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与水稻核雄性不育表型相关的分子标记和应用

文献发布时间：2023-06-19 09:30:39

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及与水稻核雄性不育表型相关的分子标记和应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一。随着人口的增长和生活品质的提升，据预计到2050年水稻的年产量要提高1-2倍才能满足人类发展的需求。杂交水稻是父母本杂交后获得的子一代，其产量往往比常规稻亲本提高15％以上，抗性和适应性也远胜于亲本。因此，应用和推广杂交水稻是提高水稻产量的一个重要途径。

雄性不育系是杂交水稻育制种技术的关键节点。雄性不育系是指雄配子发育异常而丧失生育能力，雌配子发育正常的植物株系。它只能作为母本接受父本的花粉，自交不能结实。目前杂交水稻生产上应用的雄性不育系有核质互作型和光温敏型两种。核质互作型雄性不育系的不育基因在细胞质中，细胞核中没有育性恢复基因。当细胞核中有育性恢复基因的恢复系与其配组杂交时可以生产可育的子一代杂交种，当细胞核中没有育性恢复基因而细胞质中也没有不育基因的保持系与其杂交时可以繁殖不育系种子。由于需要不育系、保持系和恢复系三系配套，这种杂交水稻育制种技术常被称为“三系法”。一些控制核质互作型不育及相应育性恢复的基因已经被克隆(Chen and Liu，2014，Male sterility andfertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65：579-606)。核质互作型不育系是杂交水稻育制种中第一种大规模应用的不育系，为杂交水稻产业的建立和发展奠定了材料基础。然而由于核质互作型不育系的组配受到恢复系基因型的限制，导致只有约5％的种质资源能被利用。而细胞质的不育基因有导致米质差、特定病虫害流行的潜在风险。

光温敏型雄性不育系是一种育性受光温环境调控的不育系。在一定的光温条件下这种不育系保持不育，可用于组配杂交。当条件改变时不育系恢复育性，可用于不育系繁殖。由于光温敏雄性不育系实现了不育系和保持系的合二为一，只需要父本与其配组生产子一代杂交种，因此相应的育制种技术常被称为“两系法”。调控光温敏雄性不育的基因在细胞核中，目前已经克隆的基因包括PMS3、TMS5、CSA和TMS10(Chen and Liu，2014，Malesterility and fertility restoration in crops，Annu Rev Plant Biol，65:579-606；Zhou H，et al，2014，RNase ZS1 processes UbL40 mRNAs and controlsthermosensitive genic male sterility in rice，Nature Communications，5:4884-4892)。与核质互作型不育系相比，光温敏型不育系繁殖程序简单，配组因恢复基因广泛存在而更自由。光温敏不育系的大规模应用极大地巩固和推动了杂交水稻产业发展。然而，由于该型不育系的育性受光温环境影响，也导致制种风险高，制种地域受到限制。

为了克服目前杂交水稻育制种技术中存在的关键性缺陷，创造和利用新类型的不育系将是重要的突破口。

发明内容

本发明的目的是丰富现有技术中的核不育基因数量，提供一种含有水稻核雄性不育基因的分离的核苷酸片段，以及提供与水稻核雄性不育表型相关的分子标记。

为实现上述目的，本发明提供了一种作物育性基因及基于该基因突变所产生的隐性核不育类型的雄性不育系。该不育系育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。该不育系的育性恢复基因广泛存在于水稻种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复育性。

本发明提供的分离的核苷酸片段中含有的水稻核雄性不育基因命名为GMS4372。本发明在前期研究工作中，用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。选种子量较多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。在其中4372号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为gms4372。该突变体呈现隐性核雄性不育表型，该表型由突变后的GMS4372单基因(gms4372)控制。

本发明通过图位克隆的方法，将基因GMS4372精细定位在第2染色体长臂上的分子标记RM13562和RM13630之间1669.1Kb的区段内，并且本发明还发现该片段与标记RM13592、RM13599和RM13606共分离。

具体地，本发明提供以下技术方案：

本发明首先提供了一种分离的核苷酸片段，其定位在水稻2号染色体上，对应于分子标记RM13562和RM13630之间1669.1Kb的区段。所述的分离的核苷酸片段含有水稻核雄性育性调控基因GMS4372，该基因突变后导致水稻出现雄性不育表型。

本发明述及的水稻核雄性不育基因gms4372对应的野生型基因GMS4372定位在水稻2号染色体上，位于分子标记RM13562和RM13630之间1669.1Kb的区段内。

本发明提供了含有所述分离的核苷酸片段的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞。

本发明提供了与GMS4372共分离的分子标记，其为RM13592、RM13599和RM13606。本领域技术人员能够理解分子标记RM13592、RM13599和RM13606与所述水稻核雄性不育基因gms4372共分离，以及基于本发明的贡献，了解分子标记RM13592、RM13599和RM13606与水稻核雄性不育表型共分离或紧密连锁。

