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抗-MUC1抗体-药物缀合物

文献发布时间：2023-06-19 09:49:27

发明领域

本发明涉及抗体药物缀合物（ADC）的领域。本发明的ADC包含抗-MUC1抗体或突变的抗-MUC1抗体。提供了具有突变的抗-MUC1抗体（其具有增加的抗原结合亲和力）的ADC。具体地，在人源化抗体PankoMab的突变形式中，重链可变区的天冬酰胺57被另一个氨基酸替换。从而，CDR2区域中的糖基化位点被缺失并且抗原结合亲和力增加。ADC显示出显著的抗肿瘤效力。在特定的实施方案中，本发明涉及该抗体药物缀合物的治疗和诊断用途以及生产这样的抗体药物缀合物的方法。

发明背景

针对肿瘤相关抗原的抗体是广泛使用的针对癌症的治疗剂。今天，许多抗癌抗体被批准用于人类治疗。这些抗体中的一些通过阻断对特定癌细胞的存活或增殖至关重要的某些信号传递途径起作用。其它抗癌抗体活化患者针对被靶向的癌细胞的免疫应答，例如启动通过天然杀伤细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。通过抗体的Fc部分与免疫细胞上的Fc受体的结合诱导该机制。

一组有趣且重要的抗体是针对粘蛋白的抗体。粘蛋白是由脊椎动物中的许多上皮组织产生的高分子量、高度糖基化的蛋白质家族。它们可以细分为由于疏水跨膜结构域（其有利于保留在质膜中）的存在而膜结合的粘蛋白，以及分泌到粘膜表面或分泌以变成唾液组分的粘蛋白。人粘蛋白家族由许多家族成员组成，包括膜结合的MUC1。

在许多腺癌中发生增加的粘蛋白产生，包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌等。粘蛋白也在肺病诸如哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺疾病或囊性纤维化中过度表达。已经关于它们在疾病过程中的病理学意义广泛研究了两种膜粘蛋白MUC1和MUC4。此外，还关于它们作为诊断标志物的潜力研究了粘蛋白。针对粘蛋白(Clin. Cancer Res., 2011 Nov1; 17(21):6822-30, PLoS One，2011 Jan 14;6(1):e15921)、特别是MUC1的几种抗体是本领域已知的。但是，仍可以改善它们的治疗功效。

鉴于此，本领域需要提供具有改善的性能的治疗性抗-MUC1抗体。

ADC由三个不同的组件（抗体、接头和药物/净荷）组成，其负责将净荷特异性地递送至目标细胞。迄今为止，已经有四种ADC (吉妥珠单抗奥加米星(Mylotarg®)、伊珠单抗奥加米星(Besponsa®)、Brentuximab vedotin (Adcetris®)、曲妥珠单抗emtansine (T-DM1; Kadcyla®))进入市场。此外，针对多种血液癌和实体瘤，有超过60种ADC正在开发中。ADC为新型癌症化疗创造了新的范例。凭借单克隆抗体的特异性和小分子药物的细胞毒性能力，ADC有望成为精密医学以及联合治疗的未来的重要组成部分。因此，持续需要提供其它ADC以及关于疾病的治疗和/或诊断的手段、方法和用途。

作为ADC，已知其中依沙替康经由接头缀合至抗体(例如抗-HER2抗体)的ADC(WO2014/057687, WO2015/115091)。但是，尚不知道其中将依沙替康缀合至抗-MUC1抗体的ADC。

发明内容

本发明的发明人已经发现，缺失抗-MUC1抗体PankoMab的重链可变区中的糖基化位点不会消除抗原结合，而是出乎意料地增加了所述抗体的抗原亲和力。鉴于糖基化位点位于重链可变区(CDR-H2)的第二互补性决定区中，这尤其令人惊讶。CDR是抗体中直接参与抗原结合并提供与表位的接触的那些区域。因此，通常预期修饰CDR的氨基酸对抗原结合亲和力是有害的。人源化的PankoMab抗体另外包含CDR-H2中的糖基化位点，该位点具有大碳水化合物结构。该碳水化合物结构直接存在于与抗原的结合界面上，且因此被认为参与抗原结合。但是，如在实施例中证实的，PankoMab变体(PM-N54Q)（其中通过置换带有碳水化合物结构的氨基酸来缺失糖基化位点）显示出增加的抗原结合亲和力。另外，本发明的发明人已经发现，包含PankoMab或PankoMab变体(PM-N54Q)的缀合物或抗体-药物缀合物(ADC)对MUC1阳性肿瘤表现出显著的抗肿瘤效力，并且PM-N54Q-ADC与PankoMab-ADC相比表现出具有显著的抗肿瘤效力。

因此，在第一方面，本发明涉及一种缀合物，其包含缀合至细胞毒性剂的抗体，其中所述抗体能够结合MUC1且包含

(i) 重链可变区，其包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

在第二方面，本发明涉及一种组合物，其包含根据本发明的缀合物。

根据第三方面，本发明提供了根据本发明的组合物或缀合物，其用于用在医学中，尤其用在癌症的治疗、预防或诊断中。

在第四方面，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括给具有癌症的受试者施用治疗有效量的根据本发明的缀合物。

在第五方面，本发明提供了包含根据本发明的缀合物的试剂盒或装置以及有关方法，其可用于MUC1相关障碍诸如癌症的诊断、检测或监测。

本领域技术人员从以下描述和所附权利要求会明白本发明的其它目的、特征、优点和方面。但是，应该理解，以下描述、所附权利要求和指示本申请的优选实施方案的具体实施例仅以举例说明的方式给出。通过阅读以下内容，本领域技术人员将容易明白在所公开发明的精神和范围内的各种变化和修改。

定义

本文中使用的以下表述通常旨在优选具有如下所述的含义，除非使用它们的上下文另有说明。

除了其字面含义之外，本文所用的表述“包含”还包括并且具体地指代表述“基本上由......组成”和“由......组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的要素的主题不包含其它要素的实施方案，以及其中“包含”具体列出的要素的主题可以和/或确实包含其它要素的实施方案。同样，表述“具有”应理解为表述“包含”，还包括并且具体地指代表述“基本上由......组成”和“由......组成”。在可能的情况下，术语“基本上由......组成”特别是指其中除了基本上组成主题的具体列出的要素以外主题包含20％或更少、特别是15％或更少、10％或更少、或尤其是5％或更少的其它要素的实施方案。

术语“抗体”特别是指包含通过二硫键连接的至少两条重链和两条轻链的蛋白质。每条重链由1个重链可变区(V

抗体的抗原结合部分通常是指抗体的全长或一个或多个片段，其保留特异性结合抗原的能力。已经证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。抗体的结合片段的例子包括Fab片段，其是由V

抗体的“Fab部分”特别是指包含重链和轻链可变区(V

抗体的“Fc部分”特别是指包含重链恒定区2、3和(在适用的情况下)4(C

本文中使用的术语“抗体”和“抗体构建体”在某些实施方案中分别指相同种类的抗体或抗体构建体群体。特别地，群体的所有抗体或抗体构建体显示出用于定义抗体或抗体构建体的特征。在某些实施方案中，群体中的所有抗体或抗体构建体具有相同的氨基酸序列。对特定种类的抗体（诸如能够特异性地结合MUC1的抗体）的提及特别是指这类的抗体的群体。

本文中使用的术语“抗体”还包括所述抗体的片段和衍生物。抗体的“片段或衍生物”特别地是蛋白质或糖蛋白，其来源于所述抗体并且能够结合与所述抗体相同的抗原，特别是结合相同的表位。因此，本文抗体的片段或衍生物通常是指功能片段或衍生物。在特别优选的实施方案中，抗体的片段或衍生物包含重链可变区。已经证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体或其衍生物的片段执行。抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，其是由每条重链和轻链的可变区和第一恒定区组成的单价片段；(ii)F(ab)

如果靶氨基酸序列在其整个长度上与参照氨基酸序列的相应部分具有至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％的同源性或同一性，则靶氨基酸序列“来源于”或“对应于”参照氨基酸序列。“相应部分”是指，例如，靶抗体的重链可变区的框架区1(FRH1)对应于参照抗体的重链可变区的框架区1。在特定实施方案中，“来源于”或“对应于”参照氨基酸序列的靶氨基酸序列在其整个长度上与参照氨基酸序列的相应部分是100％同源的，或特别是100％相同的。氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”优选根据本发明在参考序列的整个长度上或在参考序列的相应部分(其对应于定义同源性或同一性的序列)的整个长度上确定。衍生自亲本抗体的抗体(其由一个或多个氨基酸序列(例如特定CDR序列或特定可变区序列)定义)特别是具有氨基酸序列例如CDR序列或可变区序列的抗体，该氨基酸序列与亲本抗体的各氨基酸序列至少75％、优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同源或相同，尤其是相同。在某些实施方案中，衍生自亲本抗体(即其衍生物)的抗体包含与亲本抗体相同的CDR序列，但在可变区的其余序列中不同。

如本文所用的术语“抗体”还指多价和多特异性抗体，即具有各自结合相同表位的多于两个结合位点的抗体构建体，和具有结合第一表位的一个或多个结合位点和结合第二表位的一个或多个结合位点以及任选甚至与其它表位结合的其它结合位点的抗体构建体。

“特异性结合”优选是指，试剂例如抗体与其特异性靶标例如表位的结合相较于与另一靶标的结合更强。用于确定结合是否具有特异性的标准的例子可以包括解离常数(在本文中被称作“KD”)。如果试剂结合第一靶标的解离常数(K

术语“MUC1”表示蛋白MUC1，也被称作粘蛋白-1、多态性上皮粘蛋白(PEM)或癌症抗原15-3，特别表示人MUC1 (登记号P15941)。MUC1是粘蛋白家族的成员，并且编码膜结合的糖基化磷蛋白。MUC1具有120-225 kDa的核心蛋白质量，其通过糖基化增加至250-500 kDa。它延伸超出细胞表面200-500 nm。该蛋白质通过跨膜结构域锚定在许多上皮细胞的顶端表面上。细胞外结构域包括20个氨基酸的可变数目串联重复(VNTR)结构域，其中在不同的个体中重复的数目从20到120变化。这些重复序列富含丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基，其允许进行重度O-糖基化。在某些实施方案中，术语“MUC1”指肿瘤相关的MUC1(“TA-MUC1”)。TA-MUC1是存在于癌细胞上的MUC1。该MUC1与存在于非癌细胞上的MUC1的不同之处在于其高得多的表达水平、其定位和其糖基化。特别地，TA-MUC1无极地存在于癌细胞的整个细胞表面上，而在非癌细胞中，MUC1具有严格的顶端表达，因此不能用于全身施用的抗体。此外，TA-MUC1具有异常的O-糖基化，其暴露MUC1蛋白骨架上的新肽表位和新的碳水化合物肿瘤抗原，例如Thomsen-Friedenreich抗原α(TFα)。

“TFα”，也称为Thomsen-Friedenreich抗原α或Core-1，是指二糖Gal-ß1,3-GalNAc，其在癌细胞中以α-端基异构构型与蛋白质的羟基氨基酸丝氨酸或苏氨酸发生O-糖苷连接。

术语“唾液酸”特别是指神经氨酸的任何N-或O-取代的衍生物。它可以指5-N-乙酰基神经氨酸和5-N-羟乙酰基神经氨酸，但优选仅指5-N-乙酰基神经氨酸。唾液酸特别是5-N-乙酰基神经氨酸优选通过2,3-或2,6-键附接到碳水化合物链上。优选地，在本文所述的抗体中，存在2,3- 以及2,6-偶联的唾液酸。

根据本发明的“聚糖的相对量”是指分别与抗体制剂或包含抗体的组合物中的抗体附接的聚糖的特定百分比或百分比范围。特别地，聚糖的相对量是指在抗体中包含的和因此与抗体制剂或包含抗体的组合物中的抗体的多肽链附接的所有聚糖的特定百分比或百分比范围。100％的聚糖是指分别与抗体制剂或包含抗体的组合物中的抗体附接的所有聚糖。例如，10％的携带二等分GlcNAc的聚糖的相对量是指这样的包含抗体的组合物：其中抗体中包含的和因此与所述组合物中的抗体多肽链附接的所有聚糖的10％包含二等分GlcNAc残基，而抗体中包含的和因此与所述组合物中的抗体多肽链附接的所有聚糖的90％不包含二等分GlcNAc残基。代表100％的聚糖的相应参考量可以是与组合物中的抗体附接的所有聚糖结构，或所有N-聚糖，即与组合物中抗体的天冬酰胺残基附接的所有聚糖结构，或所有复合型聚糖。聚糖结构的参考组通常由技术人员明确指出或直接从环境中得出。

术语“N-糖基化”是指与蛋白质多肽链的天冬酰胺残基附接的所有聚糖。这些天冬酰胺残基通常是具有氨基酸序列Asn - Xaa - Ser/Thr的N-糖基化位点的一部分，其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。同样，“N-聚糖”是与多肽链的天冬酰胺残基附接的聚糖。术语“聚糖”、“聚糖结构”、“碳水化合物”、“碳水化合物链”和“碳水化合物结构”通常在本文中同义使用。N-聚糖通常具有由两个N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)残基和三个甘露糖残基组成的共同核心结构，具有结构Manα1,6-(Manα1,3-)Manβ1,4-GlcNAcβ1,4-GlcNAcβ1-Asn，其中Asn是多肽链的天冬酰胺残基。N-聚糖被细分为三种不同类型，即复合型聚糖、杂合型聚糖和高甘露糖型聚糖。

本文给出的数字，特别是特定糖基化性质的相对量，优选理解为近似数。特别地，该数字优选地可以高达10％更高和/或更低，特别是高达9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％更高和/或更低。

本文中使用的术语“抗体药物缀合物(ADC)”或“缀合物”通常是指抗体或其抗原结合片段与另一种试剂（诸如化学治疗剂、毒素、免疫治疗剂、成像探针等）的连接。所述连接可以是共价键或非共价相互作用，例如通过静电力。为了形成抗体药物缀合物，可以采用本领域已知的和本文所述的各种接头。另外，抗体药物缀合物可以以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白可以从编码免疫缀合物的多核苷酸表达。本文中使用的“融合蛋白”表示通过两个或更多个最初编码单独蛋白（包括肽和多肽）的基因或基因片段的连接而产生的蛋白质。融合基因的翻译产生具有来自每个原始蛋白的功能特性的单个蛋白。

在“缀合物”中，两个或更多个化合物连接在一起。在某些实施方案中，来自每种化合物的至少一些性质保留在缀合物中。可以通过共价或非共价键实现连接。优选地，缀合物的化合物通过共价键连接。缀合物的不同化合物可以通过化合物的原子之间的一个或多个共价键彼此直接结合。可替换地，化合物可以通过化学部分诸如接头分子彼此结合，其中接头共价连接到化合物的原子上。如果缀合物由超过两种化合物组成，则这些化合物可以例如以链构象连接，一种化合物连接至下一种化合物，或者数种化合物各自连接至一种中心化合物。

术语“核酸”包括单链和双链核酸和核糖核酸以及脱氧核糖核酸。它可以包含天然存在的以及合成的核苷酸，并且可以是天然或合成修饰的，例如通过甲基化、5'-和/或3'-加帽。

术语“表达盒”特别是指能够实现和调节其中引入的编码核酸序列的表达的核酸构建体。表达盒可包含启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其它控制元件。表达盒的确切结构可以根据物种或细胞类型而变化，但通常包括分别参与转录和翻译起始的5'-非转录和5'-和3'-非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。更具体地，5'-非转录的表达控制序列包含启动子区，其包括用于可操作地连接的核酸的转录控制的启动子序列。表达盒还可包含增强子序列或上游激活子序列。

根据本发明，术语“启动子”是指位于待表达的核酸序列的上游(5')并通过提供RNA聚合酶的识别和结合位点来控制序列的表达的核酸序列。“启动子”可以包括参与基因转录调节的其它因子的其它识别和结合位点。启动子可以控制原核或真核基因的转录。此外，启动子可以是“诱导型的”，即响应诱导剂引发转录，或者如果转录不受诱导剂控制，则可以是“组成型的”。如果不存在诱导剂，则在诱导型启动子控制下的基因不表达或仅在很小程度上表达。在诱导剂存在下，基因被打开或转录水平增加。通常，这通过特异性转录因子的结合来介导。

