用于治疗神经变性疾病的2-氟代的胆汁酸

本发明涉及具有治疗神经变性疾病的用途的新化合物。特别地，本发明涉及胆汁酸衍生物、包含它们的药物组合物、其制备方法和所述化合物在治疗或预防神经变性疾病中的用途。

神经变性疾病为一组中枢神经系统疾病，并且包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(运动神经元病)。神经变性疾病的发生率随年龄而增加，因此这类病症是人群平均年龄增长的社会中逐步增长的问题。目前，尽管存在一些可利用的缓解帕金森病和一些类型的认知障碍和痴呆的症状的药物，但是没有治愈这些疾病的任一种的疗法。

帕金森病的症状是静止性震颤、运动迟缓和僵硬，且这些症状是由神经变性和多巴胺能神经元损失引起的。有大量证据启示线粒体功能障碍与帕金森病之间存在很强的关联性。在帕金森病患者的组织中发现线粒体电子传递链NADH脱氢酶(复合物I)活性轻度缺乏，且许多与帕金森病家族性形式相关的蛋白质为线粒体蛋白质或者与线粒体相关。

阿尔茨海默病导致进行性认知障碍，其特征在于存在细胞外神经炎的斑块和细胞内神经原纤维缠结。认为线粒体功能障碍导致作为神经炎斑块主要成分的β-淀粉样蛋白沉积并形成神经原纤维缠结。

亨廷顿病是一种遗传性进行性神经变性疾病，并且以运动障碍、人格改变和认知能力下降为特征。亨廷顿病的病理学提供了与线粒体功能障碍有关的证据。

肌萎缩性侧索硬化也被认为与线粒体功能障碍有关。这种疾病以中枢神经系统中的运动神经元为目标，导致肌无力、萎缩，并在诊断后2-3年内死亡。

已经尝试寻找能够治疗神经变性疾病的化合物，并且已经开发了几种靶向于线粒体的化合物。例如，众所周知，胆汁酸例如UDCA(熊去氧胆酸)对来自某些患有帕金森病的患者的组织中的线粒体功能障碍发挥有益作用，特别是在parkin突变体帕金森病患者的组织中(Mortiboys等人“Ursocholanic acid rescues mitochondrial function in commonforms of familial Parkinson’s disease”,Brain,136(10),3038-3050(2013))和LRRK2

WO 2014/036379、WO 2015/061421和WO 2016/145216教导，胆汁酸可具有治疗神经变性疾病例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化的用途。WO 2015/061421涉及氘代胆汁酸，且WO 2016/145216涉及氟代胆汁酸，特别是在3-和/或7-位氟代的胆汁酸。

发明人目前已经发现，某些氟代的胆汁酸具有优良的线粒体拯救特性并且在治疗神经变性疾病中特别有效。

在本发明中，提供了通式(I)的化合物：

其中

R

Y为价键或C

R

R

R

R

当R

n为1、2或3；

R

当n为2或3时，两个R

p为1、2、3、4、5或6；

R

或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。

通式(I)的化合物具有治疗中枢神经系统的神经变性疾病的用途，包括帕金森病、痴呆和肌萎缩性侧索硬化。

在本说明书中，除非上下文因表达语言或必要的暗示而另有要求，否则措词“包含”或变化形式例如“含有”或“包括”用于包含性意义，即指定存在所述特征，但不排除本发明的各种实施方案中存在或添加另外的特征。

在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用并入本文，就如同各个单独的出版物被具体地和单独地指示为通过引用作为完全举出的方式并入本文一样。

在本申请中，术语“C

术语“C

术语“C

术语“亚烷基”是指直链或支链完全饱和烃基链。适合地，亚烷基为C

术语“亚烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。适合地，亚烯基为C

术语“亚炔基”是指包含至少一个碳-碳叁键的直链或支链烃链。适合地，亚炔基为C

术语“芳基”和“芳族基团”是指具有6-14个环碳原子(另有指定的除外，例如6-10个环碳原子)且包含至多3个环的具有芳族属性的环状基团。如果芳基包含一个以上的环，则并非所有环必须在属性上为芳族的。实例包括苯基、萘基和蒽基以及部分饱和系统，例如四氢萘基(例如1,2,3,4-四氢萘基)、茚满基和茚基。

术语“杂芳基”和“杂芳族基团”是指具有5-14个环原子(另有指定的除外，例如5-10个环原子)的包含至少一个选自N、O和S的杂原子并且包含至多3个环的具有芳族属性的环状基团。如果杂芳基包含一个以上的环，则并非所有环必须在属性上为芳族的。实例包括吡啶、嘧啶、吡咯、噻吩、呋喃、噻唑、噁唑、稠合系统例如吲哚、苯并咪唑和苯并噻吩；和部分饱和的系统，例如二氢吲哚和二氢苯并呋喃。

术语“碳环”和“碳环基”是指具有3-10个环碳原子的非芳族烃环系(另有指定的除外)，其可以为稠合或桥连环系，并且任选地包含一个或多个碳-碳双键。实例包括环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基；和环烯基，例如环己烯基和环庚烯基；和桥连基团，例如金刚烷基。更适合地，碳环基为单环完全饱和的(环烷基)环。

术语“杂环”和“杂环基”是指具有3-10个环碳原子(另有指定的除外)和至少一个选自N、O和S的杂原子的非芳族环系，其可以为稠合或桥连的环系，并且可以为完全饱和的或可以包含一个或多个碳-碳或碳-氮双键。实例包括哌啶基、吗啉基、硫吗啉基、噻唑烷基(thiozolidinyl)、四氢噻吩基和四氢噻喃基。更适合地，杂环基为单环完全饱和的环。