在RM13592序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在一个GAGAGAGAGAGAGAATGAGAGA共22个碱基的插入缺失。

所述共分离标记RM13592的序列由如SEQ ID No.1所示正向引物和如SEQ ID No.2所示反向引物扩增得到。共分离标记RM13592的引物在以93-11基因组DNA为模板时能扩增出一条105bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条127bp的条带。

在RM13599序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在一个CTCTCT共6个碱基的插入缺失。

所述共分离标记RM13599的序列由如SEQ ID No.3所示正向引物和如SEQ ID No.4所示反向引物扩增得到。共分离标记RM13599的引物在以93-11基因组DNA为模板时能扩增出一条93bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条99bp的条带。

在RM13606序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在一个CTCTCTCTCTCTCTCTCT共18个碱基的插入缺失。

所述共分离标记RM13606的序列由如SEQ ID No.5所示正向引物和如SEQ ID No.6所示反向引物扩增得到。共分离标记RM13606的引物在以93-11基因组DNA为模板时能扩增出一条101bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条83bp的条带。

基于本发明的发现，本发明提供了用于检测所述水稻核雄性不育基因gms4372的分子标记，其为以下任一分子标记：RM13592、RM13599和RM13606。

进一步地，本发明提供了与水稻核不育性状相关的分子标记组合，该组合含有分子标记：RM13592、RM13599和RM13606。

所述RM13592由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增得到；所述RM13599由SEQ ID NO.3-4所示引物扩增得到；所述RM13606由SEQ ID NO.5-6所示引物扩增得到。

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有以下任一或多个引物组：

引物组1：SEQ ID NO.1-2所示引物、引物组2：SEQ ID NO.3-4所示引物、引物组3：SEQ ID NO.5-6所示引物。

具体序列如下：

SEQ ID NO.1(5’-3’)：GTGTCTGCATTTCTGTATGTGTGG；

SEQ ID NO.2(5’-3’)：CGCTTAGCATTTACACACTCTCTCG；

SEQ ID NO.3(5’-3’)：GTTCATGGCACTCCTCTCCTAGC；

SEQ ID NO.4(5’-3’)：GAGGAATGAACAGTGCCTACACG；

SEQ ID NO.5(5’-3’)：CTTTACTTTGACTCGTCCTGTGG；

SEQ ID NO.6(5’-3’)：CTCACTGAATGTGAGTGAATGC。

本发明提供了上述分子标记、分子标记组合或其检测试剂或上述试剂盒在检测水稻核雄性不育基因gms4372、或该基因的基因型中的应用。

当使用RM13592标记引物进行扩增时，如果只出现105bp的条带，说明被检测材料具有雄性不育表型；如果只出现127bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型；如果同时出现105bp和127bp的条带，说明被检测材料是gms4372杂合基因型；

当使用RM13599标记引物进行扩增时，如果只出现93bp的条带，说明被检测材料具有雄性不育表型；如果只出现99bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型；如果同时出现93bp和99bp的条带，说明被检测材料是gms4372杂合基因型；

当使用RM13606标记引物进行扩增时，如果只出现101bp的条带，说明被检测材料具有雄性不育表型；如果只出现83bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型；如果同时出现101bp和83bp的条带，说明被检测材料是gms4372杂合基因型；

本发明进一步提供了上述分离的核苷酸片段、生物材料、或上述分子标记RM13592、RM13599和/或RM13606、或上述试剂盒在筛选或检测具有核不育表型的水稻中的应用。

本发明进一步提供了上述分离的核苷酸片段、生物材料、或上述分子标记RM13592、RM13599和/或RM13606、或上述分子标记的检测试剂或上述试剂盒在制备转基因植物、或作物改良育种、制种中的应用。

本发明提供的上述应用中，具体操作时，当使用RM13592标记引物进行扩增时，如果只出现105bp的条带，说明被检测材料具有雄性不育表型；如果只出现127bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型；如果同时出现105bp和127bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型。

当使用RM13599标记引物进行扩增时，如果只出现93bp的条带，说明被检测材料具有雄性不育表型；如果只出现99bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型；如果同时出现93bp和99bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型。

当使用RM13606标记引物进行扩增时，如果只出现101bp的条带，说明被检测材料具有雄性不育表型；如果只出现83bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型；如果同时出现101bp和83bp的条带，说明被检测材料不具有雄性不育表型。

