酶复合物在养殖型动物的饲料中的用途

本申请是申请日为2013年11月22日、申请号为201380061450.5、发明名称为“酶复合物在养殖型动物的饲料中的用途”的发明专利申请的分案申请。

本发明的技术领域属于动物营养领域。

已知弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)菌株可以产生至少五种类型的称为Ia、Ib、II、III、IV的蛋白酶和两种肽酶(专利GB 1133579)。

在其专利申请WO 87/07905中，申请人描述了用于获得专一地由II、III和IV型蛋白酶(其中II型蛋白酶占优势)组成的蛋白水解复合物的方法。该复合物是从WAKSMAN 3535类型的弗氏链霉菌菌株开始通过下述过程而获得的：发酵，通过过滤来提取复合物，然后在具有相应于2,000至12,000的分子量的截止阈值的膜上进行超滤，和最后粉化。如此获得的以粉末形式的复合物具有至少2,000安森单位(Anson unit)/mg蛋白质的滴度。

在该申请中，II型蛋白酶以接近18kDa的分子量和接近9.0的等电点为特征。

在动物饲料中所使用的该复合物允许动物有效地同化富含粗蛋白质的食物并因此刺激其生长。此外，在妊娠母猪中所使用的该复合物使得能够获得在出生时猪崽体重的增加，伴随有饲料消耗的减少和健康状况的改善。

然而，该方法并不能使得能够有效地去除污染性的副产物。

在专利申请WO 97/37681中，提供了改进，其使得能够将滴度为至少4,000安森单位/mg蛋白质的产品用于治疗性应用。因此，占优势的蛋白酶具有大于100,000安森单位/mg蛋白质的比活性，具有30至36kDa的分子量和接近7.0的等电点。

后来进行的分析显示，所述蛋白酶的分子量为18-20kDa。

所描述的治疗性应用主要在于：减少对于某些疾病来说特征性的粘液分泌过多的正面作用；肠吸收和血液循环的改善；还有针对感染性疾病的对抗。此外，所述组合物被描述为有利于肠粘膜的经萎缩的或被破坏的绒毛的再生。

鉴于从弗氏链霉菌的培养物中提取的酶复合物的重大的治疗特性，重要的是使用更加完全地摆脱了可能影响其活性的生物学杂质的酶复合物。

因此，本发明旨在提供上面所描述的酶复合物的改善，以尤其是有利于在工业养殖背景下的良好的养殖条件和动物健康。

因此，本发明的目标在于通过培养弗氏链霉菌菌株而获得的包含蛋白酶混合物的酶复合物用于对养殖型动物的饲料进行补充的用途，其特征在于，在所述混合物的这些蛋白酶之中，一种蛋白酶具有7.0左右的等电点，和另一种蛋白酶具有8.0左右的等电点。

所述复合物占非常多数地包含这两种类型的蛋白酶，即这两种蛋白酶的比例超过所述混合物的活性的80％。

根据本发明的一个特征，等电点为7.0左右的蛋白酶具有大约150,000安森单位/mg蛋白质的比活性。

根据本发明的一个特征，等电点为8.0左右的蛋白酶具有大约38,000安森单位/mg蛋白质的比活性。

根据本发明的另一个特征，将所述酶复合物作为饲料补充物用于改善工业养殖型动物的总体状况，所述饲料补充物以粉末、液体或任何其他适合于与饲料组合物相混合的形式存在。

根据本发明的一个特征，在旋转式滚筒中将以粉末形式的酶复合物与饲料组合物进行干法混合直至均匀。

根据本发明的另一个特征，在流化床中将以液体形式的酶复合物喷雾在饲料组合物上，然后粒化。

根据本发明的一个特征，在家禽的饲料中使用所述酶复合物。

根据本发明的另一个特征，在猪的饲料中使用所述酶复合物。

根据本发明的另一个特征，在鱼的饲料中使用所述酶复合物。

本发明的目标还在于用于养殖型动物的饲料组合物，其包含本发明的酶复合物，和任选地，具有营养目的的赋形剂或载体，或其他添加剂。

最后，本发明的目标在于用于制备根据本发明的酶复合物的方法，其特征在于，培养弗氏链霉菌菌株，过滤发酵液，然后着手进行通过超滤和离子交换色谱法以及随后的等电聚焦来提取酶复合物，和最后将所获得的复合物冻干。

