一种NK免疫细胞体外扩增的方法

技术领域

本发明涉及一种NK免疫细胞扩增方法，具体为一种NK免疫细胞体外扩增的方法，属于细胞体外扩增技术领域。

背景技术

自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）是机体重要的免疫细胞，主要分布在外周血中，NK细胞作为机体防御体系的第一道防线，不仅可以在天然免疫系统发挥其主要杀瘤效应，而且在免疫反应的早期可以分泌不同的细胞因子和各种趋化因子来调节机体获得性免疫应答，是机体发挥免疫效应不可或缺的效应细胞，从而成为细胞疗法。

细胞疗法作为其中一种治疗策略，巳经研究了数十年，其分支如干细胞治疗、免疫细胞治疗等的临床运用将越来越广泛。目前运用于临床的细胞疗法如骨髓造血干细胞移植、充质干细胞移植等已被证实是安全有效的治疗手段。

NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。如何提供一种可扩增出大量且高活性的NK细胞的培养基，是NK细胞体外扩增领域亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种NK免疫细胞体外扩增的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种NK免疫细胞体外扩增的方法，包括以下步骤：

步骤一、肝素抗凝常规采血，在采血管内添加有肝素，并进行抽血采集；

步骤二、分离外周血淋巴细胞血，从采集到的血液中通过离心分离出外周血淋巴细胞；

步骤三、制备NK免疫细胞培养基，将所需基础培养基和添加物按照一定剂量进行混合；

步骤四、分离原始NK免疫细胞，由外周血淋巴细胞分离得到原始NK免疫细胞；

步骤五、原始NK免疫细胞培养，将获得的原始NK免疫细胞放入培养基中进行培养；

步骤六、诱导原始NK免疫细胞，对培养后的原始NK免疫细胞进行刺激和诱导，以得到活性高的NK免疫细胞；

步骤七、NK免疫细胞扩增，将所获得的NK免疫细胞放置在培养袋内，对NK免疫细胞进行扩增培养。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，NK免疫细胞培养基由含有胰岛素样生长因子-Ⅰ的基础培养基和8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺和0.5-2.0μmol/L来那度胺等组成。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，培养原始NK免疫细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，间隔预定时间补加NK细胞培养基和其他所需添加物。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，对培养后的原始NK免疫细胞采用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2进行诱导生长。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，对原始NK免疫细胞进行刺激并加入诱导剂使细胞密度扩増至初始培养浓度的10倍，停止诱导，其中诱导剂为PMA+ionomycin。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤七中，在进行NK免疫细胞扩增时，装盛NK免疫细胞的培养袋为透气细胞培养袋。

本发明的有益效果是：该NK免疫细胞体外扩增的方法设计合理：

1、培养原始NK免疫细胞所使用的培养基由含有胰岛素样生长因子-Ⅰ和人血清白蛋白、尼克酰胺和来那度胺等添加物组成，利用特殊成分的培养基，不需要像传统慢慢培养NK免疫细胞的方法，提高NK免疫细胞的活性，极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率；

2、对培养后的原始NK免疫细胞诱导剂为PMA+ionomycin，强烈活化T细胞，配合蛋白转运抑制剂使高浓度的细胞因子停留在胞内，易于用抗体和流式进行检测，同时其培养环境为透气细胞培养袋使其内外可以进行气体交换，确保细胞的生存环境安全。

附图说明

图1为本发明流程结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种NK免疫细胞体外扩增的方法，包括以下步骤：

步骤一、肝素抗凝常规采血，在采血管内添加有肝素，并进行抽血采集；

步骤二、分离外周血淋巴细胞血，从采集到的血液中通过离心分离出外周血淋巴细胞；

步骤三、制备NK免疫细胞培养基，将所需基础培养基和添加物按照一定剂量进行混合；

步骤四、分离原始NK免疫细胞，由外周血淋巴细胞分离得到原始NK免疫细胞；

步骤五、原始NK免疫细胞培养，将获得的原始NK免疫细胞放入培养基中进行培养；

步骤六、诱导原始NK免疫细胞，对培养后的原始NK免疫细胞进行刺激和诱导，以得到活性高的NK免疫细胞；

步骤七、NK免疫细胞扩增，将所获得的NK免疫细胞放置在培养袋内，对NK免疫细胞进行扩增培养。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，NK免疫细胞培养基由含有胰岛素样生长因子-Ⅰ的基础培养基和8-12g/L人血清白蛋白、2.5-7.5mmol/L尼克酰胺和0.5-2.0μmol/L来那度胺等组成，提供细胞生存的快速增值环境，利用特殊成分的培养基，提高NK免疫细胞的活性，极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，培养原始NK免疫细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，间隔预定时间补加NK细胞培养基和其他所需添加物，方便模拟人体环境，使其移植体内时依然可以生存和扩增。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，对培养后的原始NK免疫细胞采用促细胞生长剂3CS-NK-B1和3CS-NK-B2进行诱导生长，促进NK免疫细胞生长，配合诱导剂增加免疫细胞活性。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，对原始NK免疫细胞进行刺激并加入诱导剂使细胞密度扩増至初始培养浓度的10倍，停止诱导，其中诱导剂为PMA+ionomycin，使之成为具有免疫抑制功能的调节性T细胞，且能够达到増加Foxp3的转录，进而促进调节T细胞的生成，强烈活化T细胞，配合蛋白转运抑制剂使高浓度的细胞因子停留在胞内，易于用抗体和流式进行检测。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤七中，在进行NK免疫细胞扩增时，装盛NK免疫细胞的培养袋为透气细胞培养袋，方便培养扩增时，细胞进行气体交换。

工作原理：在使用该NK免疫细胞体外扩增的方法时，首先将采集的血液通过离心分离出外周血淋巴细胞；再由外周血淋巴细胞分离得到原始NK免疫细胞；将获得的原始NK免疫细胞放入培养基中进行培养；对培养后的原始NK免疫细胞进行刺激和诱导，再将其移入透气细胞培养袋中，加入扩増剂持续剌激，培养至细胞扩増达到10倍，收集细胞，再分选得到扩増后的免疫细胞。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。