用于大凉螈亲子鉴定及种群遗传分析的SSR荧光标记引物

技术领域

本发明属于遗传学领域，具体涉及用于大凉螈亲子鉴定及种群遗传分析的SSR荧光标记引物。

背景技术

大凉螈(Liangshantriton taliangensis)隶属于蝾螈科(Salamandridae),有尾目(Caudata)，是我国特有种，属国家二级重点保护野生动物。原隶属于疣螈属(Tylototriton)，费梁(2012)根据其头骨形态特征，将其从疣螈属中划分出来，独立成凉螈属(Liangshantriton)。

大凉螈具有分布区狭窄、迁移能力弱、繁殖潜力较低等生理及生活史特征，使得其面对环境变化时非常敏感，种群下降后恢复缓慢。目前，由于栖息地丧失，外来物种入侵，过度利用等生态问题，大凉螈正经历着种群持续下降，急需开展相关保育工作，然而该物种的种群遗传结构，地理格局等生物信息作为保护工作的重要基础目前处于缺失状态，因此开发合适的遗传标记是首要工作。此外，该物种具有典型的性二型特征，体内纳精的精子交接模式及雄性竞争行为，是研究有尾两栖类精子竞争的理想模型，应用亲子鉴定技术更深入的研究其性选择过程，有助于预测种群的发展规律，可切实推动我国大凉螈种群保护实践工作。

微卫星标记被称为第二代分子标记，其在每个真核生物基因组中大量出现，由DNA的串联重复单位组成，通常长度小于5个碱基(1～6个碱基)，又称为串联重复序列(Shorttandem repeat,STR)或简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)。微卫星基因座多态性来自于串联重复序列数量在不同个体基因组中的变化，其遗传方式同样遵循孟德尔遗传定律，并具有共显性。此外，由于微卫星位点的侧翼序列具有保守性，因此这些位点常常还可以进行跨种扩增，这对于近缘物种的保护遗传学研究具有重要意义。

目前还没有微卫星标记用于大凉螈亲子鉴定、种群结构分析及遗传管理的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一组用于大凉螈亲子鉴定及种群遗传分析的SSR荧光标记引物。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一组引物对，包括引物对DLY181，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示；包括引物对DLY39，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

相应的，一组引物对，包括引物对DLY181，正向序列和反向序列分别如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示；包括引物对DLY39，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，包括引物对DLY124，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示。

相应的，一组引物对，包括引物对DLY181，正向序列和反向序列分别如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示；包括引物对DLY39，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，包括引物对DLY124，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示，包括引物对DLY173，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示。

相应的，一组引物对，包括引物对DLY181，正向序列和反向序列分别如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示；包括引物对DLY39，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，包括引物对DLY124，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示，包括引物对DLY173，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示，包括引物对DLY148，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。

相应的，一组引物对，包括引物对DLY181，正向序列和反向序列分别如SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16所示；包括引物对DLY39，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，包括引物对DLY124，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4所示，包括引物对DLY173，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示，包括引物对DLY148，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，包括引物对DLY189，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示。

相应的，一组引物对，包括引物对DLY39，正向序列和反向序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示，包括引物对DLY173，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示，包括引物对DLY181，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16所示，包括引物对DLY124，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，包括引物对DLY153，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示，包括引物对DLY189，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示，包括引物对DLY148，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，包括引物对DLY165，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示，包括引物对DLY69，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示，包括引物对DLY186，正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示。

相应的，所述一组引物对在大凉螈个体识别上的应用。

相应的，所述一组引物对在大凉螈亲子鉴定上的应用。

相应的，所述引物对在大凉螈种群结构分析上的应用。

相应的，利用所述一组引物对制备的鉴定或检测用试纸、试剂或试剂盒。

本发明具有以下有益效果：本发明提供了一组可进行大凉螈个体识别、亲子鉴定、种群遗传结构分析的方法和10对微卫星引物。在选择位点和设计引物时，发明人以四碱基重复为主，辅以三碱基和两碱基重复。相对于二碱基或三碱基重复，四碱基重复在PCR扩增过程中不容易产生因扩增链滑脱产生的“影子带”，更容易从电泳峰图上读取等位基因进行统计分析，特异性更强，数据准确性更高，能够显示更高水平的观测杂合度。但四碱基重复，往往多态性更低。本发明提供的位点(引物)兼具准确性和多态性。将本发明提供的技术用于种群性选择研究和种群遗传分析，可从繁殖、遗传分化等角度提出科学可行的保护建议，为未来保育工作奠定基础。

