。品种或栽培品种的非限制性实例是：BD 64、CC 101、CC 200、CC 27、 CC 301、CC 400、CC 500、CC600、CC 700、CC 800、CC 900、Coker 176、 Coker 319、Coker 371Gold、Coker 48、CD 263、DF911、DT 538LC Galpao 烟草、GL 26H、GL 350、GL 600、GL 737、GL 939、GL 973、HB 04P、HB 04P LC、HB3307PLC、杂交403LC、杂交404LC、杂交501LC、K 149、K 326、K 346、K 358、K394、K 399、K 730、KDH 959、KT 200、KT204LC、 KY10、KY14、KY 160、KY 17、KY 171、KY907、KY907LC、KY14xL8 LC、 Little Crittenden、McNair 373、McNair 944、msKY 14×L8、窄叶Madole、窄叶Madole LC、NBH 98、N-126、N-777LC、N-7371LC、NC 100、NC 102、 NC2000、NC 291、NC 297、NC 299、NC 3、NC 4、NC 5、NC 6、NC7、 NC 606、NC 71、NC 72、NC 810、NC BH 129、NC 2002、Neal Smith Madole、 OXFORD 207、PD 7302LC、PD 7309LC、PD7312LC、'Perique'烟草、PVH03、 PVH09、PVH19、PVH50、PVH51、R 610、R 630、R7-11、R 7-12、RG 17、 RG 81、RG H51、RGH 4、RGH 51、RS 1410、Speight 168、Speight 172、 Speight179、Speight 210、Speight 220、Speight 225、Speight 227、Speight 234、 Speight G-28、Speight G-70、Speight H-6、Speight H20、Speight NF3、TI 1406、 TI 1269、TN 86、TN86LC、TN 90、TN 97、TN97LC、TN D94、TN D950、 TR(Tom Rosson)Madole、VA 309、VA359、AA 37-1、B 13P、Xanthi (Mitchell-Mor)、Bel-W3、79-615、Samsun Holmes NN、KTRDC 2号杂交 49、白肋21、KY 8959、KY 9、MD 609、PG 01、PG 04、PO1、PO2、PO3、 RG 11、RG 8、VA509、AS44、Banket A1、巴斯玛Drama B84/31、巴斯玛 I Zichna ZP4/B、巴斯玛Xanthi BX2A、Batek、Besuki Jember、C104、Coker 347、Criollo Misionero、Delcrest、Djebel 81、DVH 405、
本文还涵盖使用烟草栽培品种和优良烟草栽培品种。
消耗品
如本文所述进行测试的植物材料，特别是此类植物的叶片和中脉，可以掺入或用于制备各种消耗品，包括但不限于气溶胶形成材料、气溶胶形成装置、吸烟制品、可抽吸制品、无烟产品、医药或美容产品、静脉内制剂、片剂、粉末和烟草产品。气溶胶形成材料的实例包括烟草组合物、烟草、烟草提取物、烟丝、切丝填料、熟化的烟草、膨胀烟草、均质烟草、再造烟草和烟斗烟草。吸烟制品和可抽吸制品是气溶胶形成装置的类型。吸烟制品或可抽吸制品的实例包含香烟、小雪茄和雪茄。无烟产品的实例包括嚼烟和鼻烟。在某些气溶胶形成装置而不是燃烧中，烟草组合物或另一气溶胶形成材料被一个或多个电加热元件进行加热，以产生气溶胶。在另一类型的被加热的气溶胶形成装置中，通过将热量从可燃性燃料元件或热源转移到物理上分开的气溶胶形成材料来产生气溶胶，所述气溶胶形成材料可以位于热源内、热源周围或热源下游。无烟烟草产品和多种含烟草的气雾形成材料可包含任何形式的烟草，包括沉积在其他成分上、混合于其他成分中、由其他成分包围或以其他方式与其他成分组合的干燥颗粒、碎片、小颗粒、粉末或浆料，所述其他成分采取任何形式，例如絮片、膜、卡(tab)、泡沫或珠。如本文中所使用，术语“烟雾”用于描述由例如香烟等吸烟制品或通过燃烧气溶胶形成材料而产生的一类气溶胶。
被测试的植物材料可以是熟化的植物材料。熟化绿色烟叶的工艺是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于如本文所述的晾干、火烤熟化、烟道熟化和晒干。
还在以下实例中描述了本发明，提供所述实例以更详细地描述本发明。这些实例阐述目前设想用于进行本发明的优选模式，意图说明而不是限制本发明。
实施例
实施例1：用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的方法设计PCR引物来扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号FJ493313.1)。
SEQ ID NO:1—普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号FJ493313.1)。扩增引物的位置加下划线。
ACGGGAATTGAACCCGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTT GATCCACTTGGCTACATCCGCCCCCTCGCCTACTTACATTCCGTTTTTA CATTATTTAAATT
