用于高效外源蛋白表达和高密度培养的工程枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及用于高效外源蛋白表达和高密度培养的基因工程枯草芽孢杆菌。

背景技术

枯草芽孢杆菌（

有专利文献对野生型菌株ATCC6051（专利号CN 106085937 B）进行改造，采用同源重组的方式对基因

本发明对

综上所述，营养缺陷型菌株在工业化发酵过程中存在发酵成本高、发酵工艺复杂、异源蛋白表达水平低等诸多问题，采用非营养缺陷型菌株是工业化高效、高密度发酵生产外源蛋白的重要方式。

发明内容

本发明克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于高效外源蛋白表达和高密度培养的重组枯草芽孢杆菌及其应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：通过基因工程手段，在枯草芽孢杆菌胞内表达由

本发明首先提供一种用于高效外源蛋白表达和高密度培养的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于：通过基因工程方法在组氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌胞内表达由hisC基因编码的具有活性的组氨醇磷酸氨基转移酶。

具体实施方式中，所述基因工程方法是通过在所述枯草芽孢杆菌导入游离质粒表达，和/或在其基因组上原位突变，和/或在其基因组上引入单个或多个拷贝的具有功能的

所述

优选地，所述枯草芽孢杆菌可以为组氨酸缺陷型菌株SCK6，其在芽孢杆菌遗传保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）的保藏编号为1A976；MW10，其在芽孢杆菌遗传保藏中心（Bacillus Genetic Stock Center，BGSC）的保藏编号为1A751；DB104，其BGSC的保存编号为1E75，1E76或1E77，及其衍生菌株。更优选的，所述菌株为SCK6。选择该菌株作为出发菌株具有以下优点：一是，该菌株缺失中性蛋白酶基因（nprE）和碱性蛋白酶基因（aprE），胞外蛋白酶酶活相对于B. subtilis 168减少96%以上；其次，该菌株整合了木糖诱导型感受态调节因子comK基因，易制备高效感受态细胞，利于基因操作。

进一步优选地，还对所述枯草芽孢杆菌中的基因

在优选实施方式中，构建所述重组枯草芽孢杆菌时首先失活、敲除其基因

本发明进一步提供所述的构建方法获得的重组枯草芽孢杆菌。

更进一步，本发明提供所述的重组枯草芽孢杆菌在表达外源基因中的应用。

所述外源蛋白包括且不限于应用于葡聚糖磷酸化酶，葡萄糖磷酸变位酶，磷酸葡萄糖异构酶，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶，塔格糖6-磷酸磷酸酶，磷酸葡萄糖/磷酸甘露糖异构酶，甘露糖6-磷酸磷酸酶，异淀粉酶，葡萄糖苷转移酶、葡萄糖激酶，α-淀粉酶，葡萄糖异构酶，L-阿拉伯糖异构酶，D-阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，D-阿洛酮糖6-磷酸磷酸酶的表达。

通过基因工程方法将所述外源基因导入所述重组枯草芽孢杆菌中。通过发酵所述重组枯草芽孢杆菌以表达所述外源基因，其中所述发酵培养基中采用无机氮源。而现有发酵过程研究中，需要使用大量的有机氮源供给枯草芽孢杆菌菌株生长，本发明的菌株由于进行了营养缺陷型的回补改造，使其能够利用无机氮源快速生长，可以实现密度发酵，降低了发酵成本，减少了发酵控制难点。

优选地，所述发酵培养基含有如下组分：酵母抽提物、硫酸镁、硫酸锰、磷酸二氢钾、微量元素、氯化钙，维生素B1，氯化铵和葡萄糖。更优选地，所述的发酵培养基组成如下：酵母抽提物0.1-10 g/L、硫酸镁0.1-10 g/L、硫酸锰0.1-10 g/L、磷酸二氢钾0.1-10 g/L、微量元素0.1-10 mL/L、氯化钙0.1-10 g/L，维生素B1 0.1-10 g/L，氯化铵0.1-50 g/L和葡萄糖0.1-50g/L。

在具体实施方式中，所述发酵过程中采用磷酸或柠檬酸和氨水控制pH为5.0-8.5，发酵温度为18℃-45℃。优选地，所述发酵过程中控制pH为7.0，发酵温度为37℃。