附图说明

图1为本发明的位点数量与个体识别率关系示意图；

图2为本发明的位点数量与非亲本排除率关系示意图；

图3为种群结构分析示意图。

具体实施方式

本发明提供了一组用于大凉螈亲子鉴定的微卫星荧光标记引物，共包括10对，分别为DLY39(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示)、DLY124(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)、DLY148((正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示)、DLY153(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.7、SEQID NO.8所示)、DLY165(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示)、DLY169(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示)、DLY173(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示)、DLY181(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示)、DLY186(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示)、DLY189(正向序列和反向序列分别如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示)。上述10对引物的扩增产物分别如SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30所示。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例一：构建获得10对引物

1、基于简化基因组进行SSR位点的筛选。

取一只大凉螈尾部组织样，使用TIANGEN试剂盒(TIANGEN Biotech Co.,Ltd.,Beijing)，按照试剂盒操作流程进行DNA提取。获得100μL DNA样品，采用Illumina HiSeq2500(PE250)测序技术进行文库构建。文库构建(诺禾致源生物技术公司)具体步骤包括：(1)样品检测；(2)文库构建及库检，对合格的样品使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。文库构建完成后，先使用Qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段进行检测，插入片段大小符合预期(300～500bp)后，使用Q-PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。(3)上机测序文库检测合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求，将不同文库合并至流动细胞计数池(flowcell)，待cBOT成簇后，使用Illumina高通量测序平台(HiSeq2500)进行测序。使用Soap denovo2软件对clean data原始测序数据进行序列拼接，使用软件QDD2对拼接好的序列数据进行微卫星位点筛选以及引物设计。

Illumina HiSeq 2500(PE250)测序获得原始数据(raw data)数据量4.07G，8140007bp，经过去除低质量序列和接头之后，获得Clean data共2.137G，4274087bp。使用Soap denovo2软件拼接后，共获得片段重叠群数(contig)2714339bp，总长为660198879bp，最大长度为3853bp，N50长度为250bp，说明文库构建成功，可用于后续分析。

2、引物筛选及位点多态性检测。

在QDD2给出的结果中筛选位点。本发明兼顾亲子鉴定与遗传多样性检验，筛选方法为：选择不同的重复碱基数(以4碱基重复为主，辅以2碱基重复和3碱基重复)以及不同的重复碱基组合，片段扩增长度在100～500bp之间不等，重复片段位于扩增片段的中段位置为佳，重复单元重复次数≥6。

首先随机选择两个个体，用于候选引物的退火温度筛选，筛选梯度为50～62℃(每间隔2℃设置一个温度梯度)，并通过琼脂糖凝胶电泳检验该引物是否成功扩增了目标片段的单一条带，选择能够有效扩增的引物及其最佳退火温度。

随后利用以上筛选的引物对25个随机个体进行PCR扩增，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对微卫星位点多态性进行初步检测。检测步骤包括：(1)聚丙烯酰胺混合液制备(约100mL)；(2)胶板准备；(3)灌胶；(4)PAGE电泳检测：取PCR产物1～2μL，电压300V，电泳时间1.5～3h；(5)染色、显影及观片：将电泳运行完毕的玻璃板取出，并分离，将有凝胶的玻璃板纯水冲洗后置入染色液中浸泡约5min，随后取出用纯水冲洗后置入显影液5～10min(具体浸泡时间视情况而定，明显染色成功、显影成功，即可取出)。取出后纯水冲洗置于观片灯上查看各位点多态性情况。将PAGE胶显示的条带大小与引物扩增片段大小进行比较，若样本在该位点表现出不同的扩增长度则说明存在多态性。

