一种PBMC细胞的体外培养方法

技术领域

本发明涉及一种PBMC细胞培养，具体为一种PBMC细胞的体外培养方法，属于细胞培养技术领域。

背景技术

外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)是外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，其中淋巴细胞又包括T淋巴细胞，B淋巴细胞和NK细胞。其中T淋巴细胞是比例最多的淋巴细胞类型，在胸腺中发育成熟，主要功能就是执行人体的细胞免疫功能，在人体的免疫监视中发挥着重要的作用。B淋巴细胞属于人体的执行体液免疫功能的细胞，B淋巴细胞受抗原刺激以后，能够发育成熟为浆细胞，可以分泌各种抗体，发挥体液免疫功能NK细胞是人体非特异性免疫细胞，也在免疫监视中发挥着重要作用。单核细胞属于白细胞的一种，从血液中逸出到组织中就变成了吞噬细胞，也称为巨噬细胞，在人体的非特异性免疫功能中发挥着重要的作用。

细胞疗法作为其中一种治疗策略，巳经研究了数十年，其分支如干细胞治疗、免疫细胞治疗等的临床运用将越来越广泛。目前运用于临床的细胞疗法如骨髓造血干细胞移植、充质干细胞移植等已被证实是安全有效的治疗手段。

免疫调节细胞因具有维持机体的中枢和外周免疫耐受的特性而备受国内外学者的青睐，大量证据表明免疫调节细胞在预防自身免疫反应，减轻诸如感染、肿瘤、器官移植等因素造成的炎症反应和维持免疫稳态等方面均具有重要的作用，故基于调节细胞的治疗将有助于机体免疫耐受重建，最终SLE乃至自身免疫性疾病患者将能达到真正“痊愈”，但是在培养这些免疫调节细胞时容易感染杂菌导致纯度受损，或者保存不当造成活性丧失。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种PBMC细胞的体外培养方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种PBMC细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一、抗凝常规采血，在采血管内添加有ACD抗凝剂，并进行抽血采集；

步骤二、分离外周血淋巴细胞血，从采集到的血液中通过离心分离出外周血淋巴细胞；

步骤三、分离原始PBMC细胞，由外周血淋巴细胞分离得到原始PBMC细胞；

步骤四、原始PBMC细胞培养，将获得的原始PBMC细胞放入培养基中进行培养；

步骤五、干扰素处理，对培养后的原始PBMC细胞投放干扰素，影响原始PBMC细胞生长环境；

步骤六、细胞收集和冷存，将所获得的PBMC细胞放置在细胞培养板上，并将其培养基吸出，每个孔添加20ul的Trizol，并将其培养后的细胞放入到冰箱中进行保存。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤一中，采血时静脉血用ACD抗凝剂以容积比血：抗凝剂＝9：1抗凝处理。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，培养原始PBMC细胞所使用的培养基由RPMI 1640+10% FBS+1% P/S和少量的胰岛素样生长因子-Ⅰ组成。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，对外周血淋巴细胞血按照血：分离液＝1：2注入国产淋巴细胞分离液TBD上层，20℃离心30分钟，且分层时的离心温度只能在20－25℃。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，对原始PBMC细胞进行干扰素处理，起到一定的激活作用，促进细胞表面FC受体的表达，提升免疫效果；

其中，干扰素包括培养基的终浓度的α-IFN抑制杂菌和病毒生长，且使用的干扰素需要稀释，稀释干扰素要用灭菌的注射用水或生理盐水。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，在进行细胞收集和冷存时，需要对细胞培养板上每个孔内的培养基进行吸除，此时，用移液枪将孔壁吹打数次，然后将Trizol转移到EP管中，最后培养的细胞冷存温度要达到-80℃。

本发明的有益效果是：该PBMC细胞的体外培养方法设计合理：

1、采血时静脉血用ACD抗凝剂取代传统的肝素方法抗凝，防止抗凝后交接层混浊，洗涤后没有细胞的现象发生，其培养基由RPMI 1640+10% FBS+1% P/S和少量的胰岛素样生长因子-Ⅰ组成，并在培养时加入干扰素，极大降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率；

2、对原始PBMC细胞进行获取时，离心温度要掌控好范围，过高细胞容易死亡或破坏，过低分层效果不好，而培养后的PBMC细胞需要在干扰素干扰后，才能进行冷存收集，干扰素具有广谱抗病毒作用，通过诱导细胞合成抗病毒蛋白而发挥抑制病毒的作用，冷存则延长培养后细胞的保存时长。

附图说明

图1为本发明流程结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，一种PBMC细胞的体外培养方法，包括以下步骤：

步骤一、抗凝常规采血，在采血管内添加有ACD抗凝剂，并进行抽血采集；

步骤二、分离外周血淋巴细胞血，从采集到的血液中通过离心分离出外周血淋巴细胞；

步骤三、分离原始PBMC细胞，由外周血淋巴细胞分离得到原始PBMC细胞；

步骤四、原始PBMC细胞培养，将获得的原始PBMC细胞放入培养基中进行培养；

步骤五、干扰素处理，对培养后的原始PBMC细胞投放干扰素，影响原始PBMC细胞生长环境；

步骤六、细胞收集和冷存，将所获得的PBMC细胞放置在细胞培养板上，并将其培养基吸出，每个孔添加20ul的Trizol，并将其培养后的细胞放入到冰箱中进行保存。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤一中，采血时静脉血用ACD抗凝剂以容积比血：抗凝剂＝9：1抗凝处理，防止抗凝后交接层混浊，洗涤后没有细胞的现象发生。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，培养原始PBMC细胞所使用的培养基由RPMI 1640+10% FBS+1% P/S和少量的胰岛素样生长因子-Ⅰ组成，降低了由于长期体外培养可能出现的细胞活力减弱、微生物污染等事件的发生率。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，对外周血淋巴细胞血按照血：分离液＝1：2注入国产淋巴细胞分离液TBD上层，20℃离心30分钟，且分层时的离心温度只能在20－25℃，过高细胞容易死亡或破坏，过低分层效果不好。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，对原始PBMC细胞进行干扰素处理，起到一定的激活作用，促进细胞表面FC受体的表达，提升免疫效果，具有广谱抗病毒作用，通过诱导细胞合成抗病毒蛋白而发挥抑制病毒的作用；

其中，干扰素包括培养基的终浓度的α-IFN抑制杂菌和病毒生长，且使用的干扰素需要稀释，稀释干扰素要用灭菌的注射用水或生理盐水。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤六中，在进行细胞收集和冷存时，需要对细胞培养板上每个孔内的培养基进行吸除，此时，用移液枪将孔壁吹打数次，然后将Trizol转移到EP管中，最后培养的细胞冷存温度要达到-80℃，延长培养细胞的保存年限。

工作原理：在使用该PBMC细胞的体外培养方法时，首先将采集的血液通过离心分离出外周血淋巴细胞；再由外周血淋巴细胞分离得到原始PBMC细胞；将获得的原始PBMC细胞放入培养基中进行培养；将培养的原始PBMC细胞，移入细胞培养板中，培养至细胞扩増达到10倍，此时适量添加干扰素，吸取细胞培养板内的培养基，再往每个孔内注入Trizol，用移液枪吹打数次，收集细胞，再将收集的细胞进行低温冷存。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。