本发明还提供了所述gms4372基因及与gms4372紧密连锁的分子标记在筛选水稻不育系中的应用。在gms4372突变体与其它水稻品种或材料的杂交、回交或自交后代中，当使用RM13592、RM13599和/或RM13606标记引物进行扩增时，如果只出现105bp、93bp或101bp的条带，说明被检测材料带是gms4372纯合基因型，具有雄性不育表型；如果只出现127bp、99bp或83bp的条带，说明被检测材料是GMS4372纯合基因型，不具有雄性不育表型；如果同时出现105bp和127bp，或93bp和99bp，或101bp和83bp的条带，说明被检测材料是gms4372杂合基因型，不具有雄性不育表型。

本发明的有益效果在于：本发明将一个新的水稻核雄性不育基因GMS4372定位在2号染色体一个1669.1Kb的染色体片段内，并与分子标记RM13592、RM13599和RM13606共分离，与分子标记RM13562和RM13630紧密连锁。gms4372的鉴定为隐性核雄性不育系的选育提供了新的基因资源，RM13592、RM13599和RM13606等标记的开发可以高效准确的对核雄性不育表型的水稻进行筛选和检测，从而提高以gms4372为不育基因的两系不育系的选育效率。GMS4372基因和该基因突变产生的不育系为研发水稻新型杂交育制种技术提供了元件，为解决现有技术存在的问题奠定了基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中4372家系不同植株的花粉染色分析结果，其中，A显示4372家系中可育植株的花粉碘-碘化钾溶液染色结果；B显示4372家系中不育植株的花粉碘-碘化钾溶液染色结果。

图2为本发明实施例2中GMS4372基因的定位结果，其中，A显示GMS4372基因在染色体上的位置；B显示GMS4372基因的粗定位结果；C显示GMS4372基因候选区段预测基因结果。

图3为本发明实施例2中用紧密连锁标记RM13592检测gms4372和明恢63的F2群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为亲本gms4372和明恢63；59个样本为gms4372和明恢63的F2群体分离出来的不育单株。

图4为本发明实施例2中用紧密连锁标记RM13599检测gms4372和明恢63的F2群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为亲本gms4372和明恢63；59个样本为gms4372和明恢63的F2群体分离出来的不育单株。

图5为本发明实施例2中用共分离标记RM13606检测gms4372和明恢63的F2群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为亲本gms4372和明恢63；59个样本为gms4372和明恢63的F2群体分离出来的不育单株。

图6为本发明实施例3中用标记RM13592检测不同品种和这些品种与gms4372的F1杂交种的基因型；其中，泳道1-10分别为亲本gms4372、明恢63、中花11、川香29B、宜香B、H28B、Q3B、新博B-1、新博B-2、中浙B，五丰B，泳道11-19为F1杂交种gms4372/明恢63、gms4372/中花11、gms4372/川香29B、gms4372/宜香B、gms4372/H28B、gms4372/Q3B、gms4372/新博B-1、gms4372/新博B-2、gms4372/中浙B、gms4372/五丰B。

图7为本发明实施例3中用标记RM13599检测不同品种和这些品种与gms4372的F1杂交种的基因型；其中，泳道1-10分别为亲本gms4372、明恢63、中花11、川香29B、宜香B、H28B、Q3B、新博B-1、新博B-2、中浙B，五丰B，泳道11-19为F1杂交种gms4372/明恢63、gms4372/中花11、gms4372/川香29B、gms4372/宜香B、gms4372/H28B、gms4372/Q3B、gms4372/新博B-1、gms4372/新博B-2、gms4372/中浙B、gms4372/五丰B。

图8为本发明实施例3中用标记RM13606检测不同品种和这些品种与gms4372的F1杂交种的基因型；其中，泳道1-10分别为亲本gms4372、明恢63、中花11、川香29B、宜香B、H28B、Q3B、新博B-1、新博B-2、中浙B，五丰B，泳道11-19为F1杂交种gms4372/明恢63、gms4372/中花11、gms4372/川香29B、gms4372/宜香B、gms4372/H28B、gms4372/Q3B、gms4372/新博B-1、gms4372/新博B-2、gms4372/中浙B、gms4372/五丰B。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1水稻核雄性不育突变体gms4372的表型和遗传分析

1)gms4372突变体的筛选

2013年6月用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。2014年春，选种子量较多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。在其中4372号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为gms4372。

