大麦转录因子HvWRKY6基因及其在小麦抗条锈病、叶锈病中的应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及大麦转录因子HvWRKY6基因及其在小麦抗条锈病、叶锈病中的应用。

背景技术

小麦(Triticum aestivum)是世界上最主要的粮食作物之一，其质量与产量严重影响着我国的粮食安全与社会稳定，小麦的高产与稳产对我国的农业发展有重要意义。由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici)和小麦叶锈菌(Pucciniatriticina,Pt)分别引起的小麦条锈病和小麦叶锈病，是严重影响我国小麦生产的重要叶部真菌病害。小麦条锈病和小麦叶锈病的发生与危害具有长期性、爆发性、流行性和变异性等特点，该病原菌可以随高空气流远距离传播，其有效防控是国际性难题，引起世界有关国家及其国际组织的广泛关注。该病害分布范围极广，在五大洲均有分布，中国是全世界小麦条锈病和小麦叶锈病发生面积最大，危害损失最严重的国家之一。纵观中国小麦条锈病和小麦叶锈病的发生流行与防治历史,预示着中国小麦生产时常处于条锈病危害的威胁之中。因此，发掘广谱性的抗病基因尤为必要。

在高等植物中广泛存在WRKY转录因子,其核心序列由60个氨基酸残基组成,最为保守的序列是WRKYGQK，WRKY之名也由此得来。研究表明，WRKY类转录因子在植物抗病防卫反应过程中起着非常重要的调控作用。WRKY6参与许多生长发育和逆境响应过程，WRKY6最早被报道的功能是参与植物病原体防御和衰老过程，在衰老的叶片和细菌侵染时WRKY6的表达显著提高。在持续的β氨基丁酸(BABA)诱导后再使用水杨酸处理，WRKY6表现出增强的反应，说明植物激素可以直接或者间接的调节WRKY转录因子的表达，可进一步表明其在植物抗病反应中的重要作用。本发明的目的在于提供大麦转录因子HvWRKY6基因及其在小麦抗条锈病、叶锈病中的应用。

发明内容

本发明提供了大麦转录因子HvWRKY6基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸形成的编码同等功能氨基酸序列的由SEQID No.1衍生的核苷酸序列。

本发明提供了前述基因序列的克隆方法，具体为：以大麦cDNA为模板，利用引物采用聚合酶链式反应PCR法克隆得到所述基因序列；所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2-3。

本发明提供了含有前述基因序列的表达载体。作为优选，所述表达载体为真核表达载体，进一步优选为pLGY-02(Ubi::Gene、T-DNA)载体。例如，所述真核表达载体可以为将前述基因序列克隆至pLGY-02载体获得。

本发明提供了含有前述表达载体的宿主。可选的，所述宿主可以为大肠杆菌、农杆菌、小麦等。例如，所述小麦可以为普通小麦春麦品种JW1。

本发明提供了前述基因序列在调控植物对小麦条锈病和小麦叶锈病病的抗病性方面的应用。作为优选，所述植物为小麦。更为优选，所述普通小麦为普通小麦春麦品种JW1。

本发明的有益效果在于：本发明提供了大麦HvWRKY6基因序列，以及过表达HvWRKY6小麦转基因材料的制备过程。并通过实验验证了所述小麦转基因材料对小麦条锈病和小麦叶锈病的抗病性显著提高。

附图说明

图1为本发明所述过表达HvWRKY6基因的小麦转基因材料接种小麦条锈菌CYR32的抗病水平显著提高。

图2为本发明所述过表达HvWRKY6基因的小麦转基因材料接种小麦叶锈菌THTT的抗病水平显著提高。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

植物材料：大麦品种Golden Promise，普通小麦春麦品种JW1。

菌株与载体：大肠杆菌TOP10感受态细胞(CB104)购自天根生化科技(北京)有限公司。T克隆载体pGEM-Teasy购自北京全式金生物技术有限公司。农杆菌GV3101和小麦转基因载体pLGY-02由本研究室保存。小麦条锈菌毒性生理小种CYR32由中国农业科学院植物保护研究所刘博老师提供，小麦叶锈菌生理小种THTT由本研究室保存。