SEQ ID NO:2—普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号FJ493313.1)的扩增片段。扩增引物的位置加下划线。
SEQ ID NO:3—用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号FJ493313.1)的正向扩增引物
AGAAAACAAAAGATTCAAGTTCG(任选的5’修饰：AT550染料)
SEQ ID NO:4—用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号FJ493313.1)的反向扩增引物
GCAAGAAAATAACCTCTCCTTC
PCR在
用荧光染料标记正向引物，以执行毛细管电泳。
这些引物靶向trnH基因与psbA基因之间的基因间间隔区中的叶绿体 DNA。
使用了以下PCR反应循环：95℃10分钟；95℃1分钟，55℃1分钟和 72℃2分钟，共35个循环；然后72℃7分钟。在PCR反应之后，用下列物质在95℃下进行2分钟的变性步骤：1μLPCR产物和12μL变性混合物 (1950μL HiDi甲酰胺+50μL GeneScan 400HD ROX尺寸标准)。GeneScan 400HD ROX尺寸标准是Applied Biosystems的产品。
变性之后，在ABI 3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)上使用填充有POP7聚合物(Applied Biosystems)的36cm毛细管阵列运行片段电泳。
使用GeneMapper v5.0软件(Applied Biosystems)执行结果分析。对结果进行了两次独立的人工审核。普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区允许将普通烟草与香甜烟草和粉蓝烟草不育性来源区分开。
来自普通烟草的片段预期为约259bp。
来自香甜烟草的片段预期为约206bp。
来自粉蓝烟草的片段预期为约238bp。
实施例2：使用普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区分析烟草分批
普通烟草的烟草分批是从被提供了不育烟草杂种的种子的烟草农民那里获得的。从烟草分批提取多核苷酸，并且使用实施例1中所述的方法进行分析。
对各种烟草分批的测试揭示，这些烟草分批中的至少一个分批具有206 bp的普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区大小，从而表明该烟草分批含有香甜烟草细胞质并且仅来源于不育烟草杂种的种子。
对各种烟草分批的测试揭示，这些烟草分批中的至少一个分批具有238 bp的普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区大小，从而表明该烟草分批含有粉蓝烟草细胞质并且仅来源于不育烟草杂种的种子。
对各种烟草分批的测试揭示，这些烟草分批中的至少一个分批具有259 bp的普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区大小，从而表明该烟草分批含有普通烟草细胞质并且来源于可育烟草种子中的种子。该结果表明，不育烟草种子在供出售时与可育烟草材料发生了混合。
实施例3：用于扩增普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间区域的方法
设计PCR引物来扩增普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区(GenBank 登录号AH003085.2)。
SEQ ID NO:5—普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号AH003085.2)。扩增引物的位置加下划线。
TCAATGGTTCCAGTATAAATGAAAGAAAAAGAAAAAGGAATGAC ATCACAACGAGATCCTAATCTCAAAAAGAAAGGGGGATATGGCGAAA TCGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACT TACTAAGTGATCACTTTCAAATTCAGAGAAACCCTGGAATTAACAAA AATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTTTTCCGAAAACAAACAAAGG TTCAGAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTATTCTAA CAAATGGAGTTAAAT
SEQ ID NO:6—普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号AH003085.2)的扩增片段。扩增引物的位置加下划线。
SEQ ID NO:7—用于扩增普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号AH003085.2)的正向扩增引物
GCGTTGGTAGAGGAATCTTT(5’修饰：AT550染料)
SEQ ID NO:8—用于扩增普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号AH003085.2)的反向扩增引物