术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，且术语“卤代”是指氟代、氯代、溴代或碘代基团。

术语“C

术语“氨基酸侧链”是指天然存在的氨基酸的侧链，其可以为D-氨基酸或L-氨基酸，但更适合地为D-氨基酸。天然存在的氨基酸的实例包括甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。

术语“侧链”是指-Y-R

涉及的取代基“＝O”是指通过双键连接至相邻原子的氧原子，所述相邻原子适合地为碳或硫原子并且可以为环原子。包括“＝O”取代基的基团实例包括-C(O)-、-S(O)-和-S(O)

通式(I)化合物的适合的药学上可接受的盐包括碱加成盐，例如钠、钾、钙、铝、锌、镁和其他金属盐，以及胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、葡甲胺和其他众所周知的碱加成盐，如Paulekuhn等人J.Med.Chem.2007,50,6665-6672所概括的(通过引用并入本文)和/或本领域技术人员公知的。

术语“同位素变体”是指同位素标记的化合物，其与式(I)中所述的化合物相同、但实际上一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中最常见的原子质量或质量数的原子替代，或者其中具有在自然界中不太常见的原子质量或质量数的原子的比例已经增加(后一个概念称作“同位素富集”)。可掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟、碘和氯的同位素，例如

在一些情况中，通式(I)的化合物可以为式(I’)的化合物：

其中

R

Y为价键或C

R

R

R

R

R

n为1、2或3；

R

或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。

通式(I)的化合物可以为通式(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物：

其中R

本发明的一些特别适合的化合物为通式(IA)的化合物。

本发明的其他适合的化合物为通式(IB)的化合物。

本发明的其他适合的化合物为通式(IC)的化合物。

本发明的其他适合的化合物为通式(ID)的化合物。

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的一些适合的化合物中，R

在其他适合的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

在其他适合的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

其中R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，Y适合地为价键或C

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的一些适合的化合物中，Y为价键或C

更适合地，Y为价键或C

特别适合的连接基Y的实例包括价键、-CH

如上所述，在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

在一些情况下，在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

在此情况下，更适合的化合物为此类化合物，其中R

在另外的更适合的化合物中，R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

在一些化合物中，其中R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

或者，在一些适合的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，其中R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

当R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的一些适合的化合物中，R

当R

R

当R

R

R

R

R

当R

R

R

或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。

在一些特别适合的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R

适合地，在这些化合物中，R

这类特别适合的化合物是如上所述的其中R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，其中R

在如上所述的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的另外的特别适合的化合物及其盐中，R

在这类化合物中，R

当R

当R

当R

当R

在一些适合的化合物中，其中R

或者，在其中R

在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的另外的特别适合的化合物中，R

在这类的一些适合的化合物中，R

在特别适合的化合物中，其中R

当R

更适合地，环烷基为未取代的环戊基、环己基或环庚基。

更适合地，杂环基为5-或6-元含硫基团，例如四氢噻吩和四氢噻喃或其氧化物，例如1,1-二氧代四氢噻吩和1,1-二氧代四氢吡喃。

在其中R

R

R

R

在这些化合物中，R

特别优选的R

在一个实施方案中，式(I)的化合物选自：

2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)；

2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)；

2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)；

2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)；

2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)；

2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)；

2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)；

2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)；

2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙基磺酸(化合物10)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸(化合物11)；

N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸(化合物12)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸(化合物13)；

1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸(化合物14)；

3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸(化合物15)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉(化合物16)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸(化合物17)

N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸(化合物18)；

N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)乙磺酸(化合物19)；

3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸(化合物20)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸(化合物21)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸(化合物22)；

O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙基磺酸(化合物23)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸(化合物24)；

N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸(化合物25)；

N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸(化合物26)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜(化合物27)；

N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物28)；

N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物29)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物(化合物30)；

N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺(化合物31)；和

其药学上可接受的盐(在适宜时)，尤其是金属盐，例如钠或钾盐，特别是钠盐或(对于化合物18而言的)二钠盐。

制备式(I)的化合物的方法如下所述。这些方法构成本发明的另一个方面。

通式(IB)和(IC)的化合物，其中R

其中Y和R

通过如以下通用方法L中所述用酸处理来进行，所述酸例如盐酸。

适合的酸不稳定的保护基R

通式(II)的化合物可以作为通式(IIB)和(IIC)的异构体混合物形成：

其中Y和R

通过还原通式(III)的化合物来进行：

其中Y和R

从如上所述的通式(IIB)和(IIC)的化合物中除去保护基R

用于还原通式(III)化合物的适合的还原剂包括氢化物，例如硼氢化钠。还原可以在有机溶剂例如四氢呋喃中，在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。

通式(III)的化合物可以由通式(IV)的化合物制备：

其中Y和R

通过使用试剂例如

当使用

适合的保护基R

R

通式(IV)的化合物可以由通式(V)的化合物制备：

其中Y和R

通过与通式(VI)的化合物反应来进行：

(R

其中R

该反应适合地在碱性条件下，例如在弱碱例如三乙胺存在下，在约15-25℃的温度下，适合地在室温下进行。

通式(V)的化合物可以由鹅去氧胆酸制备，其通过与醇R

R

其中R

通式(I)的化合物，其中R

通式(IA)和(IC)的化合物，其中R

其中Y如对通式(I)所定义，且R

适合地，还原使用氢化物、例如硼氢化钠在氯化铈(III)存在下进行。该反应适合地在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。

得到的产物为通式(IA)和通式(IC)的化合物的混合物，可通过常规方法，例如通过色谱法分离它们。

通式(XIIa)的化合物也可以用于制备通式(IB)和(ID)的化合物，其中R

R

其中R

得到通式(XIV)的化合物：

其中Y如通式(I)所定义；R

通式(XIV)的化合物可以使用弱碱水解，例如碳酸钾，得到通式(XIIb)的化合物：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

然后可以使用上述用于还原通式(XIIa)的化合物的条件还原通式(XIIb)的化合物，得到通式(IB)和通式(ID)的化合物的混合物。

通式(XIIa)的化合物可以由通式(XIV)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

通过与氟化氢吡啶(HF.吡啶)反应来进行。

适合地，该反应在无水有机溶剂例如二氯甲烷(DCM)中进行。

通式(XIV)的化合物可以通过使通式(XV)的化合物环氧化来制备：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

适合的氧化剂为间-氯过苯甲酸(mCPBA)，该反应可在有机溶剂例如DCM中并且在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。

通式(XV)的化合物可以通过消除反应由通式(XVI)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

三氟甲磺酸酐(三氟甲磺酸酐)为适合的活化的离去基团的实例，其可以与碱例如二甲基氨基吡啶(DMAP)联用。该反应可以在约5-20℃、适合地在10-15℃的温度下进行。

通式(XVI)的化合物可以由7-酮基石胆酸通过如以下通用方法A中所述的酯化制备。7-酮基石胆酸为可商购的。

通式(IA)的化合物，其中R

其中Y如对通式(I)所定义，且R

通过如以下通用方法L中所述与酸例如盐酸反应来进行。

可以使用如下方法将通式(IA)的化合物转化成通式(IB)和(ID)的化合物。

可以氧化通式(IA)的化合物，得到通式(XXII)的化合物：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

用于该方法的适合的氧化剂包括戴斯-马丁试剂(Dess-Martin periodinane)，且用于其的反应条件如以下通用方法M中所述。

然后可将通式(XXII)的二酮还原成通式(IB)和(ID)的化合物的混合物。用于该方法的适合的还原剂包括氢化物例如硼氢化钠，在氯化铈(III)存在下，如以下通用方法B中所述。可通过常规方法例如色谱法分离通式(IB)和(ID)的化合物。

通式(XXI)的化合物可以通过氟化通式(XXIII)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

用于该反应的适合的氟化剂包括N,N-二乙基氨基三氟化硫(DAST)。与DAST的反应可以在有机溶剂例如二氯甲烷中，在约15-25℃的温度下、典型地在室温下进行。

通式(XXIII)的化合物可以通过氧化通式(XXIV)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义，且R

适合的氧化剂包括如以下通用方法M中所述的戴斯-马丁试剂。

通式(XXIV)的化合物可以通过下列步骤制备：使通式(XXV)的化合物：

其中Y如对通式(I)所定义；R

与如上所述的通式(VII)的化合物反应，然后与碱反应，以除去保护基R

保护基R

通式(XXV)的化合物与通式(VII)的化合物的反应使用如以下通用方法K的方法进行。

可以用碱例如醇盐例如醇钠或醇钾，典型地为醇钠，例如甲醇钠或乙醇钠除去保护基R

通式(XXV)的化合物可以由通式(XXVI)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义；R

其通过环氧化得到通式(XXVIa)的化合物：

其中Y如对通式(I)所定义；R

随后通过与通式(XXVII)的化合物反应开环：

R

其中R

适合的氧化剂为间-氯过苯甲酸(m-CPBA)，且该反应可以在有机溶剂例如DCM中并且在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。该反应导致产生Δ2β,3β-环氧化物(XXVIa)和Δ3β,4β-环氧化物的不可分离的混合物。用通式(XXVII)的化合物处理该混合物时，通式(XXVIa)的化合物反应，得到所需产物。

在所述开环反应中，当保护基R

通式(XXVI)的化合物可以通过消除反应由通式(XXVIII)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义；R

三氟甲磺酸酐(三氟甲磺酸酐)适合地为活化的离去基团的实例，其可以与碱例如二甲基吡啶联用。该反应可在约5-20℃、适合地10-15℃的温度下进行。

通式(XXVIII)的化合物可以由通式(XXIX)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义；R

其通过与如上文所定义的通式(XXVII)的化合物反应来进行。

适合地，通式(XXVII)的化合物为通式(XIII)的羧酸，使得R

该反应可以在醇溶剂例如甲醇或乙醇中，在约15-25℃的温度下，典型地在室温下进行。

通式(XXIX)的化合物可以由通式(XXX)的化合物制备：

其中Y如对通式(I)所定义；R

其通过与通式(VII)的化合物反应来进行。适合的反应条件如以下通用方法K中所述。

通式(XXX)的化合物可以由通式(XXXI)的化合物制备：

其中R

其通过与通式(XXVII)的化合物，或更通常与通式(XXXII)的化合物反应来进行：

(R

其中R

当R

通式(XXXI)的化合物为UDCA的酯，其可以通过由UDCA与醇R

通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，其中R

其中R

通式(I)的化合物，其中R

适合的偶联试剂包括公知的肽偶联剂，例如O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU),O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU),O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)，(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)，碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)和三唑类，例如1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或羟基苯并三唑(HOBt)；以及氯甲酸酯，例如氯甲酸异丁酯。

式H-NR

通式(I)的化合物，其中R

其中R

HNR

(XL)

其中R

该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述。

例如，其中R

其中R

该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述，其中HATU特别适合。

适合地，在通式(XLI)的化合物中，R

类似地，其中R

其中R

该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述，且氯甲酸异丁酯特别适合。

适合地，在式的化合物(XLII)中，R

通式(XLI)的氨基酸和通式(XLII)的牛磺酸及其衍生物为众所周知的，且易于得到，或可以通过本领域公知的方法合成。

可以将其中R

NHR

其中R

其中R

i二苯基磷酰基叠氮化物/三乙胺

ii加热

iii R

其中R

可以通过下列步骤得到其中R

所述醇与磺酰氯反应得到通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物，其中R

通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，其中R

令人惊奇地，已经证实，本发明的化合物能够恢复线粒体功能，并且可以穿过血脑屏障。因此，它们用于治疗神经变性疾病，包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(运动神经元疾病)。

当与在A和B环上具有略微不同的取代的胆汁酸比较时，本发明的化合物具有令人惊奇的活性。

在本发明的另一个方面，提供了用于药物的通式(I)的化合物。

还提供了用于治疗或预防神经变性疾病的通式(I)的化合物。

本发明还提供了通式(I)的化合物在制备用于治疗或预防神经变性疾病的药物中的用途。

本发明还提供了用于治疗或预防神经变性疾病的方法，该方法包含对有这类治疗需要的患者施用有效量的通式(I)的化合物。

神经变性疾病的实例包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(运动神经元病)、进行性核上麻痹和威尔逊病。特别适合使用本发明化合物治疗的疾病包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化，且尤其是帕金森病、轻度认知障碍和痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)。

通式(IA)和(ID)的化合物在治疗或预防帕金森病中特别有效，尤其是其中R

用于治疗帕金森病的特别适合的化合物的实例包括通式(IA)的化合物，其为2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)；和通式(ID)的化合物，其为2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)。2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)为特别适合的。

通式(IB)的化合物特别有效地治疗或预防痴呆，例如阿尔茨海默病。这尤其是对于其中R

适合地，当神经变性疾病为痴呆、尤其是阿尔茨海默病时，通式(IB)的化合物为2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)。

通式(I)的化合物通常作为药物组合物的组成部分施用。

因此，在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含通式(I)的化合物和药学上可接受的赋形剂或载体。

可将该组合物配制成用于通过任何途径施用，例如胃肠外，包括静脉内、肌内、皮下或皮内；或口服、直肠、鼻部、局部(包括滴眼液、局部施用于肺、口含和舌下)或阴道施用。

更适合地，将该组合物配制成用于胃肠外施用或用于局部施用于肺(通过吸入)。

该组合物可以通过将上述定义的活性剂与载体混合来制备。通常，通过将活性剂与液体载体或固体载体细粉或它们两者均匀且紧密地混合，然后在需要时使产品成型来制备制剂。本发明扩展到制备药物组合物的方法，包含将通式(I)的化合物与药学上可接受的载体或媒介物结合或混合。

可以将本发明中用于口服施用的制剂提供为：离散单元，例如含有预定量活性剂的胶囊、小药囊或片剂；粉末或颗粒；活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或水包油型液体乳液或油包水型液体乳液；或推注剂等。

在一些情况中，可以将组合物配制成用于通式(I)的化合物的延迟释放、缓释或控释。

对于口服施用的组合物(例如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括媒介物，例如常见的赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸盐、硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅酮流体、滑石蜡、油和胶体二氧化硅。也可以使用矫味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。可能需要添加着色剂以使剂型易于识别。片剂也可以通过本领域众所周知的方法进行包衣。

片剂可以通过压缩或模制，任选地与一种或多种辅助成分一起制成。压制片可以通过在适合的机器中压制自由流动形式的活性剂来制备，例如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片可以通过在适合的机器中模压粉末状化合物与惰性液体稀释剂的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕并且可以被配制以提供活性剂的缓释或控释。

其他适合口服施用的制剂包括含有在调味基质、通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性剂的锭剂；包含在惰性基质、例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性剂的软锭剂；以及包含在适合的液体载体中的活性剂的漱口剂。

为了局部施用于皮肤，可以将通式(I)的化合物制成乳膏、软膏、胶冻、溶液或混悬液等。可用于药物的乳膏或软膏制剂是本领域众所周知的常规制剂，例如，如标准药剂学教科书中所述，例如英国药典(British Pharmacopoeia)。

可以通过使用气雾剂实现对肺的局部施用。气雾剂典型地包含悬浮或溶解在适合的气雾剂推进剂中的活性成分，所述推进剂例如氯氟碳(CFC)或氢氟碳(HFC)。适合的CFC推进剂包括三氯一氟甲烷(推进剂11)、二氯四氟甲烷(推进剂114)和二氯二氟甲烷(推进剂12)。适合的HFC推进剂包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。推进剂典型地占总吸入组合物重量的40％-99.5％，例如40％-90％。该制剂可以包含赋形剂，包括共溶剂(例如乙醇)和表面活性剂(例如卵磷脂、三油酸山梨坦等)。其他可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。将气雾剂包装在罐中，且适合的剂量通过计量阀(例如由Bespak、Valois或3M或由ptar、Coster或Vari提供)递送。

也可以通过使用非加压制剂例如水溶液或混悬液来实现对肺的局部施用。这些可以通过雾化器施用，例如可以手持和便携式或供家庭或医院使用(即非便携式)的雾化器。该制剂可以包含赋形剂例如水、缓冲剂、张力调节剂、pH调节剂、表面活性剂和共溶剂。混悬液和气雾剂(无论是加压的还是未加压的)典型地包含细粉形式的本发明化合物，例如具有0.5-10μm的D

也可通过使用干粉制剂实现对肺的局部施用。干粉制剂包含细粉形式的本公开化合物，其典型地具有1-10μm的质量平均直径(MMAD)或0.5-10μm的D

干粉制剂还可以包含另外的赋形剂。因此，在一个实施方案中，本公开的干粉制剂包含硬脂酸镁或硬脂酸钙。这类制剂可以具有优良的化学和/或物理稳定性，尤其是在这类制剂还包含乳糖时。

干粉制剂典型地使用干粉吸入器(DPI)装置递送。干粉递送系统的实例包括

在一个实施方案中，通式(I)的化合物作为微粉化的干粉制剂提供，例如其包含适合等级的乳糖。

因此，作为本发明的一个方面，提供了药物组合物，其包含颗粒形式的通式(I)的化合物与颗粒乳糖的组合，该组合物任选地包含硬脂酸镁。

在一个实施方案中，通式(I)的化合物作为包含适合等级的乳糖和硬脂酸镁的微粉化干粉制剂提供，其被填充入装置例如DISKUS。适合地，这类装置为多剂量装置，例如将该制剂填充入用于多单元剂量装置例如DISKUS的泡罩包。

在另一个实施方案中，可以将通式(I)的化合物作为微粉化干粉制剂提供，例如包含适合等级的乳糖。将该制剂填充入用于单剂量装置例如AEROLISER的硬壳胶囊。

在另一个实施方案中，通式(I)的化合物作为包含适合等级的乳糖和硬脂酸镁的微粉化干粉制剂提供，其被填充入用于单剂量装置、例如AEROLISER的硬壳胶囊。

在另一个实施方案中，通式(I)的化合物作为用于吸入剂型的细粉提供，其中粉末为具有0.5-10μm D

本发明的化合物也可以通过直肠施用，例如以栓剂或灌肠剂的形式，其包括水性或油性溶液以及混悬液和乳液和泡沫体。此类组合物按照本领域技术人员公知的标准方法制备。例如，栓剂可以通过将活性成分与常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)混合来制备。在这种情况下，将药物与适合的无刺激性赋形剂混合，该赋形剂在常温下为固体，而在直肠温度下为液体，因此会在直肠中熔化以释放药物。这种材料为可可脂和聚乙二醇。

胃肠外制剂通常为无菌的。

医生或其他技术人员将能够确定通式(I)的化合物的适合剂量，并因此确定应包含在任何特定药物制剂中的本发明化合物的量(无论是单位剂量形式还是其他形式)。

通式(I)的化合物可以与一种或多种用于治疗或预防神经变性疾病的另外的活性剂联用。

因此，在本发明的另一个方面，提供了产品，其包含通式(I)的化合物和用于治疗或预防神经变性疾病的另外的活性剂，该产品作为组合制剂用于同时、依次或分别用于治疗或预防如上所述的神经变性疾病。

现在将参考以下实施例和附图更详细地描述本发明，其中：

图1(图1A、1B和1C)显示来自对照和6名散发性帕金森病(sPD)患者的成纤维细胞系的数据。将对照与未处理的sPD、成纤维细胞、与UDCA一起温育的sPD成纤维细胞和与化合物7一起温育的sPD成纤维细胞进行比较；图1A：基础耗氧量；图1B：最大呼吸频率；图1C：ATP关联呼吸。

图2显示来自对照和6名散发性帕金森病(sPD)患者的成纤维细胞系的细胞外酸化率。将对照成纤维细胞与未处理的sPD、成纤维细胞、与UDCA一起温育的sPD成纤维细胞和与化合物7一起温育的sPD成纤维细胞进行比较。

图3显示来自未经处理或用化合物7以4mg/kg或12mg/kg的剂量处理的MTPT小鼠匀化物中线粒体呼吸链复合物I的活性。

图4显示来自用溶媒、溶媒+12mg化合物7、MPTP或MTPT+1mg、4mg或12mg化合物7处理的小鼠左侧纹状体小鼠脑匀化物中线粒体呼吸链复合物I活性的比较。

缩写

通用方法

用于24-甲酸保护为甲酯的通用方法A

使用Pelliciari的方法(ACS Med.Chem.Lett.2012,3,273-277)。将游离胆汁酸(25.0g,64mmol,1当量)溶于HPLC级MeOH(20体积)，然后添加对甲苯磺酸(0.1当量)，在30℃超声处理2h。一旦通过TLC分析认定完成，则真空除去溶剂，然后将残余物溶于EtOAc(16体积)，用饱和NaHCO

使用NaBH

使用

使用LiOH的MeOH溶液皂化甲酯的通用方法C

向甲酯(43mg,0.11mmol,1当量)在MeOH(～70体积)中的溶液中加入2M LiOH(10当量)，将该溶液在RT下搅拌至完成。真空除去溶剂，用2M HCl酸化粗残余物，然后用EtOAc(x2)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na

使用LiOH的THF溶液皂化甲酯的通用方法D

将甲酯(1.0当量)溶于THF(～20体积)，加入LiOH(2M在H

用于乙酸酯/苯甲酸酯的甲醇解的通用方法E

将乙酸酯/苯甲酸酯保护的胆汁酸(3.1g,6.12mmol,1当量)溶于无水MeOH(～10体积)，然后添加25％NaOMe的MeOH溶液(～6体积)，将RM在RT搅拌。完成时，用2M HCl将该反应体系酸化至pH 4-5，用H

使用NaOH皂化酯的通用方法F

向圆底烧瓶中加入酯(1.0当量)、NaOH(12.95当量)和MeOH(HPLC级,8.35mL/mol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。通过TLC分析完成时，减压除去溶剂。用水稀释残余物，用HCl水溶液酸化，用EtOAc(×3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到期望的化合物(如果必要时，通过快速色谱法纯化)。

使用NaBH

向圆底烧瓶中加入酮(1.0当量)、硼氢化钠(2.4当量)和无水THF(～40体积)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，用H

将仲醇保护为MOM醚的通用方法K

在0℃向起始仲醇(1当量)在无水DCM(～17体积)中的溶液中加入DIPEA(3当量)和MOM-Cl(5当量)。将该反应混合物温热至室温，然后搅拌过夜。一旦完成，则用水(～3.4mL/mmol)和甲醇(～3.4mL/mmol)使该反应混合物淬灭，然后分离各层，用EtOAc(x4)萃取水层，用盐水(x2)洗涤合并的有机层。然后干燥有机相(Na

使用HCl切割MOM-基团的通用方法L

将MOM保护的物质(1.5g,1.76mmol,1当量)溶于MeOH(～30体积)和2M HCl(～5.7mL/mmol)，将该混合物温热至70℃ 5小时。冷却反应混合物，真空浓缩，共沸以完全干燥(MeOH×3,CHCl

使用戴斯-马丁试剂进行仲醇氧化的通用方法M

在0℃向在二氯甲烷中的起始仲醇(1.0当量)逐步加入戴斯-马丁试剂(～1.2当量)，历时10min。温热至RT的18小时后，通过TLC认定反应完成，通过添加饱和Na

使用催化剂进行氢化/氢解的通用方法N

向圆底烧瓶中加入苄基保护的胆汁酸(1.0当量)、催化剂[Pd/C或PtO

由酮衍生物制备甲硅烷基烯醇醚的通用方法O

向圆底烧瓶中加入DIPA(12.6当量)和THF(1.25mL/mmol)。将该溶液冷却至-78℃，然后滴加正丁基锂(2.5M的己烷溶液,12当量)，在-78℃搅拌30min。加入TMSCl(10当量)，搅拌20min。然后滴加酮衍生物(1当量)在THF(6.5mL/mmol)中的溶液，历时10min，在该温度下搅拌45min，然后添加三乙胺(18当量)，搅拌1h。将该反应混合物温热至-20℃，用饱和NaHCO

使用在DMF中的Selectfluor对甲硅烷基烯醇醚进行亲电氟化的通用方法P

在0℃向圆底烧瓶中加入甲硅烷基烯醇醚衍生物(1.0当量)、DMF(2mL/mmol)和Selectfluor(1.5当量)在DMF(3mL/mmol)中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌过夜，用H

用于形成偶联物的通用方法Q

将氟代胆汁酸(1当量)溶于无水DMF(12体积)，同时在氩气气氛中搅拌。加入HATU(1当量)、DIPEA(3.0当量)和氨基酸(1.1当量)，将该反应体系在RT搅拌16h。完成时，将反应混合物直接干燥上硅胶，通过C18色谱法纯化(MeOH的H

实施例1：2β-氟化合物的合成

A.3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(1A.1)

使用Pellicari的方法(ACS Med.Chem.Lett.2012,3,273-277)。将CDCA(25.0g,64mmol,1当量)溶于HPLC级MeOH(500mL)，然后添加对甲苯磺酸(1.21g,6.4mmol,0.1当量)，在30℃超声处理2h。一旦通过TLC分析认定反应完成，则真空除去溶剂，然后将残余物溶于EtOAc(400mL)，用饱和NaHCO

LRMS(ESI

B.7α-羟基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1B.1)

向3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(10.0g,24.6mmol,1当量)在水(25mL)和叔丁醇(100mL)中的溶液中加入KBr(5.9g,49.0mmol,2当量)、KHCO

LRMS(ESI

C.7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1C.1)

在0℃向7α-羟基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(3.0g,7.41mmol,1当量)在无水DCM(50mL)中的溶液中加入DIPEA(3.83mL,22.2mmol,3当量)和MOM-Cl(2.82mL,37.1mmol,5当量)。将该反应混合物温热酯室温，然后搅拌过夜。一旦完成，则用水(25mL)和甲醇(25mL)使该反应混合物淬灭。然后分离各层，用EtOAc(4×75mL)萃取水层，用盐水(2×150mL)洗涤合并的有机层。然后干燥有机相(Na

LRMS(ESI

D.7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯(1D.1)和7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(ID.2)

按照Barlow等人的方法(Eur.J.Med.Chem.2011,46,1545-1554)。在0℃向7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1.0g,2.23mmol,1当量)在无水DCM(20mL)中的溶液中加入Et

E.2β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1E.1)和4β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1E.2)

按照Fujimoto等人的方法(Bioorg.Med.Chem.Lett.2011,21,6409-6413)。向7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-2-烯酸酯和7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(1.10g,2.2mmol,1当量)在无水乙腈中的溶液中加入

1E.1:

LRMS(ESI

1E.2:

LRMS(ESI

F.2β-氟-3α-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.1)和2β-氟-3β-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.2)

向2β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(260mg,0.56mmol,1当量)在无水四氢呋喃(20mL)中的溶液中加入硼氢化钠(64mg,1.70mmol,3当量)，将该反应混合物在室温搅拌过夜。一旦通过TLC分析认定完成，则用EtOAc(150mL)稀释该反应体系，用水(100mL)淬灭，分离各层，然后再用EtOAc(2×100mL)萃取水层。然后用水(150mL)和盐水(150mL)洗涤合并的有机层，然后干燥(Na

1F.1:

LRMS(ESI

1F.2:

LRMS(ESI

G.2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)

使用通用方法L，然后按照通用方法C，使2β-氟-3α-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.1；118mg,0.25mmol,1当量)脱保护，得到2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)，为淡黄色固体(72mg,0.18mmol,70％)。

化合物1:

LRMS(ESI

H.2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)

使用通用方法L，然后按照通用方法C，使2β-氟-3β-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.2；25mg,0.053mmol,1当量)脱保护，得到2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)，为树胶状固体(21mg,0.05mmol,96％)。

化合物2:

LRMS(ESI

实施例2：2α-氟化合物的合成

A.7-氧代-5β-胆-2-烯酸甲酯(2A.1)和7-氧代-5β-胆-3-烯酸甲酯(2A.2)

将3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(60g,148mmol,1.0当量；由7-酮基石胆酸，使用方法A合成)和DMAP(30g,122mmol,2.0当量)溶于DCM(500mL)，用冰冷却至0℃。然后加入三氟甲磺酸酐(26.1mL,156mmol,1.05当量)，历时15min期限。将该反应体系在0℃搅拌2小时，不过，没有反应进展。然后将反应体系缓慢地温热至10-12℃，通过TLC监测进展。2h后认定完成，用2M HCl(500mL)使RM淬灭，在RT搅拌10min。分离各层，用盐水(500mL)萃取水层，干燥(Na

2A.1和2A.2:

LRMS(ESI

B.2β,3β-环氧-7-氧代-5β-胆烷甲酸酯(2B.1)和3β,4β-环氧-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2B.2)

将烯烃7-氧代-5β-胆-2-烯酸甲酯和7-氧代-5β-胆-3-烯酸甲酯(20g,51.8mmol,1当量)的混合物在室温溶于DCM(200mL)，然后添加mCPBA(19.1g,77.7mmol,1.5当量)。1.5h后认定反应完成，其中在反应期间该混合物由溶液变成混悬液。用饱和Na

2B.1:

LRMS(ESI

2B.2:

LRMS(ESI

C.2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2C.1)

将2β,3β-环氧-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(830mg,2.06mmol,1当量)在无水DCM(25mL)中的溶液冷却至0℃，然后添加70％HF.吡啶(830μL)，允许温热至RT。2d后认定完成，再将反应体系冷却至0℃，谨慎地通过滴加饱和NaHCO

LRMS(ESI

D.2α-氟-3α-苯甲酰氧基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2D.1)

向2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1.05g,2.5mmol,1当量)、PPh

LRMS(ESI

E.2α-氟-3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2E.1)

使用Zhao等人的方法(Eur.J.Org.Chem.,2005,2005,4414-4427)。将2α-氟-3α-苯甲酰氧基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(400mg,0.76mmol,1当量)和碳酸钾(20mg,0.15mmol,0.2当量)的混合物混悬于无水MeOH(20mL)，在RT搅拌16h。16h后，该反应混合物形成无色溶液，通过TLC分析认定完成。真空除去溶剂，使粗残余物溶于EtOAc/H

LRMS(ESI

F.2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2F.1)和2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2F.2)

使用通用方法B，还原2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(300mg,0.71mmol,1当量)。经快速色谱法纯化粗物质(PE/EtOAc:65:35→55:45)，得到2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(140mg,0.33mmol,46％)和2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(107mg,0.25mmol,35％)。

2F.1:

LRMS(ESI

2F.2:

LRMS(ESI

G.2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2G.1)和2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2G.2)

使用通用方法B，还原2α-氟-3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(270mg,0.64当量,1当量)。经快速色谱法纯化粗产物(PE/丙酮:75:25)，得到33mg纯的7α-OH类似物与140mg 7α-OH和7β-OH差向异构体的混合物。通过快速色谱法再纯化该混合物(PE/EtOAc:60:40→50:50)，进一步得到纯的2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(总计-74mg,0.17mmol,27％)和纯的2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(45mg,0.11mmol,17％)，两者均为树胶状固体。

2G.1:

LRMS(ESI

2G.2:

LRMS(ESI

H.2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)

使用通用方法C，水解2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(105mg,0.25mmol,1当量)，得到2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)(96mg,0.23mmol,94％)，为淡黄色固体。

LRMS(ESI

I.2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)

使用通用方法C，水解2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(90mg,0.21mmol,1当量)，得到2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)(80mg,0.19mmol,93％)，为无色固体。

LRMS(ESI

J.2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)

使用通用方法C，水解2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(74mg,0.17mmol,1当量)，得到2α-氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)(65mg,0.16mmol,93％)，为无色固体。

LRMS(ESI

K.2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)

使用通用方法C，水解2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(44mg,0.10mmol,1当量)，得到2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)(40mg,0.97mmol,97％)，为无色固体。

LRMS(ESI

实施例3：2,2-二氟代类似物的合成

A.3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3A.1)

使用通用方法A，保护UDCA(100g,250mmol,1当量)，得到3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯，为白色固体(103g,250mmol,定量)。

LRMS(ESI

数据与文献一致性(m.p.除外)；参见J.Ren,Y.Wang,J.Wang,J.Lin,K.Wei、R.Huang,Steroids 2013,78,53-58.

B.3α-乙酰氧基-7β-羟基-5β-胆烷酸甲酯(3B.1)

将3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(30.0g,73.8mmol,1当量)、乙酐(35mL,369mmol,1当量)和NaHCO

LRMS(ESI

C.3α-乙酰氧基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3C.1)

使用通用方法K，将3α-乙酰氧基-7β-羟基-5β-胆烷酸甲酯(72g,160.5mmol)保护为MOM醚。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:85:15→80:20→70:30→60:40)，得到3α-乙酰氧基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(62g,126mmol,79％)。

LRMS(ESI

D.3α-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3D.1)

使用通用方法E，水解3α-乙酰氧基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(82g,166mmol,1当量)，得到3α-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色树胶状物(75g,166mmol,定量收率)。

LRMS(ESI

E.7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯(3E.1)和7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(3E.2)

将3α-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(75g,166mmol,1当量)溶于DCM(650mL)，用冰冷却至5℃，然后添加二甲基吡啶(58mL<500mmol,3当量)和Tf

3E.1/3E.2:

F.2α-乙酰氧基-3β-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3F.1)和3β,4β-环氧-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3F.2)

将7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯和7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(63.0g,146mmol,1当量)的混合物与mCPBA(54.0g,1.5当量)溶于DCM，在RT搅拌1h。用饱和Na

3F.1:

LRMS(ESI

3F.2:

LRMS(ESI

G.2α-乙酰氧基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3G.1)

使用通用方法K，将2α-乙酰氧基-3β-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(11.0g,21.6mmol,1当量)保护为MOM衍生物，得到2α-乙酰氧基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色油状物/树胶状物(13.0g,定量)。

LRMS(ESI

H.2α-羟基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3H.1)

使用通用方法E，使2α-乙酰氧基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(13.0g,21.6mmol,1当量)甲醇解，得到2α-羟基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色树胶状物(9.5g,18.3mmol,85％)。

LRMS(ESI

I.2-氧代-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3I.1)

使用通用方法M，氧化2α-羟基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(9.2g,18.0mmol 1当量)，然后经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:80:20→70:30→65:35)，得到2-氧代-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色树胶状够固体(8.5g,16.7mmol,93％)。

LRMS(ESI

J.2,2-二氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3J.1)和2-氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆-1-烯酸甲酯(3J.2)

将2-氧代-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(8.0g,15.7mmol,1当量)溶于DCM(40mL)，然后添加DAST(1004mL,78.6mmol,5当量)，将该反应混合物在RT搅拌5小时。然后用DCM(100mL)稀释混合物，然后滴加至冰冷NaHCO

3J.1:

LRMS(ESI

3J.2:

LRMS(ESI

K.2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3K.1)

按照通用方法L，使2,2-二氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1.5g,1.76mmol,1当量)脱保护，得到2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(1.3g,定量收率)。

LRMS(ESI

L.2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯(3L.1)+水合物(3L.2)

使用通用方法M，氧化2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(1.0g,2.26mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯+水合物的混合物(900mg,2.05mmol,91％-合并收率)。

3L.1

LRMS(ESI

3L.2 LRMS(ESI

M.2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3M.1)+2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3M.2)

使用通用方法B，还原2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯和水合物的混合物(750mg,1.71mmol,1当量)。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:70:30→60:40→50:50)，得到2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(300mg,0.68mmol,40％)和2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(26mg,0.06mmol,4％)。

3M.1:

LRMS(ESI

3M.2:

LRMS(ESI

N.2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)

使用通用方法C，水解2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(60mg,0.14mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)，为淡黄色固体(50mg,0.12mmol,83％)。

LRMS(ESI

O.2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)

使用通用方法C，2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(75mg,0.17mmol,1当量)水解，得到2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)，为白色固体(70mg,0.16mmol,96％)。

LRMS(ESI

P 2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸(对比化合物E)+水合物(3P.1)

使用通用方法C，水解2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯和水合物(60mg,0.14mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸(化合物E)和水合物，为白色固体，为酮/水合物/乙缩醛加合物的混合物(55mg,0.13mmol,93％)。

LRMS(ESI

Q.2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)

使用通用方法C，水解2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(25mg,0.06mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)，为树胶状固体(20mg,0.05mmol,78％)。

LRMS(ESI

A.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙磺酸钠(化合物10)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(7.4mg,0.017mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙,磺酸钠，为澄清残余物(7.4mg,77％)。

LRMS(ESI

B.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸钠(化合物11)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸钠，为澄清残余物(17.66mg,73％)。

HRMS(ESI

C.N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸(化合物12)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(25.36mg,0.059mmol)，得到N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸，为澄清残余物(13.3mg,45％)。

HRMS(ESI

D.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸钠(化合物13)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸钠，为澄清残余物(18.18mg,68％)。

HRMS(ESI

E.1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸钠(化合物14)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸钠，为残余物(21.88mg,83％)。

HRMS(ESI

F.3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸钠(化合物15)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸钠，为残余物(21.41mg,81％)。

HRMS(ESI

G.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉(化合物16)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉，为澄清残余物(9.83mg,65％)。

HRMS(ESI

H.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸钠(化合物17)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸钠，为澄清残余物(18.12mg,77％)。

HRMS(ESI

I.N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸二钠(化合物18)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸二钠，为澄清残余物(14.81mg,59％)。

HRMS(ESI

J.N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)乙磺酸钠(化合物19)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙,磺酸钠，为澄清残余物(9.49mg,36％)。

HRMS(ESI

K.3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸钠(化合物20)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(25.0mg,0.058mmol)，得到3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸钠,，为澄清残余物(25.44mg,76％)。

HRMS(ESI

L.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸钠(化合物21)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(25.0mg,0.058mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸钠，为澄清残余物(27.63mg,87％)。

HRMS(ESI

M.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸钠(化合物22)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(30.0mg,0.070mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸钠。H NMR(400MHz,MeOD)δ4.04(2H,app.t,J＝5.5Hz),3.78(1H,br.s),3.44(2H,app.t,J＝5.5Hz),3.41(1H,m),2.26(1H,ddd,J＝15.5,10.5,5.2Hz),2.18-1.06(23H,m),1.05(3H,s),0.98(3H,d,J＝6.5Hz),0.71(3H,s)ppm。

HRMS(ESI

N.O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙磺酸钠(化合物23)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙磺酸钠，为澄清残余物(15.06mg,58％)。

HRMS(ESI

O.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸钠(化合物24)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸钠，为白色残余物(24.04mg,85％)。

HRMS(ESI

P.N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸钠(化合物25)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸钠，为澄清残余物(27.97mg,92％)。

HRMS(ESI

Q.N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸钠(化合物26)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸钠，为澄清残余物(28.41mg,95％)。

HRMS(ESI

R.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜(化合物27)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜，为澄清残余物(22.49mg,90％)。

HRMS(ESI

S.N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物28)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物，为澄清残余物(20.71mg,77％)。

HRMS(ESI

T.N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物29)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物，为残余物(23.90mg,76％)。

HRMS(ESI

U.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物(化合物30)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物，为澄清残余物(22.2mg,87％)。

HRMS(ESI

V.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺(化合物31)

使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺，为残余物(22.44mg,88％)。

HRMS(ESI

对比实施例5：2-氟烯烃化合物的合成

A.2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(4A.1)

使用通用方法L，使来自实施例4J的2-氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆-1-烯酸甲酯(900mg,1.76mmol,1当量)脱保护，得到2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯，为白色树胶状固体(750mg,定量收率)。

LRMS(ESI

B.2-氟-3,7-二-氧代-5β-胆-1