一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法

技术领域

本发明涉及一种细胞诱导分化方法，具体为一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，属于细胞诱导分化技术领域。

背景技术

间充质干细胞是少有的具有组织修复和免疫调节功能的多能干细 胞，且来源广泛，目前已知骨髓、脐带、脂肪、肝脏等多种组织均 能有效分离出间充质干细胞。最近一些研究表明骨髓间充质干细胞 能够重塑星形胶质细胞向M2型活化，增强其吞噬作用和上调抗炎介质表达。但有关脐带间充质干细胞对星形胶质细胞活化状态的调控情况的研究，业内尚处于空白状态。

星形胶质细胞是中枢神经系统内的固有免疫细胞，在中枢神经炎症 反应过程中发挥重要作用。目前的研究表明，多种神经退行性疾病 的发生、发展都与星形胶质细胞的过度激活有关。此外，颅脑放射 治疗相关的认知障碍也与星形胶质细胞引发的慢性神经炎症反应密切相关。

本研发项目旨在选取脐带来源的间充质干细胞和BV2星形胶质细胞为研究对象，观察正常环境和炎症环境下脐带间充质干细胞对星形胶质细胞活化状态的影响，探讨和分析脐血间充质干细胞对神经系统损伤的免疫调节作用及组织修复机制。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，包括以下步骤：

步骤一、人脐带间充质干细胞培养，釆集人脐血样本，在釆集后6个小时之内进行细胞的分离，将分离后的充质干细胞保存到低温环境中进行收集，并直接用于培养；

步骤二、星形胶质细胞培养，提取星形胶质细胞，在培养箱内培养基上进行培养；

步骤三、hUC-MSCs条件培养基制备，选取一定密度的人脐带间充质干细胞和星形胶质细胞，制成hUC-MSCs条件培养基备用；

步骤四、干预及实验分组，将脐带间充质干细胞和星形胶质细胞按照比例混合，将BV-2细胞接种于条件培养基上，并进行对比试验和人源性造血克隆形成实验，并利用流式细胞仪开展数据检测；

步骤五、MTT比色法检测细胞增殖活力，向BV-2细胞接种的条件培养基内加入MTT进行检测；

步骤六、酶联免疫吸附实验，在BV-2细胞接种于样品组中，进行定时培养，收集处理后各组细胞上清检测细胞因子的含量，开展酶联免疫吸附试验，观察变色情况；

步骤七、免疫印迹检测，收集处理后各组细胞，开展免疫印迹检测；

步骤八、统计学处理，对所获得的实验数据开展实验数据统计分析。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，脐带间充质干细胞不用带有血清的培养基，而是用干细胞专用培养基，传代也尽量不用胰蛋白酶消化，应该采用专用消化液，能够保证细胞更多的传代次数，且其培养环境为37℃、5% C02.饱和湿度环境。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，人脐带间充质干细胞和星形胶质细胞铺板浓度为1 X10

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，MTT浓度为5mg/ml，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存，在使用时加入到样品组内即可。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六和步骤七中，酶分子与BV-2细胞（抗体）共价结合，免疫印迹法检测蛋白质特性、表达与分布情况；

其中，免疫印迹法需要用到的试剂：SDS-PAGE试剂；匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml；转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml；0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml；膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml；包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中；显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。

本发明的有益效果是：该脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法设计合理：

1、选取脐带来源的间充质干细胞和BV2星形胶质细胞为研究对象，观察正常环境和炎症环境下脐带间充质干细胞对星形胶质细胞活化状态的影响，便于分析脐血间充质干细胞对神经系统损伤的免疫调节作用及组织修复机制，且细胞培养环境模拟人体环境较为适宜，得到的数据较为准确和可靠；

2、该实验通过样品组与正常环境的细胞生长状态做对比，可以充分得到脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化影响的数据，其中MTT比色法和免疫印迹检测法将反应情况直观化，最后通过计算机软件进行统计学处理，使得脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化影响数据的详细化更加具有说服力。

附图说明

图1为本发明流程结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法，包括以下步骤：

步骤一、人脐带间充质干细胞培养，釆集人脐血样本，在釆集后6个小时之内进行细胞的分离，将分离后的充质干细胞保存到低温环境中进行收集，并直接用于培养；

步骤二、星形胶质细胞培养，提取星形胶质细胞，在培养箱内培养基上进行培养；

步骤三、hUC-MSCs条件培养基制备，选取一定密度的人脐带间充质干细胞和星形胶质细胞，制成hUC-MSCs条件培养基备用；

步骤四、干预及实验分组，将脐带间充质干细胞和星形胶质细胞按照比例混合，将BV-2细胞接种于条件培养基上，并进行对比试验和人源性造血克隆形成实验，并利用流式细胞仪开展数据检测；

步骤五、MTT比色法检测细胞增殖活力，向BV-2细胞接种的条件培养基内加入MTT进行检测；

步骤六、酶联免疫吸附实验，在BV-2细胞接种于样品组中，进行定时培养，收集处理后各组细胞上清检测细胞因子的含量，开展酶联免疫吸附试验，观察变色情况；

步骤七、免疫印迹检测，收集处理后各组细胞，开展免疫印迹检测；

步骤八、统计学处理，对所获得的实验数据开展实验数据统计分析。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，脐带间充质干细胞不用带有血清的培养基，而是用干细胞专用培养基，传代也尽量不用胰蛋白酶消化，应该采用专用消化液，能够保证细胞更多的传代次数，且其培养环境为37℃、5% C02.饱和湿度环境，保证细胞的生存活性，模拟体内环境，让数据具有实用性。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，人脐带间充质干细胞和星形胶质细胞铺板浓度为1 X10

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，MTT浓度为5mg/ml，可以称取MTT0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存，在使用时加入到样品组内即可，便于观察细胞增殖活力，从而是数据直观化。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六和步骤七中，酶分子与BV-2细胞（抗体）共价结合，免疫印迹法检测蛋白质特性、表达与分布情况，便于实验操作，通过多方面数据的检测，提高脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化影响数据的全面性；

其中，免疫印迹法需要用到的试剂：SDS-PAGE试剂；匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2ml；ddH2O 2.8ml；转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml；0.01M PBS(pH7.4）：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4 0.24g；加ddH2O至1000ml；膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118 ml；包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01M PBS中；显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202 1.0μl。

工作原理：在使用该脐带间充质干细胞对星形胶质细胞诱导分化的方法时，釆集人脐血样本，在釆集后6个小时之内进行单个核细胞的分离，将分离后的单个核细胞保存到低温环境中进行收集，并直接用于培养；将藻酸盐三维微球包装于人脐血单个核细胞上，新鲜或解冻后的脐血单个核细胞重悬于1.1%藻酸盐溶液核1.1%明胶溶液，混勾后，单个核细胞-藻酸盐溶液混合物通过27-g针头逐滴滴入100m氯化钙溶液中，固态微球即可形成；藻酸盐三维微球脐血单个核细胞培养，将包装后的三维藻酸盐人脐血单个核细胞微球培养于静止培养皿和选装培养装置中，进行系统细胞因子组合适合浓度的研究，经培养后形成实验培养基；将形成实验培养基移植给N0D/SCID小鼠进行分组对比试验和人源性造血克隆形成实验，并利用流式细胞仪开展数据检测。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。