ATGGATTTGAGCGTAAATGG
PCR在
用荧光染料标记正向引物，以执行毛细管电泳。
这些引物靶向trnL基因与trnF基因之间的基因间间隔区中的叶绿体 DNA。
使用了以下PCR反应循环：95℃10分钟；95℃1分钟，55℃1分钟和 72℃2分钟，共35个循环；然后72℃7分钟。在PCR反应之后，用下列物质在95℃下进行2分钟的变性步骤：1μLPCR产物和12μL变性混合物 (1950μL HiDi甲酰胺+50μL GeneScan 400HD ROX尺寸标准)。GeneScan 400HD ROX尺寸标准是Applied Biosystems的产品。
变性之后，在ABI 3130xl遗传分析仪(Applied Biosystems)上使用填充有POP7聚合物(Applied Biosystems)的36cm毛细管阵列运行片段电泳。
使用GeneMapper v5.0软件(Applied Biosystems)执行结果分析。对结果进行了两次独立的人工审核。普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区允许将普通烟草与香甜烟草和粉蓝烟草不育性来源区分开。
来自普通烟草的片段预期为约483bp。
来自香甜烟草的片段预期为约477bp。
来自粉蓝烟草的片段预期为约467bp。
实施例4：使用普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区分析烟草分批
普通烟草的烟草分批是从被提供了不育烟草杂种的种子的烟草农民那里获得的。从烟草分批提取多核苷酸，并且使用实施例3中所述的方法进行分析。
对各种烟草分批的测试揭示，这些烟草分批中的至少一个分批具有477 bp的普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区大小，从而表明该烟草分批含有香甜烟草细胞质并且仅来源于不育烟草杂种的种子。
对各种烟草分批的测试揭示，这些烟草分批中的至少一个分批具有467 bp的普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区大小，从而表明该烟草分批含有粉蓝烟草细胞质并且仅来源于不育烟草杂种的种子。
对各种烟草分批的测试揭示，这些烟草分批中的至少一个分批具有483 bp的普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区大小，从而表明该烟草分批含有普通烟草细胞质并且来源于可育烟草种子中的种子。该结果表明，不育烟草种子在供出售时与可育烟草材料发生了混合。
实施例5—对烟草分批的进一步分析
普通烟草的烟草分批是从被提供了不育烟草杂种的种子的烟草农民那里获得的。从烟草分批提取多核苷酸，并且使用实施例1中所述的方法进行分析。来自普通烟草的片段预期为约259bp。来自香甜烟草的片段预期为约 206bp。来自粉蓝烟草的片段预期为约238bp。
对测试第一分批的响应是香甜烟草预期bin(色谱图左侧的灰色条)中 206bp的单峰。表现出该基因型的合并样品主要含有来自不育植物的叶。在该组中还包括在259bp处示出小的普通烟草信号(低于香甜烟草峰高的 30％)的样品，这可能与样品中低水平的污染或低水平的掺杂相关。
对测试第二分批的响应是普通烟草预期bin(色谱图右侧的灰色条)中在259bp处的单峰。表现出该基因型的合并样品主要含有来自可育植物的叶。在该组中还包括在206bp处示出小的香甜烟草信号(低于普通烟草峰高的30％)的样品，这可能与样品中低水平的污染或低水平的掺杂相关。
对测试第三分批的响应是香甜烟草中在206bp处的峰和普通烟草中在 259bp处的峰，这两个峰具有相似的峰高。表现出该基因型的合并样品含有几乎相等比例的不育材料和可育材料。
对测试第四分批测试品的响应是香甜烟草中在206bp处的峰和普通烟草中在259bp处的峰。然而，普通烟草bin中的峰高代表香甜烟草峰高的约 30％或更多。表现出该基因型的合并样品含有各种比例的不育材料和可育材料。在这种合并样品中，不育材料更为丰富，但是可育植物的比例却不可忽略。
任意地选择用于对该组中的样品进行分类的普通烟草峰高阈值。然而， DNA扩增的水平足够高，可以排除来自邻近样品的任何污染以及不育作物材料掺杂可育材料所带来的污染。
在本文中引用的或描述的任何出版物都提供了在本申请的提交日期之前公开的有关信息。本文中的陈述不应解释为承认发明人丧失先于这样的公开的资格。在上面的说明书中提及的所有出版物都通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的各种修改和变化对于所属领域的技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合特定优选实施方案来描述本发明，但应理解，如所要求的本发明不应不恰当地限于此类特定实施方案。实际上，细胞生物学、分子生物学和植物生物学或有关领域的技术人员显而易见的用于实现本发明的所描述模式的不同改进意图在以下权利要求书的范围内。
序列(以5’-3’方向示出)
SEQ ID NO:1普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区核苷酸序列 (GenBank登录号FJ493313.1)