2)gms4372突变体的表型分析

在临高正季栽培条件下，用碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I

3)gms4372突变体的遗传分析

在长日高温条件下种植gms4372的F2代1个分离群体68株，其中53株育性正常，15株表现雄性不育，可育与不育株分离比符合3:1(χ

实施例2雄性不育基因GMS4372的初步定位

使用极端性状混合池分析法(bulked segregant analysis)和隐性群体分析法(recessive-class analysis)对GMS4372基因进行定位。以明恢63为父本与gms4372突变体杂交构建了一个F2群体，分离出了59个不育株。利用301对均匀分布于12条染色体上的SSR标记筛选93-11与明恢63之间具有多态性的标记，筛选得到64对具有多态性的SSR标记，多态性较低，表明明恢63与93-11在基因组序列上差异较小。分别构建所述F2群体的可育株和不育株的混合基因池，利用所述64对多态性标记对所述可育基因池与不育基因池进行分析。结果表明2号染色体上的SSR标记RM263与gms4372的突变表型存在连锁关系。进一步利用上述连锁标记逐个分析明恢63和gms4372的F2群体中的不育株的基因型，最终确定目标基因初步定位于SSR标记RM263之间，由此将GMS4372粗定位于2号染色体上(图2的A)，通过在SSR标记RM263两侧继续筛选多态性标记，得到RM13660、RM13672和RM13682。GMS4372基因与RM13660、RM263、RM13672和RM13682标记之间的交换单株分别为3个，4个，4个，4个(图2的B)。

在上述粗定位结果的基础上，继续往交换单株较少的SSR标记RM13660的5’端继续发展标记，得到RM13552、RM13562、RM13592、RM13599、RM13606、RM13630。GMS4372基因与RM13552、RM13562、RM13592、RM13599、RM13606和RM13630标记之间的交换单株分别为1个，1个，0个，0个，0个，1个(图2的B)。

根据水稻在线数据库Rice Genome Annotation Project及标记定位结果，预测得到GMS4372位于该区段1669.1kb的范围内(图2的C)，通过继续扩大群体并进一步发展标记精细定位能够克隆该基因。

用紧密连锁标记RM13592检测gms4372和明恢63的F2群体中不育株的基因型，结果如图3所示。用紧密连锁标记RM13599检测gms4372和明恢63的F2群体中不育株的基因型，结果如图4所示，用共分离标记RM13606检测gms4372和明恢63的F2群体中不育株的基因型，结果如图5所示。

实施例3 RM13592、RM13599和RM13606在不同品种中的多态性

为了验证RM13592、RM13599和RM13606三个标记在指示gms4372突变体雄性不育表型上的特异性，分析在多个品种中三个标记的多态性，其中，RM13592由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增，RM13599由SEQ ID NO.3-4所示引物扩增，RM13606由SEQ ID NO.5-6所示引物扩增。图6泳道1-10显示，RM13592除了在gms4372、H28B、Q3B、中浙B和五丰B中扩增出105bp条带外，在其它亲本中扩增出了不同于亲本gms4372大小105bp的条带，图6泳道11-19显示在gms4372与其它亲本的F1杂种中除了上述H28B、Q3B、中浙B和五丰B供体外，与其他亲本能同时扩增出了2个亲本的条带，说明RM13592可以大部分不同品种中特异性标记gms4372的雄性不育表型。

图7泳道1-10显示，RM13599除了在gms4372和新博B-2中扩增出93bp条带外，在其它亲本中只扩增出了不同于亲本gms4372大小93bp的条带，图7泳道11-19显示在gms4372与其它亲本的F1杂种中除了新博B-2外，与其他亲本能同时扩增出了2个亲本的条带，说明RM13592可以大部分不同品种中特异性标记gms4372的雄性不育表型。

图8泳道1-10显示，RM13606在gms4372中扩增出101bp条带外，除了泳道8新博B-1，泳道10五丰B扩增出了不同于亲本gms4372大小83bp的条带，在其它亲本中只扩增出了83bp条带，图8泳道11-19显示在gms4372与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了2个亲本的条带，说明RM13606可以在不同品种中特异性标记gms4372的雄性不育表型。

实施例4利用gms4372基因转育新的不育系

用gms4372突变体与育性正常的受体，如博IIB和野香B，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行gms4372基因和遗传背景选择，最终获得博IIB和野香B背景下带有纯合gms4372突变基因的隐性核不育系。具体实施步骤如下：

1、以受体亲本，如博IIB和野香B，为父本与母本gms4372杂交获得F1。

2、以F1为母本与受体亲本，如博IIB和野香B，回交获得BC1F1。

3、种植BC1F1，分别使用引物序列如SEQ ID No.1-2、或SEQ ID No.3-4、或SEQ IDNo.5-6的引物对检测gms4372基因型，选择gms4372杂合基因型，即PCR扩增产物的条带同时出现105bp和不同亲本的条带，或同时出现93bp和不同亲本的条带，或同时出现101bp和不同亲本的条带。

4、使用一组基因型(例如200个)在gms4372突变体和轮回亲本之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(包括但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如博IIB和野香B，回交获得BC2F1。

6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出gms4372基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。

7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出gms4372基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的gms4372纯合株即gms4372基因的不育系。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 与水稻核雄性不育表型相关的分子标记和应用

<130> KHP201117367.8

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA