治疗压力、免疫反应和中风综合征的多肽

技术领域

本发明涉及多肽及其治疗用途，具体是用于治疗压力、免疫反应和中风综合征。

背景技术

当细胞在体内迁移时，它们受趋化因子的引导。被趋化因子吸引的细胞遵循趋向于趋化因子源的趋化因子浓度增加的信号。目前已知有四个不同的趋化因子家族，它们的不同在于前两个半胱氨酸残基的间隔。所谓的CXC趋化因子或α趋化因子在两个半胱氨酸之间包含一个氨基酸作为间隔子，其名称用“X”表示。

因此，由于细胞表面上的趋化因子受体，趋化因子影响细胞。趋化因子受体是整合型膜蛋白。CXC趋化因子受体，尤其是CXC趋化因子受体4(CXCR4)激活癌细胞的快速生长和迁移，形成遍及全身的转移，尤其是在肺、骨骼和肝脏。而且，HIV可以利用CXCR4感染CD4+T细胞。

CXCR4参与多个发育和生理过程，包括干细胞归巢(Mohle and Drost,2012)和免疫细胞迁移(Campbell et al.,2003)。人造CXCR4拮抗剂具有动员造血干细胞(Hematopoietic stem cell,HSC)的能力，造血干细胞可在器官移植或化疗后用于免疫重建(Ratajczak and Kim,2012；Schroeder and DiPersio,2012)。此外，CXCR4还是HIV-1进入靶细胞的主要辅助受体(Feng et al.,1996；Bleul et al.,1996)。CXCR4作为辅助受体利用非常有效，体内淋巴组织中大部分CD4+T细胞表达此GPCR。但是，几乎全部利用C-C型趋化因子受体5(CCR5)的HIV-1变异体在慢性HIV-1感染过程中传播并被发现(Alkhatib etal.,1996；Deng et al.,1996；Dragic et al.,1996)。已经提出，多种因素导致CXCR4嗜性(X4)HIV-1毒株传播效率低下(Margolis and Shattock,2006)。但是，对于免疫适格个体中有效控制X4 HIV-1的机制仍然知之甚少。

根据各种现象，最近对CXCR4拮抗剂的研究已成为研究项目的一个广阔领域。具体地，寻找干预癌细胞增殖、分化和转移的策略的努力在临床研究中还没有取得预期的成功。开发的化合物组之一，即CXCR4拮抗剂AMD3100(一种双环素化合物：Hendrix and Flexner2000)，由于毒性副作用而不能用于长期治疗。尽管AMD3100已注册用于干细胞动员中的单个短期疗程，但是，找到足够的靶向CXCR4拮抗剂仍然是一项挑战。

Zirafi.O等在J.Leukoc.Biol.99:663-868；2016中报道了一种CXCR4的内源性肽抑制剂作为CXCR4的拮抗剂。该肽是人血清白蛋白的16个残基片段，从血液衍生的肽库中分离为CXCR4嗜性人免疫缺陷病毒1型的抑制剂。CXCR4的内源性肽抑制剂与CXCR4的第二个胞外茎环结合，从而防止结合CXCL12并拮抗受体。因此，CXCR4的内源性肽抑制剂可在体外抑制CXCL12介导的表达CXCR4的细胞迁移、造血干细胞动员并抑制体内炎症反应。作者讨论了CXCR4内源性肽抑制剂的产生，其作为疾病标志物的相关性及其在人免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合征的发病机制和癌症中的作用。

WO2009/004054A2公开了具有氨基酸序列Z1-LVRYTKKVPQVSTPTL-Z2(ALB-408)的肽及其生物学活性片段和/或变体和/或衍生物，特别是具有ALB408-423生物学活性的酰胺化、乙酰化、硫酸化、磷酸化和/或糖基化衍生物，以及可通过多种合成获得的肽；其中Z表示0-10个氨基酸残基的数目。

WO2014/198834A1公开了有效阻断CXC趋化因子受体4(CXCR4)介导的HIV-1NL4-3(X4嗜性)感染的肽，具体是二聚体，其IC50值小于50μM。

因此，本发明的一个目的是提供肽，所述肽对天然CXCR4具有拮抗活性。特别地，所述肽应能抑制癌细胞的增殖、转移并体现癌症的类型，所述类型通过不同的类似物和抗炎性变态反应的应答来表示。

本发明的另一目的是提供一种组合物，所述组合物能够降低CXCR4的受体活性。

本发明的另一目的是提供一种化合物，所述化合物能够影响癌细胞的增殖。

本发明的另一目的是提供一种化合物，所述化合物能够影响癌细胞的迁移或归巢。

本发明的又一目的是提供一种化合物，所述化合物能够影响转移灶的形成。

本发明的另一目的是提供一种化合物，所述化合物能够治疗高侵袭性的肿瘤，从而使癌症得到显著抑制或成为慢性疾病。

本发明的又一目的是提供一种化合物，所述化合物能够调节和治疗多种疾病，例如免疫和过敏性疾病、组织生长和神经系统调节。

本发明的目的是通过本发明的任何多肽解决技术问题。本发明的多肽显示出巨大的治疗潜力。

本发明的多肽具有通用氨基酸序列(以单字母代码表示)：

Z

其中，

X

X

X

X

X

X

X

X

以及

Z

Z

Z

Z

当指定Z

意外发现，在一条链末端(X

在一个优选的实施方案中，X

Z

在本发明的多肽中，所述肽选自以下：

X

X

X

X

X

X

X

X

在本发明的一个优选实施方案中，本发明的所述肽包含至少一个以下氨基酸序列：

LVRYTQKAPQVS、MVRYTQKAPQVS、VVRYTQKAPQVS、LMRYTQKQPQVS、LLRYTQKQPQVS、LVKYTQKQPQVS、LVCYTQKQPQVS、LVRWTQKAPQVS、LVRYSQKQPQVS、LVRYTCKAPQVS、LVRYTQCAPQVS、LVRYTQRAPQVS、LVRYTQKAPCVS、LVRYTQKAPQMS或LVRYTQKAPQFS。序列LVRYTQKAPQVS是特别优选的实施方案。

根据本发明，序列中的单个或多个氨基酸残基可以替换、缺失或添加，或者可以引入本发明中所述多肽的单个氨基酸的化学修饰，未修饰的多肽的生物学或药理活性。各种修饰方法是本领域技术人员已知的。

此外，对所述多肽的氨基酸的至少一个侧链进行了化学修饰，具体为磷酸化、酰胺化、乙酰化、糖基化、PEG化、HES化或其组合。

所述PEG衍生物的合适官能团的选择是基于即将与PEG偶联的分子上可用的反应基团的类型。对于蛋白质，常用的反应性氨基酸包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。N端氨基和C端羧酸也可以通过与醛官能聚合物偶联而用作特定位点。

根据本发明，根据本发明的所述多肽可以包含至少一种D-氨基酸。具体地，本发明的所述多肽可以由D-氨基酸链组成，所述D-氨基酸链是本发明所述多肽链的逆序D-构型(Retro-inverso configuration)。

因此，本发明所述肽的逆序D-构型肽、以及抗肽酶并稳定肽键的其他衍生物也在本发明的范围内。术语“衍生物”是指在本申请范围内的所有长度的片段，包括在N端的截短和C端的截短，本发明的所述肽也包含氨基酸残基替换，包括D-氨基酸残基和修饰的氨基酸残基；以及包含二硫键并在N端和C端延伸的肽。

本发明的又一主题是一种药物，所述药物包含至少一种本发明的所述多肽和药学上可接受的载体。在最简单的一个实施方案中，本发明的多肽可以以水溶液输注，生理盐水或缓冲水溶液施用。同样，其他制剂也可以用于例如脂质体包封中，形成各种尺寸的纳米颗粒，例如20-2000nm。

通常，本发明的所述肽以10-1000mg/kg体重的量施用一段时间，足以使肿瘤生长停止。施用时间通常在两周到十周之间。本发明的所述药物优选适于口服、静脉内、肌内、皮内、皮下、鞘内施用或适合于经肺施用的气雾剂形式，具体为包封在脂质体中；或用于水性或脂质体包载。

本发明的主题还可以是多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明所述的多肽和/或其片段、变体、衍生物和类似物。本发明的所述多核苷酸由DNA、RNA、基因组DNA或PNA组成。本发明的主题也可以是多核苷酸，所述多核苷酸与根据本发明的编码本发明所述多肽的多核苷酸杂交。