ACGGGAATTGAACCCGCGCATGGTGGATTCACAATCCACTGCCTT GATCCACTTGGCTACATCCGCCCCCTCGCCTACTTACATTCCGTTTTTA CATTATTTAAATTAGAAAACAAAAGATTCAAGTTCGAATATAGCTCTTCTTTCTTATTTCAATGATATTATTATTTCAAAGATAAGAGATATTCAAA GATAAGAGATAAGAAGAAGTCAAAATTTGATTTTTTTTTTGGAAAAA AAAAATCAAAAAGATATAGTAACATTAGCAAGAAGAGAAACAAGTTC TATTTCTACAATTTTAAACAAATACAAAATCAAAATAGAATACTCAAT CATGAATAAATGCAAGAAAATAACCTCTCCTTCTTTTTCTATAATGTA AACAAAAAAGTCTATGTAAGTAAAATACTAGTAAATAAATAAAAAGA AAAAAAGAAAGGAGCAATAGCACCCTCTTGATAGAACAAGAAAATG ATTATTGCTCCTTTCTTTTCAAAACCTCCTATAGACTAGGCCAGGATCT TATCCATTTGTAGATGGAGCTTCGATAGCAGCTAGGTCTAGAGGGAAGTTGTGAGCATTACGTTCATGCATAAC
SEQ ID NO:2：普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号FJ493313.1)的扩增核苷酸序列
AGAAAACAAAAGATTCAAGTTCGAATATAGCTCTTCTTTCTTATT TCAATGATATTATTATTTCAAAGATAAGAGATATTCAAAGATAAGAG ATAAGAAGAAGTCAAAATTTGATTTTTTTTTTGGAAAAAAAAAATCAA AAAGATATAGTAACATTAGCAAGAAGAGAAACAAGTTCTATTTCTAC AATTTTAAACAAATACAAAATCAAAATAGAATACTCAATCATGAATA AATGCAAGAAAATAACCTCTCCTTC
SEQ ID NO:3:用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号FJ493313.1)的正向扩增引物
AGAAAACAAAAGATTCAAGTTCG
SEQ ID NO:4:用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号FJ493313.1)的反向扩增引物
GCAAGAAAATAACCTCTCCTTC
SEQ ID NO:5：普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区核苷酸序列 (GenBank登录号AH003085.2)
TCAATGGTTCCAGTATAAATGAAAGAAAAAGAAAAAGGAATGAC ATCACAACGAGATCCTAATCTCAAAAAGAAAGGGGGATATGGCGAAA TCGGTAGACGCTACGGACTTAATTGGATTGAGCCTTGGTATGGAAACT TACTAAGTGATCACTTTCAAATTCAGAGAAACCCTGGAATTAACAAA AATGGGCAATCCTGAGCCAAATCCTGTTTTCCGAAAACAAACAAAGG TTCAGAAAAAAAGGATAGGTGCAGAGACTCAATGGAAGCTATTCTAA CAAATGGAGTTAAATGCGTTGGTAGAGGAATCTTTACATCGAAACTTC AGAAAGAAAAAGAATGAAGTGAAGGATAAACGTATATACATACGTAT TGAATACTATATCAAAATCAAATGATTAATGATGACCCGAATCTGTAT TTTTTCTATAAAAAATAGAAGAATTGGTGTGAATCGATTCTACATTGA AGAAAGAATCGAATATTCATTGATCAAACCATTCACTCCATAGTCTGA TAGATCTTTTGAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGATAGAGT CCCGTTCTACATGTCAATACCGGCAACAATGAAATTTATCGTAAGAGG AAAATCCGTCGACTTTAAAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAGACTATTTCACTCCCCAACTATTTATCCGACCCCCTTTCCTTA GCGGTTCCAAATTCCTTATCTTTCTCATTCACTCTATTCTTTTAGAAAT GGATTTGAGCGTAAATGGCTTTCTCTTATCACAAGTCTTGTGATATAT ATGATACACATAGAAATGAACGTCTTTGAGCAAGGAATCCCTAGTTG AATGATTCCCTATCAATATCATTACTCATACTGAAACTTACAAAGTCA TCTTTTTGAAGATCGAAGAAATTCCCCGGCTTTGAGAAAATTTTTAAT CTACTTTTGTCCTTGTAATTGACATAGACCCCAGTTCTCTAATAAAATG AGGATACTACATTGGGAATAGCCGGGATAGCTCAGTTGGTAGAGCAG AGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAATCTGGTTCCTGGCACA TGATTAATTTGTATGGGTCTCTCTTCCCTCGAATTAATTTCTAATTAAT TGATATGAATCAACATACATATTCTTTTAGAGTCTAGATTAGAATAAT AGCTTTATCCAGTTTGGCGAGATATACCCCATCTATGTTCTAGATGGGTAGAGTTTCTTAGATAAAGT