主要试剂：琼脂糖购自SIGMA公司；2×Premix Taq酶购自北京康为世纪生物科技有限公司、限制性内切酶KpnⅠ、SpeⅠ(宝生物TaKaRa工程有限公司)；蔗糖、葡萄糖、胰蛋白胨、琼脂粉、Tween-20、异丙醇、甘油、β-巯基乙醇、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇、硼酸、Tris-HCl等试剂均购自保定市万科化学试剂经营部。AL2000 DNA Marker、质粒小提试剂盒、胶回收及纯化试剂盒购自生工生物工程股份有限公司、QIAGEN植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，SYBR Premix Dimer Eraser荧光定量试剂盒和反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

主要仪器：Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler PCR扩增仪(ThermoFisher)、WH-861旋涡混合器(太仓市科教器械厂)、高速冷冻离心机Centrifuge 5810R(Eppendorf公司)、小型高速台式离心机Centrifuge 5415D(Eppendorf公司)、超净工作台(AIR TECH公司)、恒温震荡培养箱(上海苏坤实业有限公司)、SX-500灭菌锅(TOMY公司)、制冰机(SCOTSMAN公司)、摩尔元素型超纯水机(上海摩勒科学仪器有限公司)、微波炉(Galanz公司)、水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)、微量移液器(Eppendorf公司)、SONY CarlZeiss Vario Sonnar照相机(SONY)、LightCycler96实时荧光定量PCR仪(Roche公司)、样品研磨机等。

实施例1、大麦HvWRKY6基因的克隆

大麦叶片RNA提取：使用RNA Extraction Kit试剂盒(QIAGEN,Hilden,Germany)进行RNA提取。将大麦材料“Golden Promise”苗期第二叶叶片样品在灭菌的研钵中用液氮迅速研磨成粉末状，待用。配制Buffer RLT混合液，每毫升Buffer RLT加入10μLβ-巯基乙醇，现配现用，混匀后冰上放置。从液氮中取出研磨好的RNA样品，迅速加入500μL Buffer RLT混合液，充分振荡，10000g离心2min。用移液枪吸取上清液转入至紫色离心柱中，10000g离心1min。将收集到的液体转入到粉色离心柱内，加入提前预冷的无水乙醇(加入量为收集液的1/2)，颠倒混匀，静置使核酸析出。瞬离30s，倒掉收集液。加入700μL RW1(洗除蛋白质)，瞬离30s，倒掉收集液。加入500μL的Buffer RPE(使用前需加入44mL无水乙醇)，瞬离30s，倒掉收集液。重复上述步骤一次，10000g离心2min。将离心柱换到一个新2mL收集管中，空离1min。离心结束后，将粉色离心柱放入到试剂盒自带的1.5mL离心管中，用移液枪在吸附膜中央加入30μL RNase-free water，离心1min。保存收集到的RNA样品，用Nanodrop超微量分光光度计测RNA浓度。

大麦cDNA反转录：提取得到的RNA样品用

PCR扩增：以大麦cDNA为模板，利用HvWRKY6基因扩增引物进行PCR扩增。引物信息如SEQ ID No.2-3。PCR扩增体系：cDNA：1μL，F/R引物各0.5μL，2×Premix Taq 12.5μL，ddH

PCR产物电泳及目的片段回收纯化：配置1％的琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳液，电泳条件设置为：U＝110V、I＝100mA、P＝90W、Time＝30min。将目的片段在切胶仪下切胶，利用凝胶回收试剂盒(生工公司)回收。

克隆载体构建：将回收产物连接到pGEM-Teasy载体，反应体系为：5μL的2×Buffer缓冲液、3.0μL PCR胶回收产物、1.0μL T4 DNA连接酶、1.0μL pGEM T-easy载体，离心使各试剂充分混匀，22℃连接至少1h或4℃过夜连接。

重组质粒的转化：取DH5α感受态细胞在冰上融化5min；加入全部的连接液混匀，冰浴20min；金属浴热激60s；冰浴5min后加LB液体培养基150μL；37℃并且200rpm摇50min；超净工作台涂板(Amp抗性固体培养基)，晾干后用封口膜封口，于37℃培养箱过夜培养。

重组质粒的筛选：挑取8个斑(每个斑留一半)，做好阳性及阴性对照，用通用引物T7-F/SP6-R或交叉引物进行PCR鉴定；阳性菌落挑斑摇菌，接种于10mL灭菌离心管中的6mLAmp抗性液体LB培养基中，于37℃摇床中200rpm震荡过夜培养。

质粒的提取：使用生工

小麦转基因载体pLGY-02的构建：提取测序正确的HvWRKY6-T重组质粒和pLGY-02载体的质粒，利用限制性内切酶KpnI+SpeI进行双酶切。具体酶切体系为：质粒1.0μg，KpnI(15U/μL)1.0μL，SpeI(10U/μL)1.0μL，10×Buffer 2.0μL，ddH

实施例3、HvWRKY6过表达小麦转基因植株的制备

农杆菌介导的小麦转基因材料制备由山东济南邦地生物有限公司完成，转化背景材料为普通小麦春麦材料JW1，采用农杆菌介导的小麦幼胚转化方法。

SDS法提取基因组DNA：取样并标记；每管加入1个打磨珠，用液氮预冷后配平放入打样机内，1100g打磨1min，取出后放入600μL Extraction buffer(100mL 0.1M Tris-HClpH＝7.5、100mL 0.5M EDTA pH＝8.0、125mL 10％SDS)震荡后放入65℃水浴锅水浴30min；取出放冰上15min冷却至室温再加入300μL的6M Ammonium Acetate(醋酸铵)混匀后放入4℃冰箱15min，12000g离心15min；取600μL上清液于已放入360μL异丙醇的1.5mL的离心管中，混匀置于4℃冰箱沉淀15min。取出后12000g离心15min，将上清液倒掉；加入400μL的75％乙醇，12000g离心15min，将上清液倒掉；重复上述步骤一次；将含有DNA的管放入超净工作台上，打开盖子，吹干；用100μL无菌水回溶DNA常温放置约半天。利用转基因载体检测引物对转基因材料基因组DNA进行PCR检测，确定转基因阳性植株。

实施例4、小麦转基因材料HvWRKY6-OE的抗条锈病、叶锈病抗性鉴定

小麦条锈菌和小麦叶锈菌的纯化和扩繁：接种前先将低温储存的小麦条锈菌毒性生理小种CYR32和小麦叶锈菌毒性生理小种THTT的夏孢子在42℃温水中活化30min，然后水化，加入0.1％Tween-20，用涂抹法将活化好的菌种均匀地接种到一心一叶的小麦感条锈菌材料JW1的叶片上，接种后喷水雾置于15±5℃黑暗条件下保湿12-18h后转入温室培养。套好玻璃罩子并蒙好纱布，接种后12d左右叶片表面出现大量孢子堆，在干燥条件下收集条锈菌的夏孢子，新鲜的锈菌孢子再扫描接种到一心一叶的小麦材料上，即可大量扩繁锈菌用于试验，在干燥条件下收集锈菌孢子备用，锈菌孢子近期使用则可以保存于4℃硅胶盒中，长期保存则抽真空处理于-20℃保存。

小麦转基因材料抗条锈病、叶锈病抗性鉴定：小麦转基因材料与其野生型种植一周后得到一叶一心期幼苗。第一片叶片完全展开时，利用抖接法接种纯化完成的小麦条锈菌CYR32和小麦叶锈菌THTT。将接种完成的麦苗放置于合适温度的培养室内，直至发病。取小麦转基因材料的第一叶进行转基因鉴定；取小麦转基因与野生型小麦的第二叶进行拍照，利用植物病害表型统计ASSESS软件进行产孢面积百分比的数据分析。结果表明，在小麦中过表达大麦转录因子HvWRKY6基因可显著提高植株对小麦条锈病(图1)和小麦叶锈病(图2)的抗性水平。

序列表

<110> 河北农业大学

<120> 大麦转录因子HvWRKY6基因及其在小麦抗条锈病、叶锈病中的应用<130> MLOC_78461

<141> 2020-11-20

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1026

<212> DNA

<213> HvWRKY6基因序列()

<400> 1

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<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列-正向引物()

<400> 2

ggtaccatgg cgtcttccgg cgg 23

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列-反向引物()

<400> 3

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