该发明使得能够提供其特征受到严格限定的饲料补充物。

本发明首先使得能够精确地调整待施用到饲料组合物中的剂量，以便获得所希望的治疗效果。

本发明还具有在工业养殖中改善动物的健康状况的优点。

此外，本发明还提供了在工业养殖中动物的总体状况的改善，这提高了经营的赢利性。

本发明还允许动物生长的增加，同时引起饲料消耗的下降。

通过与图解说明了肠绒毛的图片相关联地阅读下面的对于作为实例而给出的实施方案进行的补充描述，将会更好地理解本发明的其他特征、细节和优点。

已知以名称

在畜牧学领域中，重要的是拥有在技术上明确的、十分恒定的且其特性因此清楚地确定的产品。

为了获得根据本发明的酶复合物，培养弗氏链霉菌菌株并过滤发酵液。然后，着手进行通过超滤、离子交换色谱法和等电聚焦来提取和表征酶复合物。最后，着手进行将所获得的复合物冻干。

对于弗氏链霉菌菌株的培养，使用例如WAKSMAN 3535类型的菌株，并且所述菌株可以是在遗传上经改进的，以便尤其是获得蛋白水解活性的增加或任何抗生素分泌的取消。

在工业生产型发酵罐中在合适的培养基中进行所述培养。该培养基可以例如基于：15g/l大豆磨粉；30g/l葡萄糖；1g/l磷酸氢二钾；10g/l碳酸钙。

所述反应在7.0至7.5的pH下，在大约28℃的发酵温度下，以0.3体积的无菌空气/培养基体积/分钟的通气来进行。

一旦培养结束，就通过在澄清剂存在下过滤发酵液来去除菌丝体。

酶复合物的提取需要使用几项技术，包括超滤、离子交换色谱法和等电聚焦。

滤液的超滤借助于具有50kDa的截止阈值的膜来进行。

在3小时的过滤后，所收集的滤液(起始体积的71％)具有通过明胶薄膜测试而揭示的蛋白水解活性。该测试在于用银进行染色且放置在固体支持物上的明胶薄膜的降解。

采用使用具有合适尺寸的Cellufine C-500羧甲基凝胶柱(Amicon)来进行的阳离子交换色谱法。

色谱法缓冲液为pH 5.5的10mM柠檬酸盐缓冲液，并且洗脱通过0至1.0M的NaCl梯度来进行。洗脱流速根据柱的大小来调整，例如对于直径为2.5cm且高度为27cm的柱子，它为10至15ml/分钟。

在Phast-system上，对于从3至9的pH，用Pharmacia公司的即用型凝胶来进行分析型等电聚焦。用考马斯蓝来进行揭示。

在固体介质中的制备型等电聚焦的情况下，将酶溶液逆蒸馏水(95ml)进行透析，并且与5ml的具有4.7g Ultrodex凝胶和0.5g甘氨酸的3-9的两性电解质相混合。将凝胶在40℃下干燥6小时。在3W的恒定功率下，在整夜或等价的时间段期间进行迁移。用考马斯蓝来进行揭示。

取出各种不同的凝胶条带，用3ml水进行漂洗，过滤，然后用3ml Tris-HCl缓冲液进行漂洗。

然后，就其蛋白水解活性容量和其蛋白质含量来对如此获得的级分进行分析。然后，将样品逆0.3M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析。

在液体介质中的制备型等电聚焦的情况下，将逆蒸馏水进行透析的酶溶液与两性电解质(3.5ml)相混合。迁移在8W的恒定功率下进行4小时。

对所取得的级分进行分析，然后将其逆0.3M Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液进行透析。

上面所指出的实验条件将可根据希望获得的产品的量和在工业条件下的使用来进行调整。

因此，在所述混合物中获得：占多数的具有7.0左右的等电点(pI)的蛋白酶，和以较少比例，具有8.0左右的pI的蛋白酶。

在9ml的体积中获得占多数的pI为大约7.0的蛋白酶，其中具有0.49mg/ml的蛋白质浓度。由于该蛋白酶在其等电点处沉淀，因而关于纯化的特别预防措施可能是必需的。所获得的溶液具有75,000A.U./ml左右的滴度。