SEQ ID NO:6：普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区(GenBank登录号AH003085.2)的扩增核苷酸序列
GCGTTGGTAGAGGAATCTTTACATCGAAACTTCAGAAAGAAAAA GAATGAAGTGAAGGATAAACGTATATACATACGTATTGAATACTATA TCAAAATCAAATGATTAATGATGACCCGAATCTGTATTTTTTCTATAA AAAATAGAAGAATTGGTGTGAATCGATTCTACATTGAAGAAAGAATC GAATATTCATTGATCAAACCATTCACTCCATAGTCTGATAGATCTTTT GAAGAACTGATTAATCGGACGAGAATAAAGATAGAGTCCCGTTCTAC ATGTCAATACCGGCAACAATGAAATTTATCGTAAGAGGAAAATCCGT CGACTTTAAAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAGAC TATTTCACTCCCCAACTATTTATCCGACCCCCTTTCCTTAGCGGTTCCA AATTCCTTATCTTTCTCATTCACTCTATTCTTTTAGAAATGGATTTGAG CGTAAATGG
SEQ ID NO:7：用于扩增普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区 (GenBank登录号AH003085.2)的正向扩增引物
GCGTTGGTAGAGGAATCTTT
SEQ ID NO:8:用于扩增普通烟草叶绿体trnL-trnF基因间间隔区 (GenBank登录号AH003085.2)的反向扩增引物
CCATTTACGCTCAAATCCAT。
序列表
<110> Philip Morris Products S.A.
<120> 植物材料分类方法
<130> P10546EP
<140> 18305638.1
<141> 2018-05-25
<160> 8
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 597
<212> DNA
<213> 普通烟草（Nicotiana tabacum）
<400> 1
acgggaattg aacccgcgca tggtggattc acaatccact gccttgatcc acttggctac 60
atccgccccc tcgcctactt acattccgtt tttacattat ttaaattaga aaacaaaaga 120
ttcaagttcg aatatagctc ttctttctta tttcaatgat attattattt caaagataag 180
agatattcaa agataagaga taagaagaag tcaaaatttg attttttttt tggaaaaaaa 240
aaatcaaaaa gatatagtaa cattagcaag aagagaaaca agttctattt ctacaatttt 300
aaacaaatac aaaatcaaaa tagaatactc aatcatgaat aaatgcaaga aaataacctc 360
tccttctttt tctataatgt aaacaaaaaa gtctatgtaa gtaaaatact agtaaataaa 420
taaaaagaaa aaaagaaagg agcaatagca ccctcttgat agaacaagaa aatgattatt 480
gctcctttct tttcaaaacc tcctatagac taggccagga tcttatccat ttgtagatgg 540
agcttcgata gcagctaggt ctagagggaa gttgtgagca ttacgttcat gcataac 597
<210> 2
<211> 259
<212> DNA
<213> 普通烟草
<400> 2
agaaaacaaa agattcaagt tcgaatatag ctcttctttc ttatttcaat gatattatta 60
tttcaaagat aagagatatt caaagataag agataagaag aagtcaaaat ttgatttttt 120
ttttggaaaa aaaaaatcaa aaagatatag taacattagc aagaagagaa acaagttcta 180
tttctacaat tttaaacaaa tacaaaatca aaatagaata ctcaatcatg aataaatgca 240
agaaaataac ctctccttc 259
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区的正向扩增引物
<400> 3
agaaaacaaa agattcaagt tcg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列e
<220>
<223> 用于扩增普通烟草trnH-psbA叶绿体基因间间隔区（GenBank登录号FJ493313.1）的反向扩增引物