术语“载体”在本文中以其最一般的含义使用，并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其使得所述核酸能够例如被引入原核和/或真核细胞中，并且在适当时，被整合到基因组中。这种类型的载体优选在细胞中复制和/或表达。载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒基因组。本文所用的术语“质粒”通常涉及染色体外遗传物质的构建体，通常是环状DNA双链体，其可独立于染色体DNA复制。

根据本发明，术语“宿主细胞”涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞。根据本发明，术语“宿主细胞”包括原核(例如大肠杆菌)或真核细胞(例如哺乳动物细胞特别是人细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊或灵长类动物的细胞。细胞可以衍生自多种组织类型，并且包括原代细胞和细胞系。核酸可以以单拷贝或两个或更多个拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在宿主细胞中表达。

根据本发明的术语“患者”是指人、非人灵长类动物或其它动物，特别是哺乳动物，例如牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿动物，例如小鼠和大鼠。在特别优选的实施方案中，患者是人。

根据本发明的术语“癌症”特别包括白血病，精原细胞瘤，黑素瘤，癌，畸胎瘤，淋巴瘤，肉瘤，间皮瘤，神经母细胞瘤，神经胶质瘤，直肠癌，子宫内膜癌，肾癌，肾上腺癌，甲状腺癌，血癌，皮肤癌，脑癌，宫颈癌，肠道癌，肝癌，结肠癌，胃癌，肠癌，头颈癌，胃肠癌，淋巴结癌，食道癌，结肠直肠癌，胰腺癌，耳、鼻和喉(ENT)癌症，乳腺癌，前列腺癌，膀胱癌，子宫癌，卵巢癌和肺癌及其转移灶。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移灶。

术语“肿瘤”是指由错误调节的细胞增殖形成的一组细胞或组织。肿瘤可能显示结构组构和与正常组织的功能协调的部分或完全缺乏，并且通常形成独特的组织块，其可以是良性的或恶性的。

术语“肿瘤”和“癌症”互换使用。

术语“转移”是指癌细胞从其原始部位扩散到身体的另一部分。转移的形成是一个非常复杂的过程，并且通常涉及癌细胞从原发肿瘤脱离、进入体循环并沉降至体内其它部位的正常组织内生长。当肿瘤细胞转移时，新肿瘤称为继发性或转移性肿瘤，其细胞通常与原始肿瘤相似。这意味着，例如，如果乳腺癌转移到肺部，则继发性肿瘤由异常的乳腺细胞组成，而不是由异常的肺细胞组成。然后将肺中的肿瘤称为转移性乳腺癌，而不是肺癌。

术语“药物组合物”特别是指适合施用至人或动物的组合物，即含有药学上可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或其盐或前药以及载体、稀释剂或药物赋形剂，例如缓冲剂、防腐剂和张度调节剂。

本文描述的数字范围包括定义该范围的数字。本文提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案(其可以通过参考整个说明书来阅读)的限制。根据一个实施方案，本文描述为在方法的情况下包括某些步骤或在组合物的情况下包含某些成分的主题表示由各个步骤或成分组成的主题。优选的是，选择和组合本文所述的优选方面和实施方案，并且由优选实施方案的相应组合产生的具体主题也属于本公开内容。

具体实施方式

本发明是基于人源化的抗-MUC1抗体PankoMab的变体的开发，其中CDR-H2中的糖基化位点被缺失(PM-N54Q)。通过将重链可变区的氨基酸Asn (天冬酰胺) 57(即，SEQ IDNO:11的氨基酸编号: 57)替换为另一种氨基酸，特别是Gln（谷氨酰胺），实现糖基化位点的缺失。Asn 57是碳水化合物结构所连接的糖基化位点的受体氨基酸残基。用另一残基置换该天冬酰胺残基会消除糖基化，因为碳水化合物结构仅可以通过宿主细胞的酶转移至天冬酰胺残基。令人惊讶地发现，PankoMab的CDR-H2中的糖基化位点的缺失增加了抗体的抗原结合亲和力。

考虑到这些发现，本发明提供了一种缀合物，其包含与细胞毒性剂缀合的抗体，其中所述抗体能够结合MUC1且包含

结合MUC1

该抗体特异性地结合MUC1的表位。该表位是在MUC1的细胞外串联重复中。在某些实施方案中，所述抗体以糖基化依赖性的方式结合MUC1。具体地，如果所述串联重复在苏氨酸残基处被N-乙酰基半乳糖胺(Tn)、唾液酸基α2-6 N-乙酰基半乳糖胺(sTn)、半乳糖ß1-3 N-乙酰基半乳糖胺(TF)或半乳糖ß1-3 (唾液酸基α2-6) N-乙酰基半乳糖胺(sTF)、优选Tn或TF糖基化，则所述抗体更强地结合。优选地，碳水化合物部分通过α-O-糖苷键与苏氨酸残基结合。MUC1的串联重复结构域中的表位特别包含氨基酸序列PDTR (SEQ ID NO: 13)或PESR(SEQ ID NO: 14)。如上所述，与该表位的结合优选是糖基化依赖性的，其中特别是如果上述碳水化合物部分分别附着于序列PDTR或PESR (SEQ ID NO: 13和14)的苏氨酸残基上，则结合增加。

该表位是肿瘤相关的MUC1表位(TA-MUC1)。TA-MUC1表位特别是指MUC1的表位，其存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上，和/或仅当存在于肿瘤细胞上但不存在于正常细胞上时才可被宿主循环中的抗体接近。在某些实施方案中，抗体与表达TA-MUC1表位的细胞的结合比与表达正常的非肿瘤MUC1的细胞的结合更强。优选地，所述结合强至少1.5倍，优选强至少2倍，强至少5倍，强至少10倍或强至少100倍。对于TA-MUC1结合，抗体优选地特异性地结合糖基化的MUC1肿瘤表位，使得与相同长度和相同肽序列的未糖基化肽的键相比，键的强度增加至少2倍，优选4倍或10倍，最优选20倍。通过ELISA、RIA、表面等离子体共振(在下文中，被称作“SPR”)分析等，可以测定或确定所述结合。在SPR分析中使用的设备的例子可以包括BlAcore(TM)（由GE Healthcare Bio-Sciences Crop.制造），ProteOn(TM)（由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造），DRX2 Biosensor（由Dynamic Biosensors GmbH制造），SPR-Navi(TM)（由BioNavis Oy Ltd.制造），Spreeta(TM)（由Texas Instruments Inc.制造），SPRi-PlexII(TM)（由Horiba, Ltd.制造）和Autolab SPR(TM)（由Metrohm制造）。通过流式细胞计量术等可以测定抗体与在细胞表面上表达的抗原的结合。

此外，该抗体可以表现出与参照抗体相似的抗原结合特性，所述参照抗体包含具有SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区。优选地，参照抗体是人源化抗体PankoMab。特别地，该抗体与参照抗体特异性地结合相同的抗原，并且优选以更高的亲和力结合所述抗原。也就是说，该抗体优选地以具有低于参照抗体的解离常数的解离常数的亲和力结合抗原，更优选低至少10％，低至少20％，低至少30％或低至少50％。此外，该抗体优选地显示与参照抗体的交叉特异性，所述参照抗体包含具有SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区。特别地，如果以足够高的浓度存在，人源化抗体能够阻断参照抗体与MUC1的结合。如果在所述抗体已经与抗原MUC1结合时参照抗体与MUC1的结合受到阻碍，则这是可能的。

抗-MUC1抗体

能够结合MUC1的抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，所述轻链可变区包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

在某些实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述重链可变区仍然包含具有SEQ ID NO: 1、2和3的氨基酸序列的CDR。因此，相对于SEQ ID NO: 9的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 9的氨基酸序列。

在某些实施方案中，CDR-H2具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:2的位置8处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸；特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸。优选地，在SEQ ID NO: 2的位置8处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸，特别是谷氨酰胺。具体地，CDR-H2具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。

在某些实施方案中，CDR-H2具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3。因此，相对于SEQ ID NO: 10的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3。因此，相对于SEQ ID NO: 11的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述轻链可变区仍然包含具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列的CDR。因此，相对于SEQ ID NO: 12的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区具有与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、2和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链可变区具有与SEQ IDNO: 9的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区具有与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、7和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链可变区具有与SEQID NO: 10的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ IDNO: 1、7和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区具有与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、8和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链可变区具有与SEQID NO: 11的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ IDNO: 1、8和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区包含这样的氨基酸序列：其与由SEQ ID NO:20的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列具有至少90%同一性。特别地，所述重链可变区包含这样的氨基酸序列：其与由SEQ ID NO: 20的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性。在这些实施方案中，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3。因此，相对于由SEQ ID NO: 20的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链可变区包含由SEQID NO: 20的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 20的位置76处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸；特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸。优选地，在SEQ ID NO:20的位置76处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸，特别是谷氨酰胺。具体地，CDR-H2具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列和/或所述重链可变区包含由SEQ ID NO: 23的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述轻链可变区包含这样的氨基酸序列：其与由SEQ ID NO:21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列具有至少90%同一性。特别地，所述轻链可变区包含这样的氨基酸序列：其与由SEQ ID NO: 21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性。在这些实施方案中，所述轻链可变区仍然包含具有SEQ IDNO: 4、5和6的氨基酸序列的CDR。因此，相对于由SEQ ID NO: 21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述轻链可变区包含由SEQ ID NO: 21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链可变区具有这样的氨基酸序列：其与由SEQ ID NO:20的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列具有至少90%同一性，其中所述CDR仍然具有SEQID NO: 1、7和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有这样的氨基酸序列：其与由SEQ IDNO: 21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列具有至少90%同一性，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链可变区具有与由SEQ ID NO: 20的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、7和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与由SEQ ID NO: 21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链包含与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述重链包含与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述重链包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3。因此，相对于SEQ ID NO: 15的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链包含SEQ ID NO: 15的氨基酸序列。在某些实施方案中，在SEQID NO: 15的位置57处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸；特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸。优选地，在SEQID NO: 15的位置57处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸，特别是谷氨酰胺。具体地，CDR-H2具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列和/或所述重链可变区包含由SEQ IDNO: 22的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链包含与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述重链包含与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述重链包含具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3。因此，相对于SEQ ID NO: 19的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述轻链包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述轻链包含与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述轻链仍然包含具有SEQ ID NO:4、5和6的氨基酸序列的CDR。因此，相对于SEQ ID NO: 16的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述轻链包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链具有与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、7和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链具有与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、7和3的氨基酸序列，且所述轻链具有与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

在具体实施方案中，所述重链具有与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、8和3的氨基酸序列，且所述轻链具有与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链具有与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、8和3的氨基酸序列，且所述轻链具有与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

所述抗体包括并涵盖其修饰形式。抗体的修饰形式是指具有化学或生物学修饰的抗体。化学修饰形式包括具有与化学部分缀合的氨基酸骨架的形式，具有化学修饰的N-连接的或O-连接的碳水化合物链的形式，等等。所述化学部分或形式可以是毒性的或细胞毒性的。生物修饰的形式包括已经经历翻译后修饰(例如，N-连接的或O-连接的糖基化、N-端或C-端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、或甲硫氨酸的氧化)的形式，含有通过使用原核宿主细胞表达而添加到N-端的甲硫氨酸残基的形式，等等。这样的修饰形式还意图包括被标记以允许检测或分离抗体或抗原的形式，例如，酶标记的形式、荧光地标记的形式或亲和力标记的形式。抗体的这样的修饰形式可用于改善原始抗体的稳定性或血液滞留，降低抗原性，检测或分离抗体或抗原,等。

具体地，所述抗体可以包含选自以下的一种或多种修饰：去岩藻糖基化，减少的岩藻糖，N-连接的糖基化，O-连接的糖基化，N-端加工，C-端加工，脱酰胺化，天冬氨酸的异构化，甲硫氨酸的氧化，在重链的位置234和235 (根据EU索引)处的2个亮氨酸(L)残基置换为丙氨酸(A)(LALA)，脯氨酸残基的酰胺化，和在羧基端的1、2或3个氨基酸的缺失或缺少。在具体实施方案中，所述抗体在一个或两个重链中缺少1、2或3个羧基端氨基酸，或者它缺少2个羧基端氨基酸且羧基端脯氨酸残基在一个或两个重链处酰胺化。

这样的修饰可以在其抗体的任意位置或期望位置进行。可替换地，可以在其中的一个或两个或更多个位置处进行相同的或2种或更多种不同的修饰。

例如，已知由培养的哺乳动物细胞产生的抗体在其重链中缺乏羧基端赖氨酸残基(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))。还已知的是，偶尔重链的2个羧基端氨基酸残基(即，甘氨酸和赖氨酸)缺失，并且新定位于羧基端的脯氨酸残基被酰胺化(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。但是，这些重链序列中的这样的缺失或修饰既不影响抗体与其抗原结合的能力，也不影响抗体的效应子功能（补体激活，抗体依赖性的细胞毒性，等）。

在某些实施方案中，所述抗体包含在重链的羧基端中的1或2个氨基酸的缺失或缺少，并且具有酰胺化的残基（例如，在重链的羧基端位点处的酰胺化的脯氨酸残基）。但是，所述抗体不限于上述类型，只要缺失突变体保持结合抗原的能力即可。

在某些实施方案中，抗体的两条重链可以由选自以下的任何一种类型的重链组成：全长重链和缺失突变体的重链，或者可以由从其中选择的任意两种类型的组合组成。缺失变体重链的定量比取决于产生抗体的培养的哺乳动物细胞的类型以及细胞的培养条件。

在具体实施方案中，所述抗体可以包括两条重链，两条均缺少一个羧基端氨基酸残基。

在具体实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 15或22的氨基酸编号1-446表示的氨基酸序列，所述轻链具有由SEQ ID NO: 16的氨基酸编号1-219表示的氨基酸序列。在某些实施方案中，在SEQ ID NO: 15的位置57处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸；特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸。优选地，在SEQ ID NO: 15的位置57处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、赖氨酸或精氨酸，特别是谷氨酰胺。

在具体实施方案中，所述抗体包含重链和轻链，所述重链具有由SEQ ID NO: 19的氨基酸编号1-446表示的氨基酸序列，所述轻链具有由SEQ ID NO: 16的氨基酸编号1-219表示的氨基酸序列。

在某些实施方案中，所述抗体与以下抗体竞争对TA-MUC1的结合：包含具有SEQ IDNO: 10的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区的抗体，或包含具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

在某些实施方案中，所述抗体具有以下性能：(a)特异性地结合MUC1，和/或(b)具有通过与MUC1结合而被内化进表达MUC1的细胞中的活性。在某些实施方案中，所述抗体包含至少一条抗体重链。特别地，所述抗体包含两条抗体重链。抗体重链特别地包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在某些其它实施方案中，所述抗体重链包含CH2结构域和CH3结构域，但不包含CH1结构域。在其它实施方案中，重链的一个或多个恒定结构域可以被其它结构域、特别是类似的结构域替代，例如白蛋白。抗体重链可以是任何类型，包括γ-、α-、ε-、δ-和 μ-链，并且优选是γ-链，包括γ1-、γ2-、γ3-和γ4-链，尤其是γ1-链。因此，该抗体优选是IgG-型抗体，诸如IgG1-、IgG3-或IgG4-型抗体，特别是IgG1-型抗体。

具体地，所述抗体进一步包含至少一条抗体轻链，特别是两条抗体轻链。抗体轻链特别包含VL结构域和CL结构域。抗体轻链可以是κ-链或λ-链，尤其是κ-链。

在某些实施方案中，所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链。具体地，所述抗体包含两条γ1-型的抗体重链和两条κ-型的抗体轻链，每条抗体重链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域，每条抗体轻链包含VL结构域和CL结构域。

在替代实施方案中，所述抗体不包含抗体轻链。在这些实施方案中，所述轻链可变区可以融合至重链可变区的N末端或插入重链可变区的C末端。可以存在肽接头以将轻链可变区与重链的其余部分连接。