本发明的有益效果：本发明对组氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌进行遗传改造，通过基因操作恢复其

附图说明

图1为质粒pSS-upp-FR结果示意图。

图2为质粒pSS-trpA-hisC-cm-upp-tyrA结构示意图。

图3为SCK23菌株在无机盐培养基固体平板上正常生长。其中，阴性对照为菌株SCK6。

图4为质粒pSS-spoIIAC-FR结构示意图。

图5为质粒pSS-srfAC-FR结构示意图。

图6为以SCK23为宿主表达异源蛋白αGP、PGM、PGI和TPE的SDS-PAGE胶图。其中，M为marker，1和2、3和4、5和6、7和8为平行样品。

图7 为SCK6/PMA5-TPE、SCK23/PMA5-TPE、SCK24/PMA5-TPE和SCK25/PMA5-TPE高密度发酵生长曲线。

图8为高密度发酵样品蛋白表达情况SDS-PAGE胶图。其中1-4依次代表菌株SCK6/PMA5-TPE、SCK23/PMA5-TPE、SCK24/PMA5-TPE和SCK25/PMA5-TPE，M为marker。

图9为显微镜下菌体革兰氏染色情况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1：SCK6菌株组氨酸缺陷型关键基因分析

对现有文献进行追踪，尚未知道是哪个或那些基因的改变导致枯草芽孢杆菌SCK6获得组氨酸营养缺陷型这一特性，因此，为了使菌株SCK6能够利用无机碳氮源合成组氨酸，本发明人对造成组氨酸营养缺陷型的基因进行研究。

首先，通过BSUBCYC网站（https://bsubcyc.org/）查询到了模式菌株

随后，设计引物，以SCK6基因组为模板，采用高保真DNA聚合酶PCR扩增上述基因片段，并进行基因测序。将上述测序结果与

为了验证上述推测，本发明人以表达质粒PWB980为载体，构建了质粒PWB980-hisC，成功在SCK6宿主中表达了来源于

实施例2：SCK23菌株的构建

为了使遗传表型更为稳定，对SCK6基因组上的

（1） 构建重组整合载体pSS-upp-FR

根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌

uppF-F：taaaacgacggccagtgccaagcttgcgcttacttcatggtggatatggc；

uppF-R: ggatcctctagagtcgacgtcgacctgcagtgtcccatcaacaattacacacttc；

uppB-F：ctgcaggtcgacgtcgactctagaggatcctgaacattctgtggagacgt；

uppB-R：agtcaatattactcctctcttccattgatgaacgtttaagctggataaagg。

（2） 构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK8

制备枯草芽孢杆菌菌株SCK6超级感受态细胞（Zhang, X.-Z. and Y.H.P. Zhang,Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolutionof cellulase in

挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证，经PCR扩增（引物uppF-F和uppB-R）获得1572 bp 左右DNA片段和2244 bp 左右的DNA片段两条条带（其中1572 bp DNA片段大小是载体pSS-upp-FR中载体中的

挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 uL菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于5-FU基本盐培养基固体平板（葡萄糖 8.0 g/L，谷氨酰胺 2.0 g/L，组氨酸 0.05 g/L，维生素B1 0.01g/L， 5-氟尿嘧啶10 μM，(NH4)

从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证（引物upp-check-F和upp-check-R），经PCR扩增获得仅有1600 bp左右的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即尿嘧啶磷酸核糖基转移酶编码基因敲除的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，即无尿嘧啶磷酸核糖基转移酶酶活性的枯草芽孢杆菌重组工程菌株，命名为SCK8（该菌株通过敲除基因

鉴定引物：

upp-check-F: cgtgaaattgctgatgaag；

upp-check-R: ctatagttctgtaaccatgattc。

（3） 构建重组整合载体pSS-trpA-hisC-cm-upp-tyrA。

根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌

PS-HISC-F1：tagatctcttaagttcgaactcgagagaatactttttcgctttactgcgg；

PS-HISC-R1：ccgcagtaaagcgaaaaagtattctctcgagttcgaacttaagagatcta;