在均质化后，以4mg的规模纯化出了该蛋白酶，其具有150,000A.U./mg蛋白质的比活性。

一个安森单位(A.U.)在此被定义为这样的酶量，其当在25℃下和在pH 7.5下在变性血红蛋白存在下温育10分钟时，从该底物中释放出1微克酪氨酸的等价量，这通过对于用三氯乙酸不可沉淀的滤液的在280nm处的分光光度吸收来测定。

pI为大约8.0的蛋白酶与前一种蛋白酶一起被回收，但在更大的体积(例如35ml的体积)中，并且具有1.48mg/ml的蛋白质浓度。该溶液的滴度为56,000A.U./ml左右。

在均质化后，以50mg的规模纯化出了该蛋白酶，其具有38,000A.U./mg蛋白质左右的比活性。

上面所描述的经纯化的酶复合物主要包含蛋白酶和其他蛋白质。所进行的纯化和所采用的电泳技术证明了额外的纯化和没有蛋白水解活性的负载物质的去除。

所产生的各种不同蛋白酶可以通过测定其对于蛋白质例如胶原、角蛋白、弹性蛋白或血红蛋白的活性来更好地进行表征。

不幸的是，这些测定是复杂的，因为其缺乏灵敏度和其缺乏特异性。因此需要运用多种活性测试，其构成了检测方法，主要为安森方法。

活性测试：

该测试使得能够无特异性地测定蛋白水解活性的水平。它在于通过包含在所释放出的寡肽中的酪氨酸的分光光度法测定来测定变性血红蛋白的水解的水平。

该测试在于在440nm处通过分光光度法测定在其上固着有橙色染料的酪蛋白的水解。该测试不是特异性的。在与酶一起进行温育之后，用三氯乙酸使剩余的偶氮酪蛋白沉淀。光密度的测量反映了所释放出的肽的存在，因此反映了酶活性。

弹性蛋白分解活性测试：

该测试在于在495nm处用分光光度法测定通过在其上固着有红色染料的弹性蛋白的水解而释放出的经染色的肽的水平。

该水平测定的可能问题来自底物的不溶性，因此其灵敏度依赖于底物取样的精确度、温育介质的搅拌和底物在温育容器的壁上的粘附。

所进行的试验显示在活性与酶量之间缺乏线性。确实在活性与温育时间之间观察到线性，但代表其的直线不通过原点。

因此，可以测量两个温育时间(20和40分钟)之间的吸光度差异。用10μl的经稀释10倍的复合物，测量到0.049μOD/分钟的变化。因此，本发明的酶复合物确实具有针对弹性蛋白的蛋白水解活性。

该测试在于在347.5nm处用分光光度法测定存在于弹性蛋白酶中的酯酶活性的水平，这通过测定所释放出的对硝基苯酚来进行(Visser L.等人,Biochim,Biophys Acta,268(1972)207.260)。

该水平测定对于弹性蛋白分解活性来说不是特异性的，但它是非常快的(3分钟的动力学)并且具有良好的灵敏度。

这是因为，用50μl的经稀释100倍的复合物，测量到0.235μOD/分钟的变化。因此，所述酶复合物具有允许对硝基苯酚释放的活性。

胶原分解活性测试：

该测试在于在520nm处用分光光度法测定通过azocoll(经研磨的并且在其上固着有波尔多红染料的胶原)的水解而释放出的肽的水平(Chavira,AnalyticalBiochemistry,136(1984)446-450)。

该测试具有与弹性蛋白-刚果红(不可溶的底物)相同的缺点，但具有良好的灵敏度：用50μl的经稀释50倍的复合物，在10分钟的温育之后测量到0.398的OD。因此，本发明的酶复合物具有针对azocoll的蛋白水解活性。

如此，证实了根据本发明的酶复合物的蛋白水解活性。所述复合物的纯化并不改变其活性。

如此获得的且经表征的蛋白质复合物可用于动物治疗，尤其是作为免疫刺激试剂和作为派尔淋巴集结的再生试剂，特别是在年老的受试者中。

此外，所述酶复合物使得能够在年老的动物(大鼠、鸡等)中使肠绒毛再生，并因此大大地改善目的营养物的肠吸收。

根据本发明的酶复合物主要旨在畜牧学，和更特别地，旨在改善家畜(牛、猪、羊)、家禽、兔子和鱼以及任何其他单胃动物的饲料。

当以从0.025至1g/kg的剂量掺入到饲料组合物中时，该酶复合物改善了这些动物的代谢并且有助于确保它们具有更好的健康状况。优选地，引入到饲料组合物中的复合物的剂量为0.05至0.2g/kg。

在成组养殖的情况下，健康状况的保持发挥了重要的作用，因为它避免了由于混杂或禁闭而引起的疾病传播。如此，明显地降低了由细菌污染引起的养殖型动物的发病率，尤其是死亡率。

基于该酶混合物的饲料组合物包含一种或多种具有营养目的的赋形剂或载体，例如谷物(小麦、优质小麦、玉米、黑麦、大米、黍、高粱)磨粉、大豆磨粉、糖类(乳糖、甘露糖)、负载成分(酪蛋白、麸皮、纤维素、纤维素衍生物)和/或矿物成分(白垩、粘土、膨润土、硅石)以及任何其他在动物营养中所使用的成分。

在旋转式滚筒中将这些组合物与复合物进行干法混合直至均匀，或者在流化床中将以液体形式的(特别地，水性形式的)酶复合物喷雾在饲料组合物上，然后粒化。此类操作可以在从15℃至60℃的可变温度下进行。

因此，更纯的和更具活性的酶复合物的使用使得能够更精确地测定根据本发明的营养组合物的生物学活性水平，并且确保所获得的结果的令人满意的均一性。

因此，根据本发明的饲料组合物具有清楚地确定的和非常恒定的酶复合物含量。

因此，下面是旨在用于养殖型动物的饲料组合物的几个非限制性实例，所述饲料组合物包含与具有营养目的的合适的赋形剂或载体相混合的根据本发明的酶复合物。

对于10kg的批次，通过添加酶复合物制备了组合物：

按照0.5kg/吨用于家禽的饲喂料来掺入这样的组合物。

对于20.1kg的批次，制备了在其中添加了酶复合物的组合物，将其掺入到家禽的饲喂料中：

对于10kg的批次，制备了在其中添加了酶复合物的组合物，将其掺入到猪的饲喂料中：

以相同的方式制备了下述的组合物：

大米淀粉 0.5kg

马铃薯淀粉 2.5kg

本发明的酶复合物 0.2g/kg

将如此构成的预混合料以小部分地添加至6kg羊肉蛋白粉和14kg酪蛋白的混合物。经均质化的制备物旨在按照0.5kg/吨食物掺入到家畜的饲喂料中。

对于10kg的批次，制备了在其中添加了酶复合物的组合物：

也可以将根据本发明的酶复合物添加至用于家禽的商业饲料组合物以便对这些制备物进行补充。

按照惯常的作法，制备了下述组合物，将其掺入到用于鱼的饲料中：

实验部分：

为了测定本发明的复合物对于肠绒毛的作用，在相对年老(大于七个月)的大鼠上进行了试验。

这些大鼠接受基于小麦磨粉、大豆磨粉、玉米磨粉类型的完全植物的蛋白质的饲料。在该饲料中按照0.1或0.2g/kg添加上面所描述的根据本发明的酶复合物。

在图1至4中阐明了结果。这些图是十二指肠和空肠的绒毛的光学显微术图片(×120的放大倍数)。

图1呈现了在其饲料中未接受根据本发明的酶复合物的大鼠的十二指肠的绒毛。

图2呈现了接受了掺入有根据本发明的酶复合物的饲料的大鼠的十二指肠的绒毛。

图3显示了在其饲料中未接受根据本发明的酶复合物的大鼠的空肠的绒毛。

图4显示了接受了掺入有根据本发明的酶复合物的饲料的大鼠的空肠的绒毛。

因此，证实了在年老的动物(大鼠、鸡等)的饲料中添加所述酶复合物增加了在十二指肠中和在空肠中的绒毛的大小和数目。发现了高达70％的增加。

这些结果可搬移至肠微绒毛。在鸡、猪和鱼中也获得了相似的结果。

展开的表面的增加允许营养物或者药物的更快吸收。

在接受包含抗生素的饲料的鳟鱼中观察到吸收的这种改善。在该测试中，饲料包含4g/kg的土霉素并且在48小时后读取结果。从而发现在肝脏中100％左右(5.75微克/克代替了2.5微克/克)、在肌肉中400％左右(1.75微克/克代替了0.32微克/克)和在肾脏中1000％左右(5.75微克/克代替了0.5微克/克)的抗生素的组织浓度的增加。

在鸡中和在猪中获得了相似的结果。

密度的这种增加还可能是在生理学上具有活性的化合物(例如，肠激素)的局部产生增加的原因。