通过上述方法，最终获得10对有效扩增且多态性较高的微卫星位点。

上述PCR反应体系均为：20μL：包含1μL DNA模板，10μL 2×Tap Master Mix(Vazyme生物技术有限公司)，正反向引物各1μL以及7μL ddH

PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，退火30s(退火温度各引物不同，具体如表1所示)，72℃延伸60s，共35个循环，终末延伸72℃8min，4℃保存。

3、微卫星分型及数据分析。

在获得10对微卫星位点后，进行荧光标记引物的合成。根据引物扩增片段长度设计混合位点组合(选择三个位点，且各位点间扩增长度间隔＞30bp)，然后分别为同组三个正向引物的5’分别加上三个不同的荧光基团FAM、HEX和TAMRA。对公益海(GYH)大凉螈组织样(29个)进行PCR扩增(PCR反应体系、反应条件同步骤2)后，使用ABI-3730xl进行毛细管分型。

使用GeneMarker读取微卫星原始数据的样品峰值，并通过MicroChecker检测分型数据错误(genotyping errors)，如无效等位基因(null gene)和非期望突变等。使用Convert软件将微卫星数据集转换相应软件所需格式。在软件popgene v3.2(Raymond andRousset 1995)计算了各个位点的哈温平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)、连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)、观测杂合度(observed heterozgosity，Ho)、期望杂合度(expected heterozgosity，He)后，通过CERVUS v3.9(Kalinowsk et al.,2007)计算各多态性位点信息量(polymorphism information content，PIC)。显著性P值使用Bonferroni进行校正。10个位点在公益海(GYH)种群中的相关特征描述如表1所示。

表1中，Tm表示各引物的PCR退火温度，N

表1 10个位点的特征描述对照表

本发明提供的位点以四碱基重复类型为主，以保证位点分型时具有较高准确性；同时兼顾多态性，适当增加了合适的二碱基及三碱基重复类型的位点。

结果显示：10个位点都是多态的，其中7个位点至少含有4个等位基因。位点的等位基因数(N

实施例二：使用引物进行大凉螈个体识别

应用实例一中所得位点的微卫星引物对34只大凉螈进行DNA扩增与基因分型，最终获得所有个体分型数据。根据表1中各位点的多态性高低，依次测试采用的位点数与个体识别率的关系(表2)。数据分析在CERVUS v3.9软件中进行。

表2个体识别中测试用引物对组合

结果如图1所示，显示使用6个高多态性的微卫星位点(DLY39，DLY173，DLY181，DLY124，DLY153，DLY189)时，个体识别率已经达到99.97％。证明本发明能够用于大凉螈准确的个体识别。

实施例三：使用引物进行大凉螈亲子鉴定

使用实施例一提供的10对引物对30只子代大凉螈(其母本均为FGYHF34，候选父本包括MGYHF31、MGYHF32和MGYHF33)进行亲子鉴定。具体实验过程参照实施例一中的PCR扩增及基因分型。读取分型结果获得34只大凉螈基因位点矩阵，使用CERVUS v3.9软件计算各位点的非亲排除率(probabilities of exclusion,PE)，累积非亲排除率(cumulative PE,CPE)，使用Simulation of Parentage Analysis模块进行10000次模拟鉴定，ParentageAnalysis模块进行正式亲子鉴定。

根据多态性高低顺序依次测试采用的位点数与非亲本排除概率的关系(测试引物对组合同表2)。结果显示使用的位点数与累积非亲本排除概率呈正相关，当使用位点数为6时(DLY153，DLY39，DLY173，DLY181，DLY124，DLY189)，双亲基因型已知累积排除概率(CE-PP)为96.63％，最高累积排除率为99.23％，位点数越高越接近100％(图2)

使用10个位点进行亲子鉴定实际应用，结果如表3所示。表3中，*表示有亲子关系(95％置信区间)，-表示无亲子关系。

表3 30只大凉螈亲子鉴定结果展示

根据Trio top LOD值(已知单亲本子代与候选亲本间对数似然比)判断亲子关系，结果显示：90％的个体与MGYHF33实验父本存在亲子关系，其余三只子代(GYH10、GYH18、GYH27)与本次三个候选父本不存在亲子关系，可能是非实验父本所有，这可能由于大凉螈雌性多次交配，且泄殖腔能长期储存精子导致。