<400> 4
gcaagaaaat aacctctcct tc 22
<210> 5
<211> 1260
<212> DNA
<213> 普通烟草
<400> 5
tcaatggttc cagtataaat gaaagaaaaa gaaaaaggaa tgacatcaca acgagatcct 60
aatctcaaaa agaaaggggg atatggcgaa atcggtagac gctacggact taattggatt 120
gagccttggt atggaaactt actaagtgat cactttcaaa ttcagagaaa ccctggaatt 180
aacaaaaatg ggcaatcctg agccaaatcc tgttttccga aaacaaacaa aggttcagaa 240
aaaaaggata ggtgcagaga ctcaatggaa gctattctaa caaatggagt taaatgcgtt 300
ggtagaggaa tctttacatc gaaacttcag aaagaaaaag aatgaagtga aggataaacg 360
tatatacata cgtattgaat actatatcaa aatcaaatga ttaatgatga cccgaatctg 420
tattttttct ataaaaaata gaagaattgg tgtgaatcga ttctacattg aagaaagaat 480
cgaatattca ttgatcaaac cattcactcc atagtctgat agatcttttg aagaactgat 540
taatcggacg agaataaaga tagagtcccg ttctacatgt caataccggc aacaatgaaa 600
tttatcgtaa gaggaaaatc cgtcgacttt aaaaatcgtg agggttcaag tccctctatc 660
cccaaaaaga ctatttcact ccccaactat ttatccgacc ccctttcctt agcggttcca 720
aattccttat ctttctcatt cactctattc ttttagaaat ggatttgagc gtaaatggct 780
ttctcttatc acaagtcttg tgatatatat gatacacata gaaatgaacg tctttgagca 840
aggaatccct agttgaatga ttccctatca atatcattac tcatactgaa acttacaaag 900
tcatcttttt gaagatcgaa gaaattcccc ggctttgaga aaatttttaa tctacttttg 960
tccttgtaat tgacatagac cccagttctc taataaaatg aggatactac attgggaata 1020
gccgggatag ctcagttggt agagcagagg actgaaaatc ctcgtgtcac cagttcaaat 1080
ctggttcctg gcacatgatt aatttgtatg ggtctctctt ccctcgaatt aatttctaat 1140
taattgatat gaatcaacat acatattctt ttagagtcta gattagaata atagctttat 1200
ccagtttggc gagatatacc ccatctatgt tctagatggg tagagtttct tagataaagt 1260
<210> 6
<211> 483
<212> DNA
<213> 普通烟草
<400> 6
gcgttggtag aggaatcttt acatcgaaac ttcagaaaga aaaagaatga agtgaaggat 60
aaacgtatat acatacgtat tgaatactat atcaaaatca aatgattaat gatgacccga 120
atctgtattt tttctataaa aaatagaaga attggtgtga atcgattcta cattgaagaa 180
agaatcgaat attcattgat caaaccattc actccatagt ctgatagatc ttttgaagaa 240
ctgattaatc ggacgagaat aaagatagag tcccgttcta catgtcaata ccggcaacaa 300
tgaaatttat cgtaagagga aaatccgtcg actttaaaaa tcgtgagggt tcaagtccct 360
ctatccccaa aaagactatt tcactcccca actatttatc cgaccccctt tccttagcgg 420
ttccaaattc cttatctttc tcattcactc tattctttta gaaatggatt tgagcgtaaa 480
tgg 483
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增普通烟草trnL-trnF叶绿体基因间间隔区的正向扩增引物
<400> 7
gcgttggtag aggaatcttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于扩增普通烟草叶绿体trnL-trnF基因间间隔区的反向扩增引物
<400> 8
ccatttacgc tcaaatccat 20