PS-HISC-F2：tagtctataaaccaggtgatgacgtccatggaaaggatttttcgctacgc；

PS-HISC-R2：gcgtagcgaaaaatcctttccatggacgtcatcacctggtttatagacta；

PS-HISC-F3：ccgggtaccgagctcgaattcgtaagtcaggaaacgcattaggtttcccg；

PS-HISC-R3：cgggaaacctaatgcgtttcctgacttacgaattcgagctcggtacccgg；

PS-HISC-F4：ttgaagcccgggcggaatatgaaactcatggtcatagctgtttcctgtgt；

PS-HISC-R4：acacaggaaacagctatgaccatgagtttcatattccgcccgggcttcaa。

（4） 构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK23。

制备枯草芽孢杆菌菌株SCK8超级感受态细胞（Zhang, X.-Z. and Y.H.P. Zhang,Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolutionof cellulase in

挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证，经PCR（引物为hisC-check-F和 hisC-check-R）扩增获得3700 bp左右DNA片段的为阳性克隆。

鉴定引物：

hisC-check-F：agtgacggtgtcgtagtgg；

hisC-check-R：ttcaacaggtgtcgcaat；

挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 uL菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于不含组氨酸的5-FU基本盐培养基固体平板（葡萄糖8.0 g/L，谷氨酰胺 2.0 g/L，维生素B1 0.01g/L， 5-氟尿嘧啶10 μM，(NH4)

从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证，经PCR扩增获得仅有1500 bp左右的DNA片段的转化子为阳性克隆。对PCR产物进行测序，证明正确的

实施例3：SCK24的构建。

（1）构建重组整合载体pSS-spoIIAC-FR。

根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌

spoIIAC-F1：gggtaatgcatgcctgcaggtcgacaccatacggctgaaaccctgaagc；

spoIIAC-R1：gcttcagggtttcagccgtatggtgtcgacctgcaggcatgcattaccc；

spoIIAC-F2：cgctttgtaattaaggagatttgtttctagaggatccccgggtaccgagctcacggatggctagtctgcagtgcagg；

spoIIAC-R2：cctgcactgcagactagccatccgtgagctcggtacccggggatcctctagaaacaaatctccttaattacaaagcg；

spoIIAC-F3：cgatcaatatgtggccatgcatgaggaattcgtaatcatggtcatagctg；

spoIIAC-R3：cagctatgaccatgattacgaattcctcatgcatggccacatattgatcg。

（2）构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK24。

制备枯草芽孢杆菌菌株SCK23超级感受态细胞（Zhang, X.-Z. and Y.H.P.Zhang, Simple, fast and high-efficiency transformation system for directedevolution of cellulase in

挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证（引物为spoIIAC-F1和spoIIAC-R3），经PCR扩增获得1530 bp 左右DNA片段和2298 bp 左右DNA片段两条条带（其中1530 bp左右 DNA片段大小是载体pSS-spoIIAC-FR中载体中的

挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 µl菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于不含组氨酸的5-FU基本盐培养基固体平板（葡萄糖8.0 g/L，谷氨酰胺 2.0 g/L，维生素B1 0.01g/L， 5-氟尿嘧啶10 μM，(NH4)

从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证（引物为spoIIAC-check-F和spoIIAC-check-R），经PCR扩增获得仅有1549 bp左右的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即孢子形成

鉴定引物：

spoIIAC-check-F：atgagccttggaattgacatg；

spoIIAC-check-R：cactaacgatcatgcagatc。

实施例4：SCK25的构建。

（1）构建重组整合载体pSS-srfAC-FR

根据KEGG数据库中来源于枯草芽孢杆菌

srfAC-F1：gggtaatgcatgcctgcaggtcgaccatcagccatatggaactgaaatcaac；

srfAC-R1：gttgatttcagttccatatggctgatggtcgacctgcaggcatgcattaccc；

srfAC-F2：attacagaaggcgggagcgaaacattctagaggatccccgggtaccgagctcacacaaacc

gtaacggtttcataaatg；

srfAC-R2：catttatgaaaccgttacggtttgtgtgagctcggtacccggggatcctctagaatgtttcgc

tcccgccttctgtaat；

srfAC-F3：ggcacatgttcctgctgtcacaaacgaattcgtaatcatggtcatagctg；

srfAC-R3：cagctatgaccatgattacgaattcgtttgtgacagcaggaacatgtgcc。

（2）构建枯草芽孢杆菌重组菌株SCK25

制备枯草芽孢杆菌菌株SCK24超级感受态细胞（Zhang, X.-Z. and Y.H.P.Zhang, Simple, fast and high-efficiency transformation system for directedevolution of cellulase in

挑取在氯霉素抗性平板上生长的阳性单交换转化子菌落进行菌落PCR验证（引物为srfAC-F1和srfAC-R3），经PCR扩增获得1517 bp 左右DNA片段和5244 bp 左右的DNA片段两条条带（其中1517 bp DNA片段大小是载体pSS-srfAC-FR中载体中的

挑取阳性克隆转接到不添加抗生素的LB培养基中培养8-12 h，然后取200 µl菌液离心去除上清，再用无菌水重悬涂布于不含组氨酸的5-FU基本盐培养基固体平板（葡萄糖8.0 g/L，谷氨酰胺 2.0 g/L，维生素B1 0.01g/L， 5-氟尿嘧啶10 μM，(NH4)

从5-FU基本盐培养基固体平板上挑取若干菌落，再次进行菌落PCR验证（引物为srfAC-check-F和srfAC-check-R），经PCR扩增获得仅有1470 bp左右的DNA片段的转化子为阳性克隆。将转化子PCR送测序验证正确并保存正确的菌株，即

鉴定引物：

srfAC-check-F：cggcagaagacactaagc；

srfAC-check-R：ccgttctgcgacttcttc。

实施例5：SCK23作为宿主表达多种异源蛋白。

以PMA5为载体，分别将来源于

将上述组成型表达质粒PMA5-αGP、PMA5-PGM、PMA5-PGI和PMA5-TPE转入SCK23超级感受态细胞，涂布于卡那霉素（50 μg/mL）平板过夜培养，以菌落PCR筛选阳性克隆，得到重组菌株SCK23/PMA5-αGP、SCK23/PMA5-PGM、SCK23/PMA5-PGI、SCK23/PMA5-TPE。将重组菌株接种于含5 mL SR培养基（1.5%蛋白胨，3.0% 酵母提取物和0.3%磷酸二氢钾，pH 7.2）的试管中，并添加50 μg/mL卡那霉素用于维持质粒稳定，在37℃、250 rpm条件下培养16 h。随后，取300 μL试管中菌液接种于装有50 mL SR培养基的摇瓶（250 mL）中，并添加50 μg/mL卡那霉素，在37℃、250 rpm条件下培养48 h。分别在24 h和48 h取样，发酵液经12000 rpm离心5 min获得菌体，随后菌体用PBS重悬，进行超声破碎，12000 rpm离心5 min得到破碎细胞上清。取破碎细胞上清分别进行SDS-PAGE分析，结果显示胞外均有大量目标蛋白表达（图6）。αGP、PGM、PGI和TPE目标蛋白占胞内总蛋白的比例分分别为29.8%、42.6%、41.0%和47.3%。上述相关方法均采用常规操作步骤。

实施例6：高密度发酵生产异源蛋白。

将上述组成型表达质粒PMA5-TPE转入SCK6、SCK24和SCK25超级感受态细胞，涂布于卡那霉素（50 μg/mL）平板过夜培养，以菌落PCR筛选阳性克隆，得到重组菌株SCK6/PMA5-TPE、SCK24/PMA5-TPE和SCK25/PMA5-TPE。

采用分批-补料发酵方式对所构建工程菌株SCK6/PMA5-TPE、SCK23/PMA5-TPE、SCK24/PMA5-TPE和SCK25/PMA5-TPE进行发酵评价。首先将甘油冻存管中工程菌株在平板上划线，挑取单菌落接种于装有5 mL种子培养基（LB培养基）的试管中，37℃、200 rpm条件下培养16~18 h，然后转接于装有30 mL种子培养基（LB培养基）的摇瓶（250 mL）中，37℃、200rpm条件下培养16~18 h。将种子液（1%接种量）转入7 .5 L发酵罐（New BrunswickScientific co Inc , USA）中，装液量3 .0 L。发酵培养基成分为酵母抽提物1 g/L、硫酸镁1 g/L、硫酸锰0.05 g/L、磷酸二氢钾10 g/L、微量元素1 mL/L、氯化钙0.5 g/L，维生素B10.05 g/L，氯化铵20 g/L和葡萄糖25 g/L。发酵过程中采用磷酸和氨水控制pH为7.0，发酵温度为37

各菌株生长曲线如图7所示，菌株SCK6/PMA5-TPE生长缓慢，OD

目标蛋白的表达情况如图8所示，SCK6/PMA5-TPE中目标蛋白表达量约为30%，而SCK23/PMA5-TPE、SCK24/PMA5-TPE和SCK25/PMA5-TPE中目标蛋白TPE表达水平相近，均为45%左右，证明菌株SCK23、SCK24和SCK25均更适宜作为异源蛋白的表达宿主。显微镜下观察到SCK23/PMA5-TPE中有少量芽孢生成，而SCK24/PMA5-TPE和SCK25/PMA5-TPE中均无芽孢生成（图9）。另外，发酵过程中观测到SCK25/PMA5-TPE中泡沫的生成明显减少。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 用于高效外源蛋白表达和高密度培养的工程枯草芽孢杆菌

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

taaaacgacg gccagtgcca agcttgcgct tacttcatgg tggatatggc 50

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggatcctcta gagtcgacgt cgacctgcag tgtcccatca acaattacac acttc 55

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcaggtcg acgtcgactc tagaggatcc tgaacattct gtggagacgt 50

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agtcaatatt actcctctct tccattgatg aacgtttaag ctggataaag g 51

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgtgaaattg ctgatgaag 19

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctatagttct gtaaccatga ttc 23

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tagatctctt aagttcgaac tcgagagaat actttttcgc tttactgcgg 50

<210> 8

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgcagtaaa gcgaaaaagt attctctcga gttcgaactt aagagatcta 50

<210> 9

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagtctataa accaggtgat gacgtccatg gaaaggattt ttcgctacgc 50

<210> 10

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcgtagcgaa aaatcctttc catggacgtc atcacctggt ttatagacta 50

<210> 11

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ccgggtaccg agctcgaatt cgtaagtcag gaaacgcatt aggtttcccg 50

<210> 12

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

cgggaaacct aatgcgtttc ctgacttacg aattcgagct cggtacccgg 50

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttgaagcccg ggcggaatat gaaactcatg gtcatagctg tttcctgtgt 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acacaggaaa cagctatgac catgagtttc atattccgcc cgggcttcaa 50

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtgacggtg tcgtagtgg 19

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ttcaacaggt gtcgcaat 18

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gggtaatgca tgcctgcagg tcgacaccat acggctgaaa ccctgaagc 49

<210> 18

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcttcagggt ttcagccgta tggtgtcgac ctgcaggcat gcattaccc 49

<210> 19

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

cgctttgtaa ttaaggagat ttgtttctag aggatccccg ggtaccgagc tcacggatgg 60

ctagtctgca gtgcagg 77

<210> 20

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

cctgcactgc agactagcca tccgtgagct cggtacccgg ggatcctcta gaaacaaatc 60

tccttaatta caaagcg 77

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

cgatcaatat gtggccatgc atgaggaatt cgtaatcatg gtcatagctg 50

<210> 22

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cagctatgac catgattacg aattcctcat gcatggccac atattgatcg 50

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atgagccttg gaattgacat g 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

cactaacgat catgcagatc 20

<210> 25

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gggtaatgca tgcctgcagg tcgaccatca gccatatgga actgaaatca ac 52

<210> 26

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

gttgatttca gttccatatg gctgatggtc gacctgcagg catgcattac cc 52

<210> 27

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

attacagaag gcgggagcga aacattctag aggatccccg ggtaccgagc tcacacaaac 60

cgtaacggtt tcataaatg 79

<210> 28

<211> 79

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

catttatgaa accgttacgg tttgtgtgag ctcggtaccc ggggatcctc tagaatgttt 60

cgctcccgcc ttctgtaat 79

<210> 29

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

ggcacatgtt cctgctgtca caaacgaatt cgtaatcatg gtcatagctg 50

<210> 30

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

cagctatgac catgattacg aattcgtttg tgacagcagg aacatgtgcc 50

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

cggcagaaga cactaagc 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

ccgttctgcg acttcttc 18