本发明的另一主题是载体，所述载体包含根据本发明的多核苷酸，以及基因工程宿主细胞，所述基因工程宿主细胞包含根据本发明的载体。

本发明的另一主题是抗体，所述抗体抗本发明的至少一种多肽。

本发明的又一主题是拮抗剂/抑制剂，所述拮抗剂/抑制剂抗根据本发明的多肽。

本发明的主题还可以是本发明的肽，其用于治疗神经系统疾病，具体为中风、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症；在免疫领域，具体用于治疗WHIm综合征、红斑狼疮和类风湿关节炎；在肿瘤领域，具体用于治疗癌症，具体为表达CRCX受体的癌症，例如肝癌、胰腺癌、前列腺癌或乳腺癌；用于治疗干细胞缺乏动员、增殖和迁移、T细胞活化以及免疫母细胞支持(如CTL/PD-1)；治疗烧伤造成的伤口；用于抗纤维化治疗；治疗或预防疤痕；用于治疗心脏病，具体为心脏功能不全；用于治疗代谢紊乱，具体为糖尿病；用于治疗病毒性疾病，具体为HIV-1、HIV-2、巨细胞病毒(Cytomegalo virus)、单纯疱疹病毒(Herpes simplexvirus)(1型和2型)、水痘带状疱疹病毒(Varicella zoster virus)、甲型肝炎(HepatitisA)和乙型肝炎(Hepatitis B)病毒、流感病毒(Influenza virus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、鼻病毒(Rhino virus)、风疹病毒(Rubella virus)、麻疹病毒(Measles virus)、狂犬病病毒(Rabies virus)、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、爱泼斯坦-巴尔病毒感染(Epstein-Barr Virus)；以及用于治疗由细菌和真菌引起的感染，具体为假单胞菌(Pseudomonas)、假丝酵母菌(Candida)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)；用于治疗感染过程、非正常感染过程；治疗生长失调、治疗神经元疾病、凝血级联和造血功能失调、血管疾病、免疫系统疾病以及改善伤口和骨骼愈合、肺部失调和过敏。

另一种生产根据本发明的多肽的方法是使用保护性氨基酸用如Merrifield合成的固相合成方法，或者本领域技术人员已知的液相合成方法生产，并纯化多肽。

另一种生产根据本发明的多肽的方法可以采用本领域技术人员已知的异源表达方法，所述方法使用普通的生物技术载体，并且必要时进行随后的翻译后修饰或化学修饰。

本发明的主题是一种诊断剂，其包含根据本发明的多克隆或单克隆抗体，或者包含编码根据本发明的多肽的核酸或mRNA。

本发明的另一主题是一种诊断剂，其包含根据本发明的多肽或根据本发明的多核苷酸，以用于分析该物质的组织、血浆、尿液和脑脊液水平的测试系统，检测根据本发明的多肽的诊断试剂和测试系统，通过质谱方法，例如MALDI-MS或ESI-MS，分析该物质的组织、血浆、尿液和脑脊液水平，以及通过RP-HPLC、蛋白质沉淀和/或固相萃取进行样品制备。优选地，质谱法用于检测在毫微微或毫摩尔量范围内的微量分子。

同样，本发明的主题是诊断剂，其包含根据本发明的多肽，所述多肽作为病毒性疾病、细菌和真菌感染、炎性和赘生性过程的标志物，以及作为炎性过程、紊乱的炎症反应、肿瘤、生长失调、免疫系统疾病、WHIm综合征、红斑狼疮以及骨疾病的标志物。

使用肽LVRYTQKAPQVS(SEQ ID No:1)作为本发明的肽的典型代表进一步详细地描述本发明。

实施例

肽类

使用Fmoc化学方法，在肽合成仪9050(Applied Biosystems)上通过常规固相合成法合成如SEQ ID No:1所示的肽及其各种衍生物。通过RP色谱法纯化该肽，并通过分析型RP-HPLC、MALDI-MS和LC-ESI-MS确定其种类和纯度。

癌细胞侵袭实验

在人源化大鼠上进行癌细胞侵袭实验(Eyol,E.et al.,Oncology Reports,28:2177-2187,2012)。植入胰腺癌细胞。通过发光成像以及CXCR4表达的增加观察成功的植入。

成功植入癌细胞后，用如SEQ ID No:1所述的肽治疗大鼠。治疗1周、治疗2周、和治疗后2周的结果如下表所示。

如SEQ ID No:1所示的肽的结果

未经治疗的大鼠在植入肿瘤后几天内死亡。

使用本发明的肽进行治疗的大鼠存活至少两周。肿瘤生长停止，并且观察到肿瘤部分或甚至完全缓解取决于浓度。没有观察到肽的毒性作用。

序列表

SEQ ID No:1

Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:2

Met Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:3

Val Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:4

Leu Met Arg Tyr Thr Gln Lys Gln Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:5

Leu Leu Arg Tyr Thr Gln Lys Gln Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:6

Leu Val Lys Tyr Thr Gln Lys Gln Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:7

Leu Val Cys Tyr Thr Gln Lys Gln Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:8

Leu Val Arg Trp Thr Gln Lys Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:9

Leu Val Arg Tyr Ser Gln Lys Gln Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:10

Leu Val Arg Tyr Thr Cys Lys Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:11

Leu Val Arg Tyr Thr Gln Cys Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:12

Leu Val Arg Tyr Thr Gln Arg Ala Pro Gln Val Ser

SEQ ID No:13

Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Cys Val Ser

SEQ ID No:14

Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Met Ser

SEQ ID No:15

Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro Gln Phe Ser