实验证明本发明可以用于大凉螈准确的亲子鉴定分析。

实施例四：使用引物进行大凉螈种群遗传多样性及结构分析

应用实施例一提供的10对引物，共同对59只大凉螈(来自两个种群,公益海(GYH):29、三河口(SHK):30)组织样品进行DNA扩增、微卫星分型，获取数据矩阵，随后进行种群遗传多样性和结构分析。

使用Genalex 6.5及ADZE软件计算种群遗传多样性相关参数，结果如表4所示。表4中，N表示每个种群样本大小，TA表示等位基因总数，Ar表示平均等位基因丰富度，pAr表示平均私有等位基因丰富度，Ne表示平均有效等位基因数，Ho表示平均观测杂合度，uHe表示平均无偏期望杂合度，SE表示标准误，F

表4 10对引物分析种群遗传多样性的结果展示

遗传多样性结果如表4所示：GYH种群在等位基因总数、平均等位基因丰富度、平均私有等位基因丰富度、平均有效等位基因数、平均观测杂合度、平均无偏期望杂合度6个参数上均大于SHK种群；两个种群均表现为平均观测杂合度Ho小于平均无偏期望杂合度uHe，说明存在杂合子不足的情况；SHK种群近交系数＞0，说明该种群存在近交情况，而GYH种群没有表现出近交现象。

基于微卫星分型数据，在STRUCTURE 2.3.1软件中使用贝叶斯聚类分析法进行种群结构分析。运行参数设置包括burn-in＝100000，MCMC＝1000000，分组数目K值设置为K＝1-2，每个K值重复10次。根据ΔK最高值选择最优结构数K。使用CLUMPP v1.1软件对最优K的10个运算结果进行平均化处理，在DISTRUCT v1.1软件中将最优分类结果进行可视化，结果显示GYH种群与SHK种群存在明显的种群分化，但两种群之间仍有存在少量的基因交流(图3)。

本发明能够准确用于种群遗传多样性评估、遗传结构及遗传交流水平分析。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形、变型、修改、替换，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 用于大凉螈亲子鉴定及种群遗传分析的SSR荧光标记引物

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY39)

<400> 1

cataatcctg aagagcatct ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY39)

<400> 2

gaccatcctc tcattgtttc tc 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY124)

<400> 3

gcctcgtctg gagttgtaag 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY124)

<400> 4

agtcgtagac atcctacgca gc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY148)

<400> 5

gcatttgtgt agtgcttcac tt 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY148)

<400> 6

aaaccttatt gcaattgacc c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY153)

<400> 7

aatggacttc cactgtcttt gt 22

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY153)

<400> 8

taacttgagc atgacatttg ct 22

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY165)

<400> 9

agtatccact cttgttgtgg gt 22

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY165)

<400> 10

tgtcccgcat ttctactgtc 20

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY169)

<400> 11

agaaagcaac tcaagacatg g 21

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY169)

<400> 12

taatatgcat gggcttctcc 20

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY173)

<400> 13

cattcaaact ttcaccaatt ca 22

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY173)

<400> 14

gatagaagga atggaagatt gg 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY181)

<400> 15

cggaactcgc tgtacaaata ct 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY181)

<400> 16

tactaaattt ggagagcacg ga 22

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY186)

<400> 17

atggataggt gaatagtcag gc 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY186)

<400> 18

ttcactcatt tgtcaactct gc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 正向引物(DLY189)

<400> 19

caggccattc ttacagttta gg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物(DLY189)

<400> 20

aggtgggatg tcatatgttt gt 22

<210> 21

<211> 239

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY39)

<400> 21

gaccatcctc tcattgtttc tcagcccccc agccatgctc agcattacgt gcgcctcttc 60

atggttcaaa tgtcgacata agagcacccc tctgtacaca cacacacaca cacaaaaaac 120

acctaagcgc atcccacatt gaccacaatg caatttaata ttcttccagc ctaacactcc 180

atcacagtgt agcacgctac ccatctgcta atgcgcttca gatgctcttc aggattatg 239

<210> 22

<211> 198

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY124)