在优选的实施方案中，所述抗体包含Fc区。该抗体尤其可以是完整抗体，其包含两个重链和两个轻链，每个重链包含结构域VH、CH1、铰链区、CH2和CH3，每个轻链包含结构域VL和CL。该抗体特别能够结合一种或多种人Fcγ受体，特别是人Fcγ受体IIIA。在替代实施方案中，所述抗体不结合或不显著结合人Fcγ受体IIIA，尤其是不结合或不显著结合任何人Fcγ受体。在这些实施方案中，所述抗体特别地不包含在CH2结构域中的糖基化位点。

在替代实施方案中，所述抗体不包含Fc区。在这些实施方案中，所述抗体特别是单链可变区片段（scFv）或不包含Fc区的另一抗体片段。

抗-MUC1抗体的糖基化

抗-MUC1抗体可以包含一条或多条抗体重链中的CH2结构域。IgG类型的天然人抗体包含在CH2结构域中的N-糖基化位点。存在于抗体中的CH2结构域可以包含或不包含N-糖基化位点。

在某些实施方案中，所述抗体不包含在CH2结构域中的糖基化位点。具体地，根据IMGT/Eu编号系统，所述抗体不包含在重链中对应于位置297的位置处的天冬酰胺残基。例如，所述抗体可以包含在重链中的Ala297突变。在这些实施方案中，所述抗体优选地具有强烈降低的通过结合Fcγ受体而诱导抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)和/或抗体依赖性的细胞的吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)的能力或完全缺乏此能力。在这方面，强烈降低的能力特别是指与在其CH2结构域中包含N-糖基化位点并具有共同的哺乳动物糖基化模式(例如可通过在人细胞系或CHO细胞系中生产而获得的那些，例如本文所述的糖基化模式)的相同抗体相比，降低至10％或更低、特别是3％或更低、1％或更低或0.1％或更低的活性。在这些实施方案中，所述抗体具体地是IgG1-型抗体。

在替代实施方案中，在抗体中存在的CH2结构域包含N-糖基化位点。该糖基化位点具体地是在对应于根据IMGT/Eu编号系统的重链的氨基酸位置297的氨基酸位置，并且具有氨基酸序列基序Asn Xaa Ser/Thr，其中Xaa可以是除脯氨酸外的任何氨基酸。在Asn297处的N-连接的糖基化在哺乳动物IgG以及其它抗体同种型的同源区域中是保守的。由于可能存在于可变区中的任选额外氨基酸或其它序列修饰，该保守糖基化位点的实际位置可以在抗体的氨基酸序列中变化。优选地，与抗体附接的聚糖是双触角复合型N-连接碳水化合物结构，优选至少包含以下结构：

Asn - GlcNAc - GlcNAc - Man - (Man - GlcNAc)

其中Asn是抗体的多肽部分的天冬酰胺残基；GlcNAc是N-乙酰基葡糖胺，且Man是甘露糖。末端GlcNAc残基可以进一步携带半乳糖残基，其任选地可以携带唾液酸残基。另一个GlcNAc残基(称为二等分GlcNAc)可以与最接近多肽的Man附接。岩藻糖可以与附接于Asn的GlcNAc结合。在这些实施方案中，所述抗体具体地是IgG1-型抗体。

在优选的实施方案中，所述抗体不包含N-羟乙酰基神经氨酸(NeuGc)或可检测量的NeuGc。此外，所述抗体优选地还不包含Galili表位(Galα1,3-Gal结构)或可检测的量的Galili表位。特别地，携带NeuGc和/或Galα1,3-Gal结构的聚糖的相对量小于抗体群体中与抗体的CH2结构域附接的聚糖总量的0.1％或甚至小于0.02%。

具体地，所述抗体具有人糖基化模式。由于这些糖基化特性，不存在诱导副作用的外来免疫原性非人结构，这意味着避免了已知由某些外来糖结构(例如对于啮齿动物生产系统而言已知的免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal结构)，或其它结构如从例如酵母系统已知的免疫原性高甘露糖结构)引起的不希望的副作用或缺点。

在具体实施方案中，所述抗体包含具有可检测的量的携带二等分GlcNAc残基的聚糖的糖基化模式。具体地，携带二等分GlcNAc残基的聚糖的相对量是组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的至少0.5％，尤其是至少1％。此外，在某些实施方案中，所述糖基化模式包含的携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体附接的聚糖的总量的至少25%。具体地，携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体附接的聚糖的总量的至少30%，尤其是至少35%或至少40%。在具体实施方案中，所述糖基化模式包含的携带至少一个唾液酸残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体附接的聚糖的总量的至少1%。具体地，携带至少一个唾液酸残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体附接的聚糖的总量的至少1.5%，尤其是至少2%。

所述抗体可以具有这样的糖基化模式：其具有大量的核心岩藻糖或小量的核心岩藻糖。减少量的岩藻糖基化会增加抗体的诱导ADCC的能力。在某些实施方案中，携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量是组合物中与抗体附接的聚糖的总量的40%或更少，特别是30%或更少或20%或更少。在替代实施方案中，携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量是组合物中与抗体附接的聚糖的总量的至少60%，尤其是至少65%或至少70%。

通过糖基化位点在抗-MUC1抗体的CH2结构域中的存在或不存在以及在所述糖基化位点处的聚糖结构中岩藻糖的存在或不存在，可以控制抗体诱导ADCC的能力和所述ADCC诱导的强度。ADCC活性通过抗体的Fc部分的糖基化来增加，并进一步通过减少所述糖基化中的岩藻糖基化的量来增加。在某些应用中，ADCC活性的微调是重要的。因此，在某些情况下，在CH2结构域中没有糖基化位点的抗体，在CH2结构域中具有糖基化位点并具有大量岩藻糖基化的抗体，或在CH2结构域中具有糖基化位点并具有少量岩藻糖基化的抗体可能是最有利的。

抗-MUC1抗体的产生

优选在宿主细胞中重组产生抗体。用于产生抗体的宿主细胞可以是可用于抗体产生的任何宿主细胞。合适的宿主细胞具体地是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物宿主细胞。示例性宿主细胞包括酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞系，昆虫细胞如SF9和SF21细胞系，植物细胞，禽类细胞如EB66鸭细胞系，啮齿动物细胞如CHO、NS0、SP2/0和YB2/0细胞系和人细胞如HEK293、PER.C6、CAP、CAP-T、AGE1.HN、Mutz-3和KG1细胞系。

在某些实施方案中，在人血细胞系中、特别是在人髓样白血病细胞系中重组产生抗体。可用于产生抗体的优选人细胞系以及合适的生产程序描述于WO 2008/028686 A2中。在一个具体实施方案中，通过在选自NM-H9D8、NM-H9D8-E6和NM-H9D8-E6Q12以及由其衍生出的细胞系的人髓样白血病细胞系中表达而获得抗体。这些细胞系根据布达佩斯条约的要求在登录号DSM ACC2806 (NM-H9D8；保藏于2006年9月15日)、DSM ACC2807 (NM-H9D8-E6；保藏于2006年10月5日)和DSM ACC2856 (NM-H9D8-E6Q12；保藏于2007年8月8日)下由Glycotope GmbH, Robert-Rössle-Str. 10, 13125柏林(DE)保藏在Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Inhoffenstraße 7B, 38124Braunschweig (DE)。NM-H9D8细胞提供具有高度唾液酸化、高度二等分GlycNAc、高度半乳糖基化和高度岩藻糖基化的糖基化模式。NM-H9D8-E6和NM-H9D8-E6Q12细胞提供与NM-H9D8细胞类似的糖基化模式，除了岩藻糖基化程度非常低以外。其它合适的细胞系包括K562(存在于美国典型培养物保藏中心中的人髓样白血病细胞系(ATCC CCL-243))以及衍生自上述细胞系的细胞系。

在其它实施方案中，在CHO细胞中重组产生抗体。具体地，可以在CHO dhfr-细胞系诸如ATCC No. CRL-9096的细胞系中重组产生抗体。

抗-MUC1抗体的缀合物

根据本发明，将抗体与一种或多种细胞毒剂缀合。细胞毒性剂可以是适合与抗体缀合的任何细胞毒性剂。如果在抗体中存在超过一种细胞毒性剂，则这些细胞毒性剂可以是相同的或不同的，且特别是全部相同的。细胞毒性剂与抗体的缀合可以使用本领域已知的任何方法实现。细胞毒性剂可以共价地（特别是通过融合或化学偶联）或非共价地附着于抗体。在某些实施方案中，细胞毒剂共价地附着于抗体，尤其是通过接头部分。接头部分可以是适合将细胞毒剂附着于抗体的任何化学实体。

除细胞毒性剂外，根据本发明的缀合物可以进一步包含与之缀合的其它试剂。所述其它试剂优选用于疾病、特别是癌症的治疗、诊断、预后和/或监测。例如，所述其它试剂可以选自放射性核素、化学治疗剂、抗体或抗体片段，特别是与抗-MUC1抗体具有不同特异性的那些，例如阻断或活化免疫调节性靶标的检验点抗体、酶、相互作用结构域、可检测标记物、毒素、细胞裂解组分、免疫调节剂、免疫效应物、MHC I类或II类抗原和脂质体。

一种特别优选的细胞毒性剂是放射性核素或能够杀死癌细胞的细胞毒性剂，例如化学治疗剂。在某些优选的实施方案中，将化学治疗剂连接至抗-MUC1抗体形成缀合物。对化学治疗剂没有特别限制，只要该化合物具有抗肿瘤作用并且具有可与接头结构连接的取代基或部分结构即可。在肿瘤细胞中切割接头的部分或全部后，化学治疗剂或抗肿瘤化合物部分被释放，从而化学治疗剂表现出抗肿瘤作用。随着接头在与试剂的连接位置处被切割，化学治疗剂以其原始结构释放，以发挥其原始的抗肿瘤作用。

可以作为细胞毒性剂缀合的化学治疗剂的具体实例包括烷化剂诸如顺铂、抗代谢药、植物生物碱和萜类化合物、长春花生物碱、鬼臼毒素、紫杉烷诸如泰素、拓扑异构酶抑制剂诸如伊立替康和托泊替康、抗肿瘤药诸如多柔比星或微管抑制剂诸如美坦辛/美坦辛类。

所述化学治疗剂可以特别地选自：V-ATP酶抑制剂、促细胞凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、多拉司他汀、美坦辛、美坦辛类、鹅膏毒肽、甲硫氨酸氨肽酶、核输出蛋白CRM1的抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中磷酰基转移反应的抑制剂、蛋白合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟结合剂、DHFR抑制剂、微管形成的抑制剂、微管的稳定剂、肌动蛋白的稳定剂、拓扑异构酶II抑制剂、铂化合物、核糖体抑制剂、RNA聚合酶II抑制剂和细菌毒素。在具体实施方案中，所述化学治疗剂附着于选自以下的抗-MUC1抗体：微管抑制剂诸如美坦辛类、拓扑异构酶I抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂和DNA小沟结合剂。

在某些实施方案中，化学治疗剂是美坦辛或美坦辛类。可用于缀合的美坦辛类的具体实例包括美登醇、

在优选的实施方案中，所述化学治疗剂是(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-1,2,3,9,12,15-六氢-9-羟基-4-甲基-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(依沙替康(DX-8951))或DXd。

依沙替康(DX-8951)是由下式表示的抗肿瘤化合物：

[式1]

所述化合物可以容易地获得，例如通过在美国专利公开号US2016/0297890中描述的方法或其它已知方法，并且在位置1处的氨基可以优选用作与接头结构的连接位置。此外，依沙替康可以在接头的一部分仍与它附着的情况下释放在肿瘤细胞中。但是，即使在这样的状态下，该化合物也表现出优异的抗肿瘤作用。

DXd是由下式表示的化合物：

[式2]

由于依沙替康或DXd具有喜树碱结构，已知的是，在酸性的水性介质（例如pH 3的量级）中，平衡向具有形成的内酯环的结构（闭环）转移，而在碱性的水性介质（例如，pH 10的量级）中，平衡向具有开放的内酯环的结构（开环）转移。还预期在其中已引入对应于这样的闭环结构和开环结构的依沙替康残基的药物缀合物具有等效的抗肿瘤作用，并且不用说，任何这样的药物缀合物被包括在本发明的范围内。在某些实施方案中，所述其它试剂是蛋白质的多肽。该多肽或蛋白可以特别地融合至抗体的多肽链。在某些实施方案中，作为多肽或蛋白的其它试剂与抗体的抗体轻链的C末端融合。在其中抗体包含两条抗体轻链的实施方案中，可以将作为多肽或蛋白的其它试剂融合至两条抗体轻链的每条的C末端。在其它实施方案中，将作为多肽或蛋白的其它试剂融合至所述抗体的抗体重链的C末端。在其中抗体包含两条抗体重链的实施方案中，可以将作为多肽或蛋白的其它试剂融合至两条抗体重链的每条的C末端。所述其它试剂可以是相同的或不同的，并且特别具有相同的氨基酸序列。作为多肽或蛋白的这样的其它试剂的合适例子可以选自细胞因子、趋化因子、抗体、抗原结合片段、酶和相互作用结构域。

在某些实施方案中，作为多肽或蛋白的其它试剂是阻断和/或触发激活信号的检验点抗体。各种靶标的例子包括作为激活靶标的CD40、CD3、CD137 (4-1BB)、OX40、GITR、CD27、CD278 (ICOS)、CD154 (CD40配体)、CD270 (HVEM)和CD258 (LIGHT)，作为抑制靶标的CTLA4、PD1、CD80、CD244、A2AR、B7-H3 (CD276)、B7-H4 (VTCN1)、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA和磷脂酰丝氨酸，以及它们的相应配体诸如PDL1。在特定实例中，抗-MUC1抗体包含如本文所述的两条重链和两条轻链，其中特异性地结合CD3的scFv片段融合至每条重链的C末端；或其中特异性地结合PDL1的scFv片段融合至每条轻链的C末端。

在其它实施方案中，作为多肽或蛋白的其它试剂是免疫调节性化合物诸如趋化因子、细胞因子或生长因子。在这方面合适的细胞因子包括干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ和白介素。合适的生长因子包括G-CSF和GM-CSF。

接头的具体例子包括由下式(a)至(f)中的任一个表示的结构：

(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(d) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(e) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(f) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

[式3]

在具体实施方案中，接头包含由下式(a)至(c)中的任一个表示的结构：

(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

在优选的实施方案中，接头包含由下式(a)中的任一个表示的结构：

(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

在替代实施方案中，所述缀合物具有由下式表示的药物-接头结构，其中所述抗体通过硫醚键缀合至由下式表示的药物接头结构，星号*表示与抗体的连接点：

[式4]

在优选的实施方案中，所述缀合物具有由下式表示的药物-接头结构,

[式5]

其中AB表示抗体，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构，且所述抗体表示前述抗-MUC1抗体，优选地所述抗体是重链可变区和轻链可变区、或重链和轻链的下述组合a)至d)中的任一种：

(a) 具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区，

(b) 具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区，

(d) 具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的轻链：

在上述缀合物中，每个抗体分子的缀合药物分子（或细胞毒性剂）的数目是影响其功效和安全性的关键因素。如下进行抗体-药物缀合物（或多种缀合物）的生产：指定反应条件例如反应所用的起始原料和试剂的量，从而获得恒定数目的缀合药物分子。与低分子量化合物的化学反应不同，经常获得包含不同数目的缀合药物分子的混合物。每个抗体分子的缀合药物分子数目被定义并表示为平均值，即缀合药物分子的平均数目。除非另外指出，即，除了在代表具有特定数目的缀合药物分子的抗体-药物缀合物（其被包括在具有不同数目的缀合药物分子的抗体-药物缀合物混合物中）的情况下，根据本发明缀合药物分子的数目通常也指平均值。与抗体分子缀合的依沙替康分子或DXd的数目是可控制的，作为每个抗体的缀合药物分子的平均数，可以缀合大约1-10个依沙替康分子或1-10 DXd。依沙替康分子或DXd的数目优选为2至8，更优选为4至8，进一步优选为7至8，再进一步优选为8。应当指出，本领域技术人员基于本申请的实施例的描述可以设计用于将所需数目的药物分子缀合至抗体分子的反应，并且可以获得具有受控数目的缀合依沙替康分子的抗体-药物缀合物。

在以上优选的实施方案中，在将缀合物转移至肿瘤细胞内部之后，将接头部分切割，然后释放DXd以发挥抗肿瘤作用(Clinical Cancer Research, 2016年10月15日; 22(20):5097-5108，2016年3月29日电子公开)。

用各种放射性或非放射性同位素标记的缀合物也被包括在本发明中。构成本发明的缀合物的一个或多个原子可以含有非天然比率的原子同位素。原子同位素的例子包括氘(

核酸、表达盒、载体、细胞系和组合物

根据本发明的缀合物的抗体部分可以由核酸编码。所述核酸的核酸序列可以具有适合编码抗体的任何核苷酸序列。但是，优选地，核酸序列至少部分地调整适合于要在其中表达核酸的宿主细胞或生物的特定密码子选择，尤其是人密码子选择。核酸可以是双链或单链DNA或RNA，优选双链DNA诸如cDNA或单链RNA诸如mRNA。它可以是一个连续的核酸分子，或者它可以由几个核酸分子组成，每个核酸分子编码抗体的不同部分。PankoMab变体(PM-N54Q)的重链的核苷酸序列可以由SEQ ID NO: 17表示，且PankoMab变体(PM-N54Q)的轻链的核苷酸序列可以由SEQ ID NO: 18表示。

如果抗体由超过一条不同的氨基酸链组成，例如抗体的轻链和重链，则核酸可以例如是含有几个编码区(各自编码抗体的氨基酸链之一，优选通过诸如IRES元件的调节元件分开)的单个核酸分子以产生单独的氨基酸链，或者核酸可以由几个核酸分子组成，其中每个核酸分子包含一个或多个编码区，每个编码区编码抗体的氨基酸链之一。除了编码抗体的编码区之外，核酸还可以包含其它核酸序列或其它修饰，例如，其可以编码其它蛋白质，可以影响编码区的转录和/或翻译，可以影响核酸的稳定性或其它物理或化学性质，或者可能根本没有功能。

表达盒或载体可以包含所述核酸和与所述核酸可操作地连接的启动子。此外，表达盒或载体可以包含其它元件，特别是能够影响和/或调节核酸的转录和/或翻译、表达盒或载体的扩增和/或复制、将表达盒或载体整合到宿主细胞的基因组中、和/或宿主细胞中表达盒或载体的拷贝数的元件。合适的表达盒和包含用于表达抗体的各种表达盒的载体是在现有技术中公知的，因此这里不需要进一步描述。

宿主细胞可以包含所述核酸或所述表达盒或载体。宿主细胞可以是任何宿主细胞。它可以是分离的细胞或在组织中包含的细胞。优选地，宿主细胞是培养的细胞，特别是原代细胞或已建立的细胞系的细胞，优选肿瘤衍生的细胞。优选地，它是细菌细胞诸如大肠杆菌，酵母细胞诸如酵母属细胞，特别是酿酒酵母，昆虫细胞诸如Sf9细胞，或哺乳动物细胞，特别是人细胞诸如肿瘤衍生的人细胞，仓鼠细胞诸如CHO或灵长类动物细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞衍生自人髓样白血病细胞。优选地，其选自下列细胞或细胞系：K562、KG1、MUTZ-3或由其衍生的细胞或细胞系，或包含至少一种上述细胞的细胞或细胞系的混合物。宿主细胞优选选自NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NM H9D8-E6Q12，以及衍生自所述宿主细胞中的任一种的细胞或细胞系。这些细胞系及其性质在PCT申请WO 2008/028686 A2中详细描述。在其它实施方案中，所述宿主细胞是CHO dhfr-细胞系诸如ATCC No. CRL-9096的细胞系。在优选的实施方案中，所述宿主细胞被优化用于表达具有特定糖基化模式的糖蛋白，特别是抗体。优选地，核酸的编码区中的密码子选择和/或启动子以及表达盒或载体的其它元件与所用宿主细胞的类型相容，并且更优选地，针对所用宿主细胞的类型进行优化。优选地，由如上所述的宿主细胞或细胞系产生抗体。

产生抗体的方法可以使用本文所述的宿主细胞。该方法特别包括以下步骤：提供包含编码抗体的核酸的宿主细胞，在适合抗体表达的条件下培养宿主细胞，和获得宿主细胞表达的抗体。本文描述的抗体可以通过所述方法获得或可获得。

在另一个方面，本发明提供了包含根据本发明的缀合物的组合物。此外，该组合物可以包含一种或多种选自溶剂、稀释剂和赋形剂的其它组分。优选地，该组合物是药物组合物。在该实施方案中，组合物的组分优选都是药学上可接受的。该组合物可以是固体或流体组合物，特别是溶液(优选水溶液)、乳剂或混悬液或低压冻干粉末。

在医学中的用途

缀合物尤其可用于医学，特别是用于疾病(特别是本文所述的疾病，优选癌症、感染、炎性疾病、移植物抗宿主病和免疫缺陷)的治疗、诊断、预后、检测和/或监测。

因此，在另一个方面，本发明提供了用于医学用途的缀合物或组合物。优选地，在医学中的用途是用于疾病的治疗、预后、诊断、检测和/或监测，例如，与异常细胞生长相关的疾病例如癌症，感染诸如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染，炎性疾病诸如自身免疫疾病和炎性肠病，以及与免疫活性降低相关的疾病诸如免疫缺陷。在一个优选的实施方案中，所述疾病是癌症。

优选地，癌症具有MUC1 (TA-MUC1)的可检测表达，优选可通过免疫组织化学、ELISA、RIA、酶联免疫斑点(ELISPOT)测定、斑点印迹法、Ouchterlony测试或对流免疫电泳(CIE)或原位杂交检测。它尤其包括具有MUC1 (TA-MUC1)表达的细胞，该细胞可通过免疫组织化学或原位杂交检测。在施用抗-MUC1抗体之前，可以在MUC1 (TA-MUC1)水平测试癌症。

本发明进一步提供了包含根据本发明的缀合物的试剂盒和装置，以及可用于MUC1相关障碍诸如癌症的诊断、检测或监测的相关方法。在某些实施方案中，提供了用于测试或诊断的夹心ELISA试剂盒，其包含本发明的缀合物。该试剂盒可以进一步包含以下的一种或多种：MUC1 (TA-MUC1)蛋白标准品的溶液、着色剂、用于稀释的缓冲溶液、用于固相的抗体、用于检测的抗体和洗涤溶液等。优选地，通过应用方法诸如吸光度、荧光、发光或放射性同位素(RI)方法，可以测量与抗原结合的缀合物的量。优选地，在测量中使用吸光度平板读数器、荧光平板读数器、发光平板读数器、RI液体闪烁计数器等。

所述抗体可以用于免疫组织化学（IHC）分析。

所述免疫组织化学没有特别限制，只要该方案包括使组织切片与抗原结合抗体(第一抗体)反应和检测与所述抗原结合的第一抗体即可。

可以用根据本发明的缀合物治疗包括转移灶在内的癌症的不同形式。所述癌症尤其可以选自结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌诸如三重阴性的乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃肠癌、肾癌、头颈癌、甲状腺癌和泌尿道上皮癌。所述癌症可以进一步特别地选自胃癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌、前列腺癌和血癌。在某些实施方案中，所述癌症是转移性癌症。癌症可以包括任何类型的转移灶，诸如皮肤转移灶、淋巴结转移灶、肺转移灶、肝转移灶、腹膜转移灶、胸膜转移灶和/或脑转移灶。在某些实施方案中，癌症具有炎症性表型。在这些实施方案中，上述癌症类型中的任一种可以是炎症性癌症。

在某些实施方案中，所述病毒感染是由人免疫缺陷病毒、单纯疱疹病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、流感病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒引起。炎性疾病可以选自炎性肠病、盆腔炎性疾病、缺血性中风、阿尔茨海默氏病、哮喘、寻常型天疱疮和皮炎/湿疹。自身免疫疾病可以选自乳糜泻、I型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、白癫风、银屑病关节炎、特应性皮炎、硬皮病、结节病、原发性胆汁性肝硬化、格-巴二氏综合征、自身免疫性肝炎和强直性脊柱炎。在某些实施方案中，所述疾病包括表达MUC1、特别是TA-MUC1的细胞或与所述细胞相关。例如，待治疗的癌症是MUC1阳性的，特别是TA-MUC1阳性的，即包含表达MUC1、特别是TA-MUC1的癌细胞。

在具体实施方案中，所述缀合物用于与另一种治疗剂联合治疗，尤其是与另一种抗癌剂联合治疗癌症。所述其它治疗剂可以是任何已知的抗癌剂。可以与根据本发明的缀合物组合的合适抗癌治疗剂可以是化学治疗剂、其它抗体、免疫刺激剂、细胞因子、趋化因子和疫苗。此外，使用缀合物的疗法可以与辐射疗法、外科手术和/或传统中药组合。

可以与缀合物组合使用的抗癌剂可以选自任何化学治疗剂，特别是已知有效治疗MUC1阳性癌症的化学治疗剂。化学治疗剂的类型还取决于要治疗的癌症。组合伴侣可以选自：紫杉烷类诸如紫杉醇(泰素), 多西他赛(泰索帝)和SB-T-1214；环磷酰胺；伊马替尼；帕唑帕尼；卡培他滨；阿糖胞苷；长春瑞滨；吉西他滨；蒽环类抗生素诸如柔红霉素, 多柔比星,表柔比星, 伊达比星, 戊柔比星和米托蒽醌；芳香酶抑制剂诸如氨鲁米特, 睾内酪(Teslac), 阿那曲唑(瑞宁得), 来曲唑(弗隆), 依西美坦(阿诺新), 伏氯唑(Rivizor),福美坦(兰他隆), 法倔唑(Afema), 4-羟基雄烯二酮, 1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(ATD)和4-雄烯-3,6,17-三酮(6-氧代)；拓扑异构酶抑制剂诸如伊立替康, 托泊替康, 喜树碱,片螺素D, 依托泊苷(VP-16), 替尼泊苷, 多柔比星, 柔红霉素, 米托蒽醌, 安吖啶, 艾力替新类, 金精三羧酸和HU-331；基于铂的化学治疗剂诸如顺式-二氨络物二氯铂(II)(顺铂), 顺式-二氨络物(1,1-环丁烷二羧酸根（carboxylato）)铂(II) (卡铂)和[(1R,2R)-环己烷-1,2-二胺](乙烷dioato-O,O')铂(II) (奥沙利铂)；PARP抑制剂诸如奥拉帕利，rucaparib和niraparib；TLR激动剂诸如咪喹莫特和瑞喹莫德；和抗代谢药，尤其是抗叶酸剂诸如甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞和普拉曲沙，嘧啶类似物诸如氟尿嘧啶、吉西他滨、氟尿苷、5-氟尿嘧啶和替加氟-尿嘧啶，和嘌呤类似物，选择性雌激素受体调节剂和雌激素受体下调节剂。

此外，治疗性抗体也可用作进一步的组合伴侣。它可以是不同于抗-MUC1抗体的可用于癌症治疗的任何抗体。具体地，其它抗体已被行政机构诸如美国食品和药品管理局(FDA)、欧洲药品管理局（EMA，前身为EMEA）和Bundesinstitut für Arzneimittel undMedizinprodukte (BfArM)批准用于癌症治疗。可以用于联合治疗的其它抗体的例子是抗-EGFR抗体诸如西妥昔单抗、Tomuzotuximab、帕木单抗、扎芦木单抗、尼妥珠单抗、马妥珠单抗和奈昔木单抗；抗-HER2抗体诸如曲妥珠单抗、Timigutuzumab和培妥珠单抗；抗-VEGF抗体诸如贝伐珠单抗(阿伐他汀)；抗-CD52抗体诸如阿仑珠单抗(Campath)；抗-CD30抗体诸如brentuximab (Adcetris)；抗-CD33抗体诸如吉妥珠单抗(Mylotarg)；和抗-CD20抗体诸如利妥昔单抗(Rituxan、美罗华)、托西莫单抗(Bexxar)和替伊莫单抗(泽娃灵)。适合用于本文描述的癌症疗法组合的其它示例性抗体包括针对选自以下的抗原的抗体：Thomsen-Friedenreich抗原(TFα, TFβ), Tn, Lewis Y, CD44, 叶酸盐受体α, NeuGc-GM3神经节苷脂, DLL-3, RANKL, PTK7, Notch-3, Ephrin A4, 胰岛素-样生长因子受体1, 激活素受体-样激酶-1, 封闭蛋白-6, 二唾液酸神经节苷脂GD2, 内皮因子, 跨膜糖蛋白NMB,CD56, 肿瘤相关的钙信号转导蛋白2, 组织因子, 外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3,CD70, P-钙粘着蛋白, 间皮素, 前列腺的六跨膜上皮抗原1 (STEAP1), 癌胚抗原相关的细胞粘附分子5 (CEACAM5), 连接素4, 鸟苷酸环化酶C, 溶质载体家族44成员4(SLC44A4), 前列腺-特异性的膜抗原(PSMA), 锌转运蛋白ZIP6 (LIV1 (ZIP6)), SLIT和NTRK-样蛋白6 (SLITRK6), 滋养层糖蛋白(TPBG; 5T4), Fyn3, 碳酸酐酶9, NaPi2b, 纤连蛋白外结构域B, 内皮缩血管肽受体ETB, VEGFR2 (CD309), 腱糖蛋白c, 胶原IV和骨膜蛋白。

缀合物可以进一步与检验点抗体（即阻断或激活免疫调节性靶标的抗体）组合。由此，可以阻断针对免疫应答的抑制信号和/或可以触发激活信号。各种靶标的例子包括作为激活靶标的CD40、CD3、CD137 (4-1BB)、OX40、GITR、CD27、CD278 (ICOS)、CD154 (CD40配体)、CD270 (HVEM)和CD258 (LIGHT)，作为抑制靶标的CTLA4、PD1、CD80、CD244、A2AR、B7-H3(CD276)、B7-H4 (VTCN1)、BTLA、IDO、KIR、LAG3、TIM-3、VISTA和磷脂酰丝氨酸，以及它们的相应配体诸如PDL1。

在其它实施方案中，缀合物可以与用免疫调节性化合物诸如趋化因子、细胞因子、生长因子和疫苗的治疗组合。在这方面，合适的细胞因子包括干扰素诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ以及白介素。合适的生长因子包括G-CSF和GM-CSF。

缀合物优选地用于治疗原发性肿瘤、复发性肿瘤和/或这样的肿瘤的转移灶，并且特别地用于在外科手术之前、过程中或之后进行治疗，以及用于预防或治疗转移灶。所述缀合物特别作为辅助疗法用于治疗患者。在某些实施方案中，所述缀合物作为新辅助疗法或联合的新辅助疗法-辅助疗法用于治疗患者。此外，所述缀合物作为姑息疗法用于治疗患者。

用缀合物进行的癌症治疗优选导致肿瘤生长的抑制，特别是肿瘤尺寸的减小。此外，通过治疗防止了进一步转移的发生和/或减少了它们的数量。该治疗优选导致无进展生存期的增加；和/或寿命的增加，从而提高总存活率。

本发明进一步提供了使用根据本发明的缀合物治疗、诊断、预后、检测和/或监测疾病的方法。缀合物在药物中的应用的实施方案和实施例同样适用于医学方法。特别地，提供了一种在有此需要的受试者中治疗疾病的方法，该方法包括给所述受试者施用治疗有效量的根据本发明的缀合物。

例如，本发明提供了一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括给具有癌症的受试者施用治疗有效量的根据本发明的缀合物。在具体实施方案中，所述癌症的特征在于表达TA-MUC1。所述癌症可以选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、血癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、癌、畸胎瘤、淋巴瘤、肉瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、肾上腺癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠道癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、耳、鼻和喉(ENT)癌症、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌及其转移灶。

此外，本发明提供了一种用于诊断、检测或监测癌症的方法，所述方法包括使测试样品与根据本发明的缀合物接触的步骤。

增加MUC1结合亲和力的方法

增加抗体的MUC1结合亲和力的方法可以包含

(i) 重链可变区，其包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3，

所述方法包括下述步骤：用除了天冬酰胺以外的任何氨基酸残基置换在CDR-H2的位置8处的氨基酸残基，从而产生具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2。

要增加其MUC1结合亲和力的抗体具体地是如本文中所述的能够结合MUC1的抗体,例外是它包含在CDR-H2序列的位置8处的天冬酰胺。

在某些实施方案中，要增加其MUC1结合亲和力的抗体的重链可变区包含与SEQ IDNO: 11的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述重链可变区仍然包含具有SEQ ID NO: 1、8和3的氨基酸序列的CDR。因此，相对于SEQ ID NO: 11的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。

在某些实施方案中，要增加其MUC1结合亲和力的抗体的轻链可变区包含与SEQ IDNO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列。特别地，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%、特别是至少98%同一性的氨基酸序列。在这些实施方案中，所述轻链可变区仍然包含具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列的CDR。因此，相对于SEQ ID NO: 12的任何序列偏差位于框架区中，但不位于CDR中。具体地，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。

在具体实施方案中，要增加其MUC1结合亲和力的抗体的重链可变区具有与SEQ IDNO: 11的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO:1、8和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。具体地，所述重链可变区具有与SEQ ID NO: 11的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 1、8和3的氨基酸序列，且所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:12的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，其中所述CDR仍然具有SEQ ID NO: 4、5和6的氨基酸序列。

例如，要增加其MUC1结合亲和力的抗体是在WO 2004/065423 A2或WO 2011/012309 A1中公开的抗-MUC1抗体。具体地，要增加其MUC1结合亲和力的抗体是格替妥珠单抗（gatipotuzumab）或PankoMab。

要增加其MUC1结合亲和力的抗体具体地是如本文中所述的能够结合MUC1的抗体。

在某些实施方案中，MUC1结合如本文中所述。增加MUC1结合亲和力具体地表示至少10%、至少20%、至少33%或至少50%的增加。在优选的实施方案中，MUC1结合亲和力增加了至少50%。如在实施例中所述，特别是使用表面等离子体共振分析或switchSENSE®技术(DRX2 BIOSENSOR, 由Dynamic Biosensors GmbH制造)，例如如在实施例4a和b中所述，可以确定MUC1结合亲和力。

在某些实施方案中，通过将突变引入编码抗体的核酸实现置换在CDR-H2的位置8处的氨基酸残基的步骤，其中将突变引入编码所述氨基酸残基的密码子。引入突变可以通过任意方法完成。几种合适的方法是本领域已知的且技术人员能够执行必要的任务以引入突变。然后可以例如在宿主细胞中表达突变的核酸，得到具有增加的MUC1结合亲和力的抗体。用于生产抗体的核酸、宿主细胞和方法如本文所述且可以用于增加MUC1结合亲和力的方法。

在具体实施方案中，增加抗体的MUC1结合亲和力的方法包括以下步骤：

(a) 提供编码要增加其MUC1结合亲和力的抗体的核酸

(b) 将突变引入所述核酸以产生突变的核酸，其中将突变引入编码在CDR-H2的位置8处的氨基酸残基的密码子，使得所述密码子编码除了天冬酰胺以外的任何氨基酸残基；和

生产具有增加的MUC1结合亲和力的抗体的方法可以包含

(a) 提供编码抗体的核酸，所述抗体包含

(ii) 轻链可变区，其包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3；

关于其他方面、特别是关于增加抗体的MUC1结合亲和力的方法，本文描述的实施方案、特征和实施例也同样适用于生产具有增加的MUC1结合亲和力的抗体的方法。

在某些实施方案中，生产具有增加的MUC1结合亲和力的抗体的方法进一步包括加工具有增加的MUC1结合亲和力的抗体的步骤(d)。

例如，加工具有增加的MUC1结合亲和力的抗体可以包括从细胞培养物分离所述抗体。抗体的分离具体地表示将抗体与细胞培养物的其余组分分离。从细胞培养基中分离抗体可以例如通过色谱法进行。分离抗体的合适方法和手段是本领域已知的，并且本领域技术人员可以容易地应用。

所获得的抗体可以任选地经历进一步加工步骤，例如，修饰步骤，诸如其它试剂与抗体的化学或酶促偶联，和/或配制步骤，以产生所需质量和组成的抗体。这样的进一步加工步骤和方法是本领域中通常已知的。

在其它实施方案中，步骤(d)另外包括提供包含抗体的药物制剂的步骤。提供包含抗体的药物制剂或将抗体配制成药物组合物特别地包括交换包含抗体的组合物的缓冲溶液或缓冲溶液组分。此外，该步骤可以包括抗体的低压冻干。特别地，将抗体转移到仅包含药学上可接受的成分的组合物中。

生产方法1

可以如下生产由下面给出的式(1)表示的抗体-药物缀合物，其中抗体通过硫醚连接至接头结构：使具有巯基（其通过抗体还原从二硫键转化得到）的抗体与可通过已知方法得到(例如，可通过在专利公开文献US2016/297890中描述的方法(例如，在段落至中描述的方法)得到)的化合物(2)反应。例如，通过下述方法可以生产该抗体-药物缀合物。

[式6]

其中AB代表具有巯基的抗体(3a)，其中

L1具有由-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-表示的结构，和

L1'代表由下式表示的马来酰亚胺基。

[式7]

-L1-LX具有由下式中的任一个表示的结构：

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

，在它们中，更优选的是下述：

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)- CH

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

此外优选的是下述：

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)- CH

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(NH-DX)具有由下式表示的结构：

[式8]

且它代表通过除去依沙替康的1位氨基的一个氢原子而衍生出的基团。在上述反应方案(式8)中，式(1)的化合物可以解释为具有这样的结构：其中从药物到接头末端的一个结构部分与一种抗体连接。但是，为了方便起见给出了该描述，并且实际上在许多情况下，多个上述结构部分连接至一个抗体分子。同样内容适用于以下描述的生产方法。

具体地，通过使可通过已知方法得到(例如，可通过在专利公开文献US2016/297890中描述的方法(例如，在段落至中描述的方法)得到)的化合物(2)与具有巯基的抗体(3a)反应，可以生产抗体-药物缀合物(1)。

抗体(3a)上巯基的提供可以通过本领域技术人员众所周知的方法来完成(Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, 第56-136页, 第456-493页, AcademicPress (1996))。该方法的例子可以包括、但不限于：使Traut氏试剂与抗体的氨基反应；使N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫基烷酸酯与抗体的氨基反应，然后与羟胺反应；使N-琥珀酰亚胺基3-(吡啶基二硫基)丙酸酯与抗体反应，然后与还原剂反应；使抗体与还原剂诸如二硫苏糖醇、2-巯基乙醇或三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)反应以还原抗体中的链间二硫键，从而形成巯基。

具体地，通过使用0.3-3摩尔当量的TCEP作为抗体中每个链间二硫键的还原剂，并使该还原剂与该抗体在含有螯合剂的缓冲溶液中反应，可以获得具有部分地或完全地还原的链间二硫键的抗体。螯合剂的例子可以包括乙二胺四乙酸(EDTA)和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)。可以以1 mM至20 mM的浓度使用螯合剂。磷酸钠、硼酸钠、醋酸钠等的溶液可以用作缓冲溶液。作为具体实例，通过使抗体与TCEP在4℃至37℃下反应1-4小时，可以获得具有部分地或完全地还原的巯基的抗体(3a)。

应当指出，通过进行巯基与药物-接头部分的加成反应，可以通过硫醚键缀合药物-接头部分。

然后，对于每个具有巯基的抗体(3a)使用2-20摩尔当量的化合物(2)，可以生产抗体-药物缀合物(1)，其中每个抗体缀合2-8个药物分子。具体而言，可以将含有溶解于其中的化合物(2)的溶液添加至含有具有巯基的抗体(3a)的缓冲溶液中进行反应。在该背景下，醋酸钠溶液、磷酸钠、硼酸钠等可以用作缓冲溶液。反应的pH为5至9，更优选地，反应可以在pH 7附近进行。可以使用有机溶剂诸如二甲亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)或N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)作为溶解化合物(2)的溶剂。通过将含有以1-20%（v/v）溶解在有机溶剂中的化合物(2)的溶液添加到含有具有巯基的抗体(3a)的缓冲溶液中，可以进行反应。反应温度为0-37℃，更优选为10-25℃，且反应时间为0.5-2小时。通过灭活未反应的化合物(2)与含硫醇的试剂的反应性，可以终止反应。含硫醇的试剂是例如半胱氨酸或N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)。更具体地，可以如下终止反应：向所使用的化合物(2)中加入1-2摩尔当量的NAC，并将所获得的混合物在室温温育10-30分钟。

抗体-药物缀合物的鉴定

根据下述通用程序可以对生产的抗体-药物缀合物(例如，抗体-药物缀合物(1))进行浓缩、缓冲液交换、纯化以及抗体浓度和每个抗体分子的平均缀合药物分子数目的测量，以鉴定抗体-药物缀合物(1)。

向Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation)容器中，添加抗体或抗体-药物缀合物的溶液，并通过使用离心机(Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)离心(在2000 G至4000 G离心5-30分钟)，浓缩抗体或抗体-药物缀合物的溶液。

使用紫外检测器(Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.)，根据生产商定义的方法进行抗体浓度的测量。在这方面，使用抗体之间不同的280 nm吸收系数(1.3mLmg

根据生产商定义的方法，用含有氯化钠(50 mM)和EDTA (2 mM)的磷酸盐缓冲液(50mM, pH 6.0) (在本说明书中被称作PBS6.0/EDTA)平衡使用Sephadex G-25载体的NAP-25柱(目录号17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation)。以每个NAP-25柱2.5 mL的量应用抗体的水溶液，此后，收集用3.5 mL PBS6.0/EDTA洗脱的级分(3.5 mL)。通过通用程序A，浓缩该级分。使用通用程序B测量抗体的浓度以后，使用PBS6.0/EDTA将抗体浓度调至20 mg/mL。

用任何商购可得的缓冲溶液诸如含有山梨醇(5%)的乙酸盐缓冲液(10 mM, pH 5.5；在本说明书中被称作ABS)平衡NAP-25柱。将抗体-药物缀合物的水性反应溶液(大约2.5 mL)应用于NAP-25柱，此后，以生产商定义的量用缓冲溶液进行洗脱，从而收集抗体级分。将凝胶过滤纯化过程重复共2或3次，其中将收集的级分再次上NAP-25柱，并用缓冲溶液进行洗脱，以得到抗体-药物缀合物，其不含未缀合的药物接头和低分子量化合物(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)和二甲亚砜)。

可以如下计算抗体-药物缀合物中的缀合药物浓度：在280 nm和370 nm的2个波长测量抗体-药物缀合物的水溶液的紫外吸光度，并在此后执行下面显示的计算。

在任何给定波长的总吸光度等于在系统中存在的所有吸光化学物质的吸光度的总和[吸光度的加和性]。因此，假设抗体和药物的摩尔吸收系数不会在抗体和药物之间的缀合之前和之后发生变化，以此为基础，用下述方程式表示抗体-药物缀合物中的抗体浓度和药物浓度：

在该背景下，A

在该背景下，关于ε

除了前述“5. 通用程序E”以外，还可以使用下述方法通过高效液相色谱法(HPLC)分析确定抗体-药物缀合物中每个抗体分子的平均缀合药物分子数目。在下文中，将描述当抗体通过二硫键缀合至药物接头时通过HPLC测量平均缀合药物分子数目的方法。参照该方法，根据抗体和药物接头之间的连接方式，本领域技术人员能够通过HPLC适当地测量平均缀合药物分子数目。

将抗体-药物缀合物溶液(大约1 mg/mL, 60 μL)与二硫苏糖醇(DTT)的水溶液(100mM, 15 μL)混合。通过在37℃温育混合物30分钟，切割抗体-药物缀合物的轻链和重链之间的二硫键。将得到的样品用在HPLC分析中。

在下述测量条件下进行HPLC分析。

HPLC系统: Agilent 1290 HPLC系统(Agilent Technologies, Inc.)

检测器: 紫外吸收波谱仪(测量波长: 280 nm)

柱：ACQUITY UPLC BEH Phenyl (2.1×50 mm, 1.7 μm, 130埃; Waters Corp., P/N186002884)

柱温度: 80℃

流动相A: 含有0.10%三氟乙酸(TFA)和15%2-丙醇的水溶液

流动相B: 含有0.075%TFA和15%2-丙醇的乙腈溶液

梯度程序: 14%-36%(0 min-15 min), 36%-80%(15 min-17 min), 80%-14%(17 min-17.01 min.),和14%(17.01 min-25 min)

样品注射: 10 μL

或者

HPLC系统: Agilent 1290 HPLC系统(Agilent Technologies, Inc.)

检测器: 紫外吸收波谱仪(测量波长: 280 nm)

柱：PLRP-S (2.1×50 mm, 8 μm, 1000埃; Agilent Technologies, Inc., P/NPL1912-1802)

柱温度: 80℃

流动相A: 0.04%的TFA水溶液

流动相B: 含有0.04%TFA的乙腈溶液

梯度程序: 29%-36%(0 min-12.5 min), 36%-42%(12.5 min-15 min), 42%-29%(15min-15.1 min),和29%-29%(15.1 min-25 min)

样品注射: 15 μL

F-3-1. 根据缀合药物分子的数目，抗体的轻链和重链分别由Li和Hi表示(其中i代表缀合药物分子的数目，即，根据本发明的缀合药物分子的数目由L0、L1、H0、H1、H2、H3等表示)。

与非缀合抗体轻链(L

F-3-2. 由于药物接头吸收紫外线，因此使用轻链或重链和药物接头的摩尔吸收系数，根据以下表达式响应于缀合的药物接头分子的数目校正峰面积值。

[表达1]

与i个药物分子结合的轻链的峰面积的校正值(ALi)

i: 缀合药物分子的数目

[表达2]

与i个药物分子结合的轻链的峰面积的校正值(A

i: 缀合药物分子的数目。

在该背景下，通过已知的计算方法(Protein Science, 1995, 第4卷, 2411-2423)从每种抗体的轻链或重链的氨基酸序列估计出的值可以用作抗体的轻链或重链的摩尔吸收系数(280 nm)。通过每个药物接头与巯基乙醇或N-乙酰半胱氨酸的反应将马来酰亚胺基团转化成琥珀酰亚胺硫醚的化合物的实际测量的摩尔吸收系数(280 nm)用作药物接头的摩尔吸收系数(280 nm)。吸光度测量的波长可以由本领域技术人员适当设定，但优选为可以测量抗体峰的波长，更优选为280 nm。

F-3-3. 根据以下表达式，针对峰面积的校正值的总和计算每条链的峰面积比(%)。

[表达3]

F-3-4. 根据以下表达式计算抗体-药物缀合物中每个抗体分子的平均缀合药物分子数目。

平均缀合药物分子数目= (L

应当指出，为了确保缀合物的量，可以混合在相似的条件下生产的具有几乎相同的平均缀合药物分子数目(例如，±1的数量级)的多个缀合物，以制备新批次。在这种情况下，药物分子的平均数目落在混合之前的药物分子的平均数目之间。

具体实施方案

在下面，描述了根据本发明的缀合物的抗体部分的具体实施方案。

实施方案1. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

实施方案2. 根据实施方案1的抗体，其中在CDR-H2的位置8处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸，特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸，尤其是谷氨酰胺。

实施方案3. 根据实施方案1的抗体，其中在CDR-H2的位置8处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、色氨酸或赖氨酸。

实施方案4. 根据实施方案1-3的抗体，其中所述CDR-H2具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列。

实施方案5. 根据实施方案1的抗体，其中所述CDR-H2具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列。

实施方案6. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

实施方案7. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 9的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

实施方案8. 根据实施方案6或7的抗体，其中在CDR-H2的位置8处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸，特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸，尤其是谷氨酰胺。

实施方案9. 根据实施方案7或8的抗体，其中在CDR-H2的位置8处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、色氨酸或赖氨酸。

实施方案10. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

实施方案11. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 10的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 7的氨基酸序列的CDR-H2和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 12的氨基酸序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

实施方案12. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其具有SEQ ID NO: 9的氨基酸序列，和

(ii) 轻链可变区，其具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。

实施方案13. 根据实施方案12的抗体，其中在SEQ ID NO: 9的位置57处的氨基酸选自谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸，特别是谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸和精氨酸，尤其是谷氨酰胺。

实施方案14. 根据实施方案12的抗体，其中在SEQ ID NO: 9的位置57处的氨基酸是谷氨酰胺、组氨酸、精氨酸、色氨酸或赖氨酸。

实施方案15. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列，和

(ii) 轻链可变区，其具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。

实施方案16. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其具有由SEQ ID NO: 20或23的氨基酸编号20-136表示的氨基酸序列，和

(ii) 轻链可变区，其具有由SEQ ID NO: 21的氨基酸编号21-133表示的氨基酸序列。

实施方案17. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 15的氨基酸序列具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 2或7的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

实施方案18. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其具有SEQ ID NO: 15或SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，和

(ii) 轻链可变区，其具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列。

实施方案19. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 19的氨基酸序列具有至少90%或至少95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的CDR-H1，具有SEQ ID NO: 8的氨基酸序列的CDR-H2，和具有SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的CDR-H3，和

(ii) 轻链可变区，其

(a) 具有与SEQ ID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%或95%同一性的氨基酸序列，和

(b) 包含以下互补性决定区(CDR)：具有SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的CDR-L1，具有SEQ ID NO: 5的氨基酸序列的CDR-L2，和具有SEQ ID NO: 6的氨基酸序列的CDR-L3。

实施方案20. 一种能够结合MUC1的抗体，其包含

(i) 重链可变区，其具有由SEQ ID NO: 19的氨基酸编号20-460表示的氨基酸序列，和

(ii) 轻链可变区，其具有由SEQ ID NO: 16的氨基酸编号21-239表示的氨基酸序列。

实施方案21. 根据实施方案1-20中的任一项的抗体，其中所述抗体包含至少一条重链，所述重链包含重链可变区、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。

实施方案22. 根据实施方案1-20中的任一项的抗体，其中所述抗体包含两条重链，每条重链包含重链可变区、CH1结构域、铰链区、CH2结构域和CH3结构域。

实施方案23. 根据实施方案21或22的抗体，其中所述抗体是IgG-型抗体，尤其是IgG1、IgG2或IgG4-型抗体。

实施方案24. 根据实施方案1-23中的任一项的抗体，其中所述抗体包含至少一条轻链，所述轻链包含轻链可变区和CL结构域。

实施方案25. 根据实施方案1-23中的任一项的抗体，其中所述抗体包含两条轻链，每条轻链包含轻链可变区和CL结构域。

实施方案26. 根据实施方案24或25的抗体，其中所述轻链是κ-型轻链。

实施方案27. 根据实施方案1-26中的任一项的抗体，其中所述抗体在CH2结构域中不包含N-糖基化位点。

实施方案28. 根据实施方案1-26中的任一项的抗体，其中所述抗体在抗体重链的CH2结构域中包含N-糖基化位点。

实施方案29. 根据实施方案28的抗体，其中所述抗体具有的糖基化模式具有一个或多个下述特征：

(i) 携带二等分GlcNAc残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的至少0.5%；

(ii) 携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的至少30%；

(iii) 携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的至少60%。

实施方案30. 根据实施方案28的抗体，其中所述抗体具有的糖基化模式具有一个或多个下述特征：

(i) 携带二等分GlcNAc残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的至少0.5%；

(ii) 携带至少一个半乳糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的至少30%；

(iii) 携带核心岩藻糖残基的聚糖的相对量为组合物中与抗体的糖基化位点附接的聚糖的总量的40%或更少。

在下面，描述了根据本发明的缀合物的具体实施方案。

实施方案31. 根据实施方案1-30中的任一项的抗体，其包含与其缀合的其它试剂，优选细胞毒性剂。

实施方案32. 根据实施方案31的抗体，其中所述细胞毒性剂是与抗体偶联的化学治疗剂。

实施方案33. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂选自微管抑制剂诸如美坦辛类、拓扑异构酶I抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂和DNA小沟结合剂。

实施方案34. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂选自美登醇、

实施方案35. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂选自吡咯并苯并二氮杂环庚三烯(PBD)、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯二聚体(PBD二聚体)、多卡米星、多卡米星-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(DUBA)、开环-多卡米星-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(开环-DUBA)和多柔比星。

实施方案36. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂选自吲哚啉并苯并二氮杂环庚三烯（indolinobenzodiazepine）和噁唑烷并苯并二氮杂环庚三烯（oxazolidinobenzodiazepine）。

实施方案37. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂是卡奇霉素。

实施方案38. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂选自喜树碱, 7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)、(S)-9-二甲基氨基甲基-10-羟喜树碱(托泊替康)、(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-1,2,3,9,12,15-六氢-9-羟基-4-甲基-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(依沙替康(DX-8951))和DXd。

实施方案39. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂是由下式表示的抗肿瘤化合物：

[式1]

实施方案40. 根据实施方案32的抗体，其中所述化学治疗剂是由下式表示的抗肿瘤化合物：

[式2]

实施方案41. 根据实施方案31的抗体，其中另外作为多肽或蛋白的其它试剂与抗体的多肽链融合。

实施方案42. 根据实施方案41的抗体，其中所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，且作为多肽或蛋白的其它试剂融合至所述抗体重链的每个C末端或融合至所述抗体轻链的每个C末端。

实施方案43. 根据实施方案41或42的抗体，其中所述其它试剂选自细胞因子、趋化因子、其它抗体、抗原结合片段、酶和结合结构域。

实施方案44. 根据实施方案42的抗体，其中所述其它试剂是特异性地结合CD3的scFv片段，且所述其它试剂之一融合至每条抗体重链的C末端。

实施方案45. 根据实施方案42的抗体，其中所述其它试剂是特异性地结合PDL1的scFv片段，且所述其它试剂之一融合至每条抗体轻链的C末端。

实施方案46. 根据实施方案31-45的抗体，其中所述细胞毒性剂、优选拓扑异构酶I抑制剂诸如DX-8951或DXd通过接头与其缀合，所述接头具有选自下式(a)至(f)的任何结构：

(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(d) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(e) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(f) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

其中所述抗体连接至-(琥珀酰亚胺-3-基-N)的末端，所述抗肿瘤化合物连接至在式(a)至(f)的最右侧的-(CH

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-具有由下式表示的结构：

[式3]

其在位置3处连接至抗体并且在位置1处的氮原子上连接至含有该结构的接头结构中的亚甲基。

实施方案47. 一种缀合物，其包含缀合至细胞毒性剂的根据实施方案1-30中的任一项的抗体。

实施方案48. 根据实施方案47的缀合物，其中所述细胞毒性剂是化学治疗剂。

实施方案49. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂选自微管抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂和DNA小沟结合剂。

实施方案50. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂选自美登醇、

实施方案51. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂选自吡咯并苯并二氮杂环庚三烯(PBD)、吡咯并苯并二氮杂环庚三烯二聚体(PBD二聚体)、多卡米星、多卡米星-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(DUBA)、开环-多卡米星-羟基苯甲酰胺-氮杂吲哚(开环-DUBA)和多柔比星。

实施方案52. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂选自吲哚啉并苯并二氮杂环庚三烯（indolinobenzodiazepine）和噁唑烷并苯并二氮杂环庚三烯（oxazolidinobenzodiazepine）。

实施方案53. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂是卡奇霉素。

实施方案54. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂选自喜树碱, 7-乙基-10-羟基-喜树碱(SN-38)、(S)-9-二甲基氨基甲基-10-羟喜树碱(托泊替康)、(1S,9S)-1-氨基-9-乙基-5-氟-1,2,3,9,12,15-六氢-9-羟基-4-甲基-10H,13H-苯并[de]吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-10,13-二酮(依沙替康(DX-8951))和DXd。

实施方案55. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂是由下式表示的抗肿瘤化合物：

[式1]

实施方案56. 根据实施方案48的缀合物，其中所述化学治疗剂是由下式表示的抗肿瘤化合物：

[式2]

实施方案57. 根据实施方案47的缀合物，其中作为多肽或蛋白的其它试剂与抗体的多肽链融合。

实施方案58. 根据实施方案57的缀合物，其中所述抗体包含两条抗体重链和两条抗体轻链，且作为多肽或蛋白的其它试剂融合至所述抗体重链的每个C末端或融合至所述抗体轻链的每个C末端。

实施方案59. 根据实施方案57或58的缀合物，其中所述其它试剂选自细胞因子、趋化因子、其它抗体、抗原结合片段、酶和结合结构域。

实施方案60. 根据实施方案58的缀合物，其中所述其它试剂是特异性地结合CD3的scFv片段，且所述其它试剂之一融合至每条抗体重链的C末端。

实施方案61. 根据实施方案58的缀合物，其中所述其它试剂是特异性地结合PDL1的scFv片段，且所述其它试剂之一融合至每条抗体轻链的C末端。

实施方案62. 根据实施方案47-61中的任一项的缀合物，其中所述抗体通过接头缀合至其它试剂或化学治疗剂，优选拓扑异构酶I抑制剂诸如DX-8951或DXd，所述接头具有选自下式(a)至(f)的任何结构：

(a) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(b) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(d) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(e) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

(f) -(琥珀酰亚胺-3-基-N)-CH

其中所述抗体连接至-(琥珀酰亚胺-3-基-N)的末端，所述抗肿瘤化合物连接至在式(a)至(f)的最右侧的-(CH

-(琥珀酰亚胺-3-基-N)-具有由下式表示的结构：

[式3]

其在位置3处连接至抗体并且在位置1处的氮原子上连接至含有该结构的接头结构中的亚甲基。

实施方案63. 根据实施方案47-61中的任一项的缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段通过硫醚键缀合至由下式表示的药物接头(其中星号*代表与抗体的连接点)，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区或重链和轻链的下述组合a)至f)中的任一种：

(a) 具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区，

(b) 具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区，

(d) 包含SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的重链和包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的轻链。

(e) 具有由SEQ ID NO: 15或22的氨基酸编号1-446表示的氨基酸序列的重链和具有由SEQ ID NO: 16的氨基酸编号1-219表示的氨基酸序列的轻链，和

(f) 具有由SEQ ID NO: 19的氨基酸编号1-446表示的氨基酸序列的重链和具有由SEQID NO: 16的氨基酸编号1-219表示的氨基酸序列的轻链：

[式4]

实施方案64. 由下式表示的缀合物或抗体，

[式5]

其中AB表示抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO: 10的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，且y是在1-10的范围内，在2-8的范围内，在3-8的范围内，在7-8的范围内，或在7.5-8的范围内，且所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构。

实施方案65. 由下式表示的缀合物或抗体，

[式5]

其中AB表示抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO: 11的氨基酸序列的重链可变区和具有SEQ ID NO: 12的氨基酸序列的轻链可变区，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，且y是在1-10的范围内，在2-8的范围内，在3-8的范围内，在7-8的范围内，或在7.5-8的范围内，且所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构。

实施方案66. 由下式表示的缀合物或抗体，

[式5]

其中AB表示抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO: 15或22的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的轻链，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，且y是在1-10的范围内，在2-8的范围内，在3-8的范围内，在7-8的范围内，或在7.5-8的范围内，且所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构。

实施方案67. 由下式表示的缀合物或抗体，

[式5]

其中AB表示抗体，所述抗体包含具有SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的重链和具有SEQID NO: 16的氨基酸序列的轻链，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，且y是在1-10的范围内，在2-8的范围内，在3-8的范围内，在7-8的范围内，或在7.5-8的范围内，且所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构。

实施方案68. 根据实施方案31-67中的任一项的缀合物或抗体，其中所述抗体包含选自以下的一种或多种修饰：去岩藻糖基化，减少的岩藻糖，N-连接的糖基化，O-连接的糖基化，N-端加工，C-端加工，脱酰胺化，天冬氨酸的异构化，甲硫氨酸的氧化，在重链的位置234和235处2个亮氨酸(L)残基向丙氨酸(A)的置换(LALA)，脯氨酸残基的酰胺化，和在羧基端的一个或两个氨基酸的缺失或缺少。

实施方案69. 根据实施方案68的缀合物或抗体，其中所述抗体包含在重链的羧基端处的1个或2个氨基酸的缺失或缺少。

实施方案70. 根据实施方案69的缀合物或抗体，其中所述抗体包含两条重链，它们二者缺少一个羧基端氨基酸残基。

实施方案71. 由下式表示的缀合物或抗体，

[式5]

其中AB表示抗体，所述抗体包含具有由SEQ ID NO: 15或22的氨基酸编号1-446表示的氨基酸序列的重链和具有由SEQ ID NO: 16的氨基酸编号1-219表示的氨基酸序列的轻链，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，且y是在1-10的范围内，在2-8的范围内，在3-8的范围内，在7-8的范围内，或在7.5-8的范围内，且所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构。

实施方案72. 由下式表示的缀合物或抗体，

[式5]

其中AB表示抗体，所述抗体包含具有由SEQ ID NO: 19的氨基酸编号1-446表示的氨基酸序列的重链和具有由SEQ ID NO: 16的氨基酸编号1-219表示的氨基酸序列的轻链，y表示与抗体自身缀合的药物-接头结构的平均单元数，且y是在1-10的范围内，在2-8的范围内，在3-8的范围内，在7-8的范围内，或在7.5-8的范围内，且所述抗体通过硫醚键缀合至由上式表示的药物接头结构。

实施方案73. 根据实施方案31-72中的任一项的缀合物或抗体，其中每个抗体分子的缀合药物分子数目为8。

实施方案74. 一种药物组合物，其包含根据实施方案31-73中的任一项的抗体或缀合物和选自溶剂、稀释剂和赋形剂的一种或多种其它组分。

实施方案75. 用于用在药物中的根据实施方案31-73中的任一项的抗体或缀合物或根据实施方案74的药物组合物。

实施方案76. 用于以下疾病的治疗、预后、诊断和/或监测的根据实施方案31-73中的任一项的抗体或缀合物或根据实施方案74的药物组合物：与异常细胞生长相关的疾病诸如癌症；感染诸如细菌、病毒、真菌或寄生虫感染；炎性疾病诸如自身免疫疾病和炎性肠病；以及与免疫活性降低相关的疾病诸如免疫缺陷。

实施方案77. 用于治疗癌症、尤其是表达TA-MUC1的癌症的根据实施方案76的抗体, 缀合物或药物组合物，其中所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、血癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、癌、畸胎瘤、淋巴瘤、肉瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、肾上腺癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠道癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、耳、鼻和喉(ENT)癌症、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌及其转移灶。

实施方案78. 用于治疗感染的根据实施方案76的抗体、缀合物或药物组合物，其中所述感染选自细菌感染、病毒感染、真菌感染和寄生虫感染。

实施方案79. 用于治疗自身免疫疾病的根据实施方案76的抗体、缀合物或药物组合物，其中所述自身免疫病选自乳糜泻、I型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化、银屑病、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮。

实施方案80. 一种在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括给具有癌症、尤其是表达TA-MUC1的癌症的受试者施用治疗有效量的根据实施方案31-73中的任一项的缀合物或抗体或根据实施方案74的组合物。

实施方案81. 根据实施方案80的用于治疗癌症的方法，其中所述癌症选自卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、结肠癌、胃癌、肝癌、肾癌、血癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、癌、畸胎瘤、淋巴瘤、肉瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、肾上腺癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠道癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、耳、鼻和喉(ENT)癌症、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌及其转移灶。

图

图1显示了抗-MUC1抗体与不同MUC1肽的ELISA结合曲线。（A）显示了缺乏Fab糖基化的PankoMab N54Q (PM-N54Q)和包含Fab糖基化的PankoMab（PM）与包含表位序列PDTR的MUC1肽的抗原结合。MUC1肽的苏氨酸被Tn、sTn、TF或sTF糖基化。（B）显示了PankoMab和PM-N54Q与包含表位序列变体PESR的MUC1肽的结合。MUC1肽的丝氨酸被Tn糖基化。（C）显示了PM-N54Q与包含表位序列PDTR的MUC1肽的结合。MUC1肽的苏氨酸被Tn糖基化或未被糖基化。（D）显示了与从瞬时转染的细胞的细胞培养上清液稀释的包含Fab糖基化的PankoMab相比，几种N54X变体与Tn-PDTR MUC1肽的结合。（E）显示了与在Tn-PDTR、TF-PDTR上具有Fab糖基化的PankoMab和未糖基化的PDTR MUC1肽相比，三种没有Fab糖基化的纯化的N54X变体的结合曲线。（F）显示了与具有Fab糖基化的PankoMab相比，PM-N54Q的两种框架变体与Tn-PDTRMUC1肽的结合。对于框架变体mf-a，在VH中突变了九个氨基酸且在VL框架中突变了三个氨基酸，对于mf-b，在VH中也突变了九个氨基酸且在VL框架中突变了四个氨基酸。

图2显示了抗-MUC1抗体PM和PM-N54Q与糖基化的PDTR-MUC1肽的表面等离子体共振(Biacore)结合。将不同浓度的PM-N54Q和PankoMab的最大结合信号相对于抗体浓度作图。

图3显示了在DRX仪器上的荧光接近感应的结果。显示了缔合和解离曲线。（A）具有Fab糖基化的PM相对于（B）没有Fab糖基化的PM-N54Q。

图4显示了在非还原（左）和还原（右）条件下对PM-N54Q和PankoMab进行电泳分离的SDS丙烯酰胺凝胶。泳道1：捕获步骤后的PM-N54Q；泳道2：抛光步骤后的PM-N54Q；泳道3：捕获步骤后的PankoMab；泳道4：抛光步骤后的PankoMab；泳道5：分子量标记。

图5显示了等电聚焦测定的考马斯蓝染色的凝胶，其中PM-N54Q缺乏Fab糖基化且PankoMab被Fab糖基化。泳道1：具有Fab糖基化的PankoMab；泳道2：没有Fab糖基化的PM-N54Q。

图6显示抗-MUC1抗体结合Fcγ受体IIIa。抗体PM-N54Q或PankoMab的浓度增加会从装载了FcγRIIIa的供体珠子替换兔-抗-小鼠偶联的受体珠子，从而降低检测到的化学发光。在图6A中低岩藻糖基化抗体和在图6B中高岩藻糖基化抗体被应用到测定中。

图7显示了通过流式细胞计量术分析的抗-MUC1抗体PM-N54Q、PM-N54D和具有Fab糖基化的PM与肿瘤细胞系(A) CaOV-3和(B) HSC-4的结合。

图8显示了A）对照hIgG-ADC、裸PankoMab和PankoMab-ADC对具有TA-MUC1蛋白表达的癌细胞系MDA-MB-468的细胞毒性活性，B）对照hIgG-ADC、裸PankoMab和PankoMab-ADC对没有TA-MUC1蛋白表达的癌细胞系HCT-15的细胞毒性活性，C）对照hIgG-ADC、裸PankoMab、PankoMab-ADC、裸PM-N54Q和PM-N54Q-ADC对具有TA-MUC1蛋白表达的癌细胞系NCI-H441的细胞毒性活性，D）对照hIgG-ADC、裸PankoMab PankoMab-ADC、裸PM-N54Q和PM-N54Q-ADC对具有TA-MUC1蛋白表达的癌细胞系HPAC的细胞毒性活性。将细胞用每种化合物处理6天，并通过ATP测定法计算细胞生存率(%)。数据代表平均值±SD (N = 3)。

图9显示了对照hIgG-ADC、裸PankoMab和PankoMab-ADC对带有MDA-MB-468的裸鼠的抗肿瘤效力。将3 mg/kg剂量的对照hIgG-ADC、裸PankoMab和PankoMab-ADC或媒介物（乙酸盐缓冲溶液）单剂量静脉内施用进带有MDA-MB-468的裸鼠(N = 6/组)。估计肿瘤体积的数据代表平均值±SEM。箭头显示了施用时机。通过Student t-检验将在施用PankoMab-ADC后21天的估计肿瘤体积与对照hIgG-ADC的值或裸PankoMab治疗组的值进行对比。***P <0.001。

图10显示了对照hIgG-ADC、裸PankoMab和PankoMab-ADC对带有HCC70的裸鼠的抗肿瘤效力。将10 mg/kg剂量的对照hIgG-ADC、裸PankoMab和PankoMab-ADC或媒介物(乙酸盐缓冲溶液)单剂量静脉内施用进带有HCC70的裸鼠(N = 6/组)。估计肿瘤体积的数据代表平均值±SEM。箭头显示了施用时机。通过Student t-检验将在施用PankoMab-ADC后21天的估计肿瘤体积与对照hIgG-ADC或裸PankoMab治疗组的值进行对比。***P < 0.001。

图11显示了对照hIgG-ADC、裸PM-N54Q、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC对带有HPAC的裸鼠的抗肿瘤效力。将10 mg/kg剂量的对照hIgG-ADC、裸PM-N54Q、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC或媒介物(乙酸盐缓冲溶液)单剂量静脉内施用进带有HPAC的裸鼠(N = 6/组)。估计肿瘤体积的数据代表平均值±SEM。箭头显示了施用时机。通过Dunnett氏检验将在PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC施用后21天的估计肿瘤体积与对照hIgG-ADC治疗组的值进行对比。***P < 0.001。

图12显示了对照hIgG-ADC、裸PankoMab、裸PM-N54Q、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC对带有NCI-H441的裸鼠的抗肿瘤效力。将10 mg/kg剂量的裸PankoMab、裸PM-N54Q、3 mg/kg剂量的对照hIgG-ADC、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC或媒介物(乙酸盐缓冲溶液)单剂量静脉内施用进带有NCI-H441的裸鼠(N = 6/组)。估计肿瘤体积的数据代表平均值±SEM。箭头显示了施用时机。通过Dunnett氏检验将在PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC施用后31天的估计肿瘤体积与对照hIgG-ADC治疗组的值进行对比。***P < 0.001。

图13显示了对照hIgG-ADC、裸PankoMab、裸PM-N54Q、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC对带有OVCAR-5的裸鼠的抗肿瘤效力。将10 mg/kg剂量的对照hIgG-ADC、裸PankoMab、裸PM-N54Q、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC或媒介物(乙酸盐缓冲溶液)单剂量静脉内施用进带有OVCAR-5的裸鼠(N = 6/组)。估计肿瘤体积的数据代表平均值±SEM。箭头显示了施用时机。通过Dunnett氏检验将PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC施用后14天的估计肿瘤体积与对照hIgG-ADC治疗组的值进行对比。通过Student t-检验将在PM-N54Q-ADC施用后14天的估计肿瘤体积与PankoMab-ADC治疗组的值进行对比。***P < 0.001。

图14显示了对照hIgG-ADC、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC对带有HCT-15的裸鼠的抗肿瘤效力。将10 mg/kg剂量的对照hIgG-ADC、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC或媒介物(乙酸盐缓冲溶液)单剂量静脉内施用进带有HCT-15的裸鼠(N = 6/组)。估计肿瘤体积的数据代表平均值±SEM。箭头显示了施用时机。通过Dunnett氏检验将在PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC施用后21天的估计肿瘤体积与对照hIgG-ADC治疗组的值进行对比。***P <0.001。

图15显示了人源化抗体PM N54Q的重链的氨基酸序列(SEQ ID No: 15，其中在位置57处的氨基酸是Gln, 即SEQ ID No: 22)。

图16显示了人源化抗体PM N54Q和PankoMab的轻链的氨基酸序列(SEQ ID No:16)。

图17显示了人源化抗体PankoMab的重链的氨基酸序列(SEQ ID No: 19)。

图18显示了嵌合抗体PM N54Q的重链的氨基酸序列(SEQ ID No: 20，其中在位置76处的氨基酸是Gln, 即SEQ ID No: 23)。

图19显示了嵌合抗体PM N54Q的轻链的氨基酸序列(SEQ ID No: 21)。

实施例

实施例1：

通过将根据Kabat/Eu编号系统的Asn54 (SEQ ID NO: 11中的氨基酸位置57)的密码子突变为除了Asn以外的任何氨基酸（特别是Gln）的密码子，修饰人源化的PankoMab抗体的重链的核酸序列(参见，例如，WO 2011/012309)。

将包含突变的抗体的γ1-型重链和κ-型轻链的编码序列的载体转染进人髓样白血病衍生的细胞系NM-H9D8 (DSM ACC2806)中。在得到的克隆中表达在VH和VL的框架序列中包含N54X突变或氨基酸突变的不同αMUC1-抗体(PankoMab N54X/PM-N54X，其中X是除了N/Asn以外的任何氨基酸)，从而生产具有人糖基化模式的构建体。将上清液中的αMUC1-抗体的浓度使用蛋白A包被的针通过Octet测量来确定，或在蛋白A色谱法纯化后通过UV280吸光度来定量。通过抗原-ELISA确定不同αMUC1-抗体的结合特征(参见实施例2)，并且还通过Scatchard分析(参见实施例3)、通过Biacore (参见实施例4a)、通过DRX

另外，还在表达具有岩藻糖减少的抗体的人髓样白血病衍生的细胞系NM-H9D8-E6Q12 (DSM ACC2856)中表达PM-N54Q和具有Fab-糖基化的非突变PankoMab。与在NM-H9D8中表达的相同抗体一起，将这些抗体纯化并关于它们与Fcγ受体III A的结合行为在实施例6中进行分析。

2)在CHO细胞系中生产抗-MUC1抗体

将由ThermoFisher scientific的GeneArtTM 合成的PM-N54Q编码序列(由SEQ ID NO:17表示的PM-N54Q的重链的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 18表示的PM-N54Q的轻链的核苷酸序列)克隆进表达载体中并将得到的质粒电转染进CHO细胞中。将合并的在选择压力下生长的细胞应用于用一般规程制造PM-N54Q突变体抗体。为实施例8和9使用在CHO细胞系中生产的抗-MUC 1抗体(PM-N54Q)。

通过已知方法诸如WO 2014/057687和WO 2015/115091，生产PankoMab-GEX（它表示在CDR2-H2中包含糖基化位点(Fab糖基化)的人源化的抗-TA-MUC1单克隆抗体）和PM-N54Q（它表示缺少Fab糖基化的人源化抗-TA-MUC1单克隆(实施例1-1)）、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC。PankoMab-GEX抗体包含含有SEQ ID NO: 19的重链和含有SEQ ID NO: 16的轻链，因而PankoMab-GEX抗体连接至式2的药物-接头。上述的PM-N54Q抗体包含含有SEQ ID NO: 15的重链和含有SEQ ID NO: 16的轻链，因而PM-N54Q抗体连接至式2的药物-接头。

[式2]

这样的PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC结构显示于下式5 (y: 每个抗体分子的缀合药物分子数目是4-8，即，每个抗体的平均缀合药物分子数目(y) : 大约8)，AB代表PankoMab或PM-N54Q。

[式5]

对照hIgG-ADC由人源化的IgG1同种型对照单克隆抗体组成，不结合哺乳动物细胞，和与PnakoMab-ADC和PM-N54Q-ADC相同的药物-接头。通过已知方法诸如WO 2014/057687和WO2015/115091生产ADC净荷(DXd)。

实施例2:

将PankoMab N54X（其中在Fab部分中的N-糖基化位点被敲除）的抗原结合特征与在其Fab部分中具有N-糖基化位点的PankoMab进行了对比。在ELISA研究中使用不同地糖基化的和未糖基化的MUC1-衍生的串联重复肽分析了MUC1-特异性抗体PankoMab的Fab-去糖基化形式(PM-N54Q)相对于(糖基化的) PankoMab-GEX®的结合特征。大体而言，借助于与在T处具有不同糖基化的糖基化的PDTR肽(APPAHGVTSAPD-T(X)-RPAPGSTAPPAHGVTSA)的结合，两种抗体表现出相同的等级：观察到与携带Galß1-3GalNAc

但是，与PankoMab-GEX®相比，在使用携带GalNAc

与在PDT(Tn)R-肽处相比，两种抗体表现出强烈减少的与在丝氨酸处具有Tn糖基化的MUC1肽变体APPAHGVTSAPE-S(Tn)-RPAPGSTAPPAHGVTSA的结合。但是，在这里，Fab-去糖基化的PM-N54Q也比PankoMab-GEX®显著更强地结合(图1B)。

将不同的其它Fab-去糖基化的PM-N54X变体与在其Fab部分中具有N-糖基化的PankoMab进行了对比。首先，在没有纯化的情况下，从上清液直接对比了所有变体。通过Octet确定浓度。所有的PM-N54X变体比Fab-糖基化的PM更好地结合。另外，依赖于氨基酸侧链的化学性能的明显趋势是可见的。在侧链处的羧酸基团表现出最低的结合增强。对于具有1个或2个氮(作为伯胺或仲胺)的氨基酸，观察到最好结合(图1D)。

另外，将选择的Fab-去糖基化的变体(PM-N54H, -W,和-Q)通过蛋白A色谱法进行纯化并在ELISA上分析(图1E)。与具有Fab-糖基化的PankoMab相比，与TF-MUC1肽和与Tn-MUC1肽的结合的改善分别是约5-8倍和约2-3倍。

此外，在ELISA中分析了PM-N54Q的两种不同框架变体与Tn-糖基化的PDTR-MUC1肽的结合(参见图1F)。框架变体mf-a携带在VH中的9个氨基酸突变和在VL框架中的3个氨基酸突变；变体mf-b也携带在VH中的9个氨基酸突变和在VL框架中的4个氨基酸突变。两种突变的变体表现出与PM-N54Q抗体相比类似的结合。

实施例3:

对于抗体的治疗适合性而言，两个因素是特别重要的：抗体在肿瘤细胞上的亲和力和结合位点的数目。

与Fab-糖基化的PankoMab-GEX®相比，通过在人乳癌细胞系ZR-75-1和MCF-7上的饱和结合分析，使用放射性地标记的抗体评价了MUC1-特异性抗体PankoMab (PM-N54Q)的Fab-去糖基化形式在TA-MUC-1阳性的人肿瘤细胞系上的结合。在50 mM碳酸钠、150 mMNaCl（pH 8.7）中将所述抗体与12倍摩尔过量的p-SCN-苄基-DTPA在37℃螯合2 h，随后在2-8℃温育过夜。经脱盐柱和死端式过滤(50 kDa截止, 6x缓冲液交换至PBS)除去游离螯合剂。在6 mM磷酸盐、1.6 mM KCl、80 mM NaCl、0.2 M乙酸钠、0.1 M HCl中将螯合的抗体用不含载体的

表1: 在MUC1

实施例4a:表面等离子体共振

通过表面等离子体共振分析(Biacore)评价了MUC1-特异性抗体PankoMab的Fab-去糖基化形式(PM-N54Q)在TA-MUC-1衍生的糖基化的肽上的结合。将抗生蛋白链菌素传感器芯片用生物素化的TA-MUC1肽(Tn糖基化或未糖基化)包被。将PankoMab和PM-N54Q在HPS-EP中从3,600 nM至4.9 nM依次1:3稀释。以50µL/min注射稀释液。将每种浓度的最大结合分别确定为应答单元(RU)，并使用“单位点特异性结合”用GraphPad Prism评价。图2显示了与PankoMab-GEX®相比用PM-N54Q得到的结合曲线。为PM-N54Q和PankoMab-GEX®分别计算出388 nM和652 nM的亲和力(K

实施例4b:

一种确定结合常数和亲和力的新方法是使用印迹在芯片上的单链DNA (96聚体)和与配体偶联的互补DNA的荧光接近感应。在本研究中，将抗生蛋白链菌素用作配体来捕获生物素化的TA-MUC1肽。PankoMab与肽的结合导致荧光变化。在缔合和解离期间可以计算缔合和解离速率。由于更高的灵敏度，可以监测到与表面等离子体共振相比更快的相互作用。这导致不同于SPR的结合动力学，但是与“黄金标准”方法KinExA（在液体系统中测量）更相当。

将PankoMab和PM-N54Q在PE140缓冲液中在1:9阶梯中从300 nM稀释至3.67 nM，并应用于芯片结合的肽。通过单-指数总体拟合(仪器软件)评价结合曲线。PM和PM-N54Q的结合曲线示例地显示在图3A和B中。PankoMab变体的计算亲和力显示在表2中：

表2: PankoMab变体对抗原肽的解离常数

实施例5:

使用非还原和还原SDS-PAGE来分析抗体的纯度和身份。在非还原凝胶中的谱带图谱显示约160 kDa的主要泳带，以及重链和轻链及其组合的系统伪像(~25, 50-55, 75, 110,135 kDa)。还原凝胶显示在25和50-55 kDa处的独特轻链和重链泳带。如预期的那样，由于缺少Fab糖基化，PM-N54Q具有更小的重链（参见图4右）。

电荷概况明显不同，如等电聚焦(IEF；参见图5)所示。Fab糖基化是显著唾液酸化，而Fc糖基化是仅最小程度地唾液酸化。因此，PankoMab-GEX®具有比PM-N54Q带更多电荷的异形体，反映了它在Fab部分中带负电荷的唾液酸的更高水平。

实施例6:

FcγRIIIa (CD16a)的FcγR结合测定是基于PerkinElmer的AlphaScreen®技术。AlphaScreen®平台依赖于PerkinElmer的基于珠子的简单技术，并且由于无需洗涤步骤，因此是传统ELISA的更有效替代方法。

对于受体结合测定，用Ni-螯合物供体珠子捕获His-标记的FcγRIIIa(Glycotope GmbH)。抗-MUC1抗体和兔-抗-小鼠偶联的受体珠子竞争与FcγR的结合。在FcγR与兔-抗-小鼠-结合的受体珠子相互作用的情况下，供体和受体珠子非常接近，这在680nm的激光激发下导致发光。在没有竞争对手的情况下获得了最大信号(信号

如在图6A和B中所示，FcγRIIIa结合亲和力对于PankoMab N54Q和PankoMab而言是相当的，由此在图A中将低岩藻糖基化抗体和在图B中将高岩藻糖基化抗体应用于测定中。因此，Fab糖基化的去除不影响抗体的受体相互作用。

实施例7: 与细胞TA-MUC1的结合

将N54Q和N54D通过蛋白A色谱法瞬时表达和纯化。使用两种不同的癌细胞系，将两种变体与细胞表面TA-MUC1的结合与具有Fab糖基化的PM进行对比。舌鳞状细胞癌系HSC-4中等程度表达TA-MUC1，而卵巢癌细胞系CaOV-3高度表达。用系列稀释的抗体温育肿瘤细胞，并使用藻红蛋白-缀合的山羊抗-人IgG (重链和轻链)抗体检测结合的抗体。包括人IgG对照以控制背景染色。通过流式细胞计量术分析结合。

与人IgG1对照相比，分析的构建体PM、PM-N54Q和PM-N54D显示出与表达TA-MUC1的HSC-4和CaOV-3细胞的强烈且特异性结合（图7）。PM-N54D与TA-MUC1

实施例8: PankoMab

将人乳腺癌细胞系MDA-MB-468、人胰腺癌细胞系HPAC和人肺癌细胞系NCI-H441用作中至高表达TA-MUC1的细胞。将人结直肠癌细胞系HCT-15用作TA-MUC1阴性细胞。这些细胞系购自ATCC。根据指导手册培养每种细胞系。通过流式细胞计量术证实TA-MUC1在每种癌细胞系上的表达水平。

通过使用培养基将MDA-MB-468混悬液制备成具有1.25 x 10

通过使用培养基将HCT-15混悬液制备成具有3.1 x 10

在次日，将裸PankoMab、对照hIgG-ADC和PankoMab-ADC用各培养基从500 nM至0.2nM进行3倍系列稀释。将20微升这些稀释的溶液加入适当的孔(终浓度: 100 nM至0.04nM)。对于空白孔和未处理的孔，将20 uL单独的每种培养基加入孔。将所有平板在每种细胞系的适当条件下温育6天。

温育以后，使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega)测量每个孔中的ATP的量。通过多标记计数器(ARVO X3, PerkinElmer Japan Co., Ltd.)测量发光。一式三份地进行该测定。

通过下述方程式计算每个样品的细胞生存率：

细胞生存率(%) = 100 x (T - B)/(C - B)

T: 测试孔的发光强度

C: 未处理的孔的平均发光强度

B: 空白孔的平均发光强度。

通过使用培养基将HPAC混悬液制备成具有1.25 x 10

通过使用培养基将NCI-H441混悬液制备成具有1.25 x 10

在次日，将裸PankoMab、裸PM-N54Q、hIgG-ADC、PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC用各培养基从500 nM至0.2 nM进行3倍系列稀释。将20微升这些稀释的溶液加入适当的孔(终浓度: 100 nM至0.04 nM)。对于空白孔和未处理的孔，将20 uL单独的每种培养基加入孔。将所有平板在每种细胞系的适当条件下温育6天。

通过下述方程式计算每个样品的细胞生存率：

细胞生存率(%) = 100 x (T - B)/(C - B)

T: 测试孔的发光强度

C: 未处理的孔的平均发光强度

B: 空白孔的平均发光强度。

使用基于SAS发行9.4 (SAS Institute Japan, Tokyo, 日本) (Emax: 100,Emin: 估计)的EXSUS 8.1版(CAC Croit, Tolyo, 日本)，使用3-参数对数平行线分析(普通斜率)，将PankoMab-ADC相对于PM-N54Q-ADC针对HPAC和NCI-H441的细胞毒性活性的效能比和它们的95%CI计算为事后分析。如果效能比的95%CI不包括1，认为细胞毒性活性的效能差异是显著的。

实施例9: PankoMab

将人乳腺癌细胞系MDA-MB-468和HCC70、人胰腺癌细胞系HPAC和人肺癌细胞系NCI-H441用作中至高表达TA-MUC1的肿瘤细胞。将人结直肠癌细胞系HCT-15用作TA-MUC1阴性的肿瘤细胞。这些细胞系购自ATCC。人卵巢癌细胞系OVCAR-5购自国立癌症研究所并用作低表达TA-MUC1的肿瘤细胞。根据指导手册培养每种细胞系。通过流式细胞计量术和IHC染色证实TA-MUC1在每种癌细胞系上的表达水平。

将MDA-MB-468细胞悬浮于Matrigel (BD)中，并将1 x 10

将HCC70细胞悬浮于生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)中，并将1 x 10

通过下述方程式计算每只小鼠的估计肿瘤体积：

估计肿瘤体积(mm

还根据下述方程式计算媒介物治疗组在最后一个测量天每组的肿瘤生长抑制(TGI,%)，并四舍五入至整数。

TGI (%) = (1−T/C)×100

T: 裸PankoMab、对照hIgG-ADC或PankoMab-ADC的平均估计肿瘤体积(mm

C: 媒介物治疗组的平均估计肿瘤体积(mm

为了评价PankoMab-ADC的抗肿瘤效力，通过Student t-检验将PankoMab-ADC治疗组在最后一个测量天(MDA-MB-468:第41天, HCC70:第40天)每只小鼠的肿瘤体积与对照hIgG-ADC治疗组的值或裸PankoMab治疗组的值进行对比。使用SAS System Release 9.2(SAS Institute Inc.)进行所有统计分析作为事后分析。认为小于0.05的

将HPAC细胞悬浮于生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)中并将3 x10

将NCI-H441细胞悬浮于Matrigel (BD)中，并将5 x 10

将OVCAR-5细胞悬浮于生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)中并将5 x 10

将HCT-15细胞悬浮于生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.)中并将5 x 10

通过下述方程式计算每只小鼠的肿瘤体积：

估计肿瘤体积(mm

还根据下述方程式计算在媒介物治疗组的最后一个测量天或所有组都存活的最后一天每只小鼠的肿瘤生长抑制(TGI,%)，并四舍五入至整数。

TGI (%) = (1−T/C)×100

T: 裸PankoMab、裸PM-N54Q、对照hIgG-ADC、PankoMab-ADC或PM-N54Q-ADC的平均估计肿瘤体积(mm

C: 媒介物治疗组的平均估计肿瘤体积(mm

为了评价每种化合物对带有HPAC、NCI-H441、OVCAR-5和HCT-15的小鼠的抗肿瘤效力，通过Dunnett氏检验将在对照hIgG-ADC治疗组的最后一个测量天(HPAC：第32天，NCI-H441：第38天，HCT-15：第32天)或所有组都存活的最后一天(OVCAR-5:第26天)每只小鼠的肿瘤体积与对照hIgG-ADC治疗组的值进行对比。另外，在PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC治疗组之间通过Student氏t-检验对比了带有OVCAR-5的裸鼠在第33天的肿瘤体积。使用SASSystem Release 9.2 (SAS Institute Inc.)进行所有统计分析作为事后分析。认为小于0.05的

实施例10:

为了研究PankoMab-ADC是否显示对人癌细胞系的靶标依赖性的和药物依赖性的细胞毒性活性，评价了裸PankoMab、对照hIgG-ADC和PankoMab-ADC对人乳腺癌细胞MDA-MB-468(TA-MUC1阳性的)和人结直肠癌细胞HCT-15 (TA-MUC1阴性的)的体外效力。如在图8中所示，裸PankoMab和hIgG-ADC几乎没有显示对每种细胞系的活性(IC

为了研究抗原结合亲和力的改善是否可能促进细胞毒性活性的增强，评价了PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC对人胰腺癌细胞系HPAC和人肺癌细胞系NCI-H441的体外效力。PM-N54Q-ADC对它们的细胞毒性活性比PankoMab-ADC的活性高超过1.5倍(图8C和图8D)。PM-N54Q-ADC相对于PankoMab-ADC对HPAC的效能比为1.917(1.611 - 2.280, 95%CI)，并且对NCI-H441为1.663 (1.495-1.849, 在EC50的95%CI)。这些数据证实，PM-N54Q-ADC的细胞毒性活性比PankoMab-ADC的活性明显更有效。这些结果提示，PankoMab-ADC的抗原结合亲和力的改善可能促成细胞杀死活性的显著增强。

为了研究PankoMab-ADC是否不仅显示体外效力而且显示体内效力，评价了裸PankoMab、对照hIgG-ADC和PankoMab-ADC对带有MDA-MB-468的小鼠的抗肿瘤效力。如在图9中所示，裸PankoMab和对照IgG-ADC (3 mg/kg, 单次施用)没有显示出抗肿瘤效力(在第41天二者TGI为-18%)。相反，PankoMab-ADC (3 mg/kg, 单次施用)显著地抑制肿瘤生长(在第41天TGI为97%)。此外，它显示出与对照hIgG-ADC和裸PankoMab相比显著的抗肿瘤效力(在第41天二者P<0.001)。关于体重变化，在所有药物-治疗组中没有观察到由药物治疗造成的任何体重减轻。

还评价了裸PankoMab、对照hIgG-ADC和PankoMab-ADC对带有HCC70的小鼠的抗肿瘤效力。如在图10中所示，裸PankoMab和对照hIgG-ADC (10 mg/kg, 单次施用)显示出对这些异种移植物模型的弱抗肿瘤效力(在第40天TGI分别为10%和29%)。相反，PankoMab-ADC(10 mg/kg, 单次施用)显著地抑制肿瘤生长(在第40天TGI为95%)。此外，它显示出与对照hIgG-ADC相比统计上显著的抗肿瘤效力(在第40天二者P<0.001)。关于体重变化，在所有药物-治疗组中没有观察到由药物治疗造成的任何体重减轻。这些结果提示，PankoMab-ADC具有强烈的抗肿瘤效力并且它对各种TA-MUC1阳性的异种移植物模型显示出靶标依赖性的和药物依赖性的抗肿瘤效力。

为了研究PM-N54Q-ADC对TA-MUC1阳性肿瘤细胞是否具有与PankoMab-ADC相等或更大的抗肿瘤效力，对比了PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC对不同类型的TA-MUC1阳性肿瘤细胞的抗肿瘤效力。

最初，我们评价了对具有中至高TA-MUC1表达的HPAC和NCI-H441肿瘤细胞的体内效力。如在图11中所示, 裸PM-N54Q和对照hIgG-ADC (10 mg/kg, 单次施用)对带有HPAC的小鼠显示出弱抗肿瘤效力(在第32天TGI分别为27%和18%)。相反，PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC (10 mg/kg, 单次施用)显著地抑制肿瘤生长(在第32天二者TGI为93%)。此外，PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC (10 mg/kg, 单次施用)显示出与对照hIgG-ADC相比统计上显著的抗肿瘤效力(在第32天二者P<0.001)。关于体重变化，在所有药物-治疗组中没有观察到由药物治疗造成的任何体重减轻。

如在图12中所示，裸PankoMab和裸PM-N54Q (10 mg/kg, 单次施用)对带有NCI-H441的小鼠显示出弱抗肿瘤效力(在第38天TGI分别为8%和12%)。尽管对照hIgG-ADC (3mg/kg, 单次施用)治疗组在施用以后2周显示出抗肿瘤效力，但是在第21天以后观察到肿瘤再生长(在第38天TGI为71%)。相反，PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC (3 mg/kg, 单次施用)显著地抑制肿瘤生长(在第38天二者TGI为99%)。此外，PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC显示出与对照hIgG-ADC相比统计上显著的抗肿瘤效力(在第38天分别P<0.001)。关于体重变化，在所有药物-治疗组中没有观察到由药物治疗造成的任何体重减轻。

接着，我们评价了对OVCAR-5肿瘤细胞（其中TA-MUC1低表达）的体内效力。如在图13中所示，裸PankoMab、PM-N54Q和对照hIgG-ADC (10 mg/kg、单次施用)对带有OVCAR5的小鼠几乎没有显示出抗肿瘤效力(在第26天TGI分别为1%、11%和3%)。在该模型中，PankoMab-ADC (10 mg/kg, 单次施用)的抗肿瘤效力是有限的(在第26天TGI为37%)，但是PM-N54Q-ADC (10 mg/kg, 单次施用)显示出强抗肿瘤效力(在第26天TGI为73%)。此外，PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC显示出与对照hIgG-ADC相比统计上显著的抗肿瘤效力(在第26天分别P=0.01和P<0.001)。另外，PM-N54Q-ADC显示出与PankoMab-ADC相比统计上显著的抗肿瘤效力(在第26天P<0.001)。关于体重变化，在所有药物-治疗组中没有观察到由药物治疗造成的任何体重减轻。

最后，我们评价了对HCT-15肿瘤细胞（其为TA-MUC1阴性）的体内效力。

如在图14中所示，裸PankoMab和PM-N54Q (10 mg/kg, 单次施用)对该模型几乎没有显示出抗肿瘤效力(在第32天TGI分别为7%、4%)。此外，PankoMab-ADC、PM-N54Q-ADC和对照hIgG-ADC对该模型也几乎没有显示出抗肿瘤效力(在第32天TGI分别为15%、22%和26%)。

基于这些结果，结论是，PankoMab-ADC和PM-N54Q-ADC的抗肿瘤效力是靶标依赖性的和药物依赖性的。并且，抗原结合亲和力的改善可能促成对TA-MUC1阳性肿瘤细胞的抗肿瘤效力的增强。

保藏的生物学材料的鉴定

在下表指示的日期，Glycotope GmbH, Robert-Rössle-Str. 10, 13125 Berlin (DE)将细胞系DSM ACC 2806、DSM ACC 2807和DSM ACC 2856保藏在DSMZ - Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124Braunschweig (DE)。

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该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人。
专利发明人：J·盖勒特;A·弗莱什内;D·魏格尔特;安特杰·丹尼尔茲克;永濑亚希子;
专利申请人：第一三共株式会社;

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