<400> 22

gcctcgtctg gagttgtaag cgagatagat agatagatag atagatagat agatagatag 60

atagatagat acacatttat aattagtact ctaacagaaa ctgttcctgt gtgcgagcaa 120

acaaactttg ctgatgctca cagtgcgcgt ggtctcgcac gggacaccaa gacagggctg 180

cgtaggatgt ctacgact 198

<210> 23

<211> 302

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY148)

<400> 23

gcatttgtgt agtgcttcac ttccctccgg atgtgctgaa gcccatttgt gaatggatat 60

cccatgggat tataatgggt aatggacgat atcctgcatg agagccacaa ctgcagcacc 120

tctgtgtgaa tctgaagcaa caaaataaat aataataata ataataataa taataataat 180

gagggataag acgcttgagc ctcaagggtc agtgggatgc tggatatgaa gcatacgagt 240

gtgtattagc ctagtttagt ggtttgggaa aacatggatg gaggggtcaa ttgcaataag 300

gt 302

<210> 24

<211> 365

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY153)

<400> 24

aatggacttc cactgtcttt gtatctgaca ttcttctgac ttcaaaaacc tctgaaaacc 60

tggctttata cgctattggg ttatttatgt cgtcttttca gtttgcttaa attcatccgt 120

caatcagtac tgcctttcag tgccaggacg ccttttcaat tataggttga ggttaacaag 180

agacaaatga taataataat aataataata ataataataa taataataat aataataccc 240

agtgcaacag gaacatctat gacgagattc ctcacagaaa gtggagatat tacagttgat 300

ttttggtcat gttgtttatc tgaagaacaa atgatacctt gtcagcaaat gtcatgctca 360

agtta 365

<210> 25

<211> 151

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY165)

<400> 25

agtatccact cttgttgtgg gtgggaaact cattggttaa aaaaacaaaa acaaacaaac 60

aaacaaacaa acaaacagaa aacgtctaca gtatctgcaa acctcacatg acacttcagc 120

aaaatgctga tgttttctga cagtagaaat g 151

<210> 26

<211> 197

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY169)

<400> 26

taatatgcat gggcttctcc cctaaacatg gtaacattag tgtatataca actggcatat 60

ttaatttatt tgtaagtcaa tcaatcaatc aatcaatcaa tcaatctttt gtaaagagca 120

acactatcac ccctaggggc atctggacgc tgaggttgct gcgtctgcat caaaaagcca 180

tgtcttgagt tgctttc 197

<210> 27

<211> 121

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY173)

<400> 27

cattcaaact ttcaccaatt catccatcca tttgctattt catccatcca tccatccatc 60

catccatcca tccatccatc catccatcta cccatccatc caatcttcca ttccttctat 120

c 121

<210> 28

<211> 176

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY181)

<400> 28

cggaactcgc tgtacaaata ctaatacata catacataca tacatacata catacataca 60

tacatacata catacataca tgttggtcag cagttccctg ctctgtaata agttcagaaa 120

tgtgaatatg tgcttgcaaa tttgtcactg gaagatccgt gctctccaaa tttagt 176

<210> 29

<211> 173

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY186)

<400> 29

ttcactcatt tgtcaactct gccacccact ggctcatcct ttcatgcact tatccatcca 60

tccatccatc catccaaccc ttttccatac tttcccatgt ccacctatca tctatccatt 120

cattcactgg tgctactgga ccaccattcc gcctgactat tcacctatcc att 173

<210> 30

<211> 303

<212> DNA

<213> 扩增产物(DLY189)

<400> 30

aggtgggatg tcatatgttt gtgaggcacc agagcattac tttggttggt taggtctcta 60

tgaggtagtg cccatctttc tttaatttag ttgagtacat agcaggcagt gcttaatttg 120

taaaataaat aaataaataa ataaataaca gggccctgat taagaggcca ctgcaacgtg 180

caccactcat tgcccctgcc agctctgcca ctgccagtac caacataact actaaccatc 240

tcactaccac aagtgtggca attaggacta ttccacacaa tcctaaactg taagaatggc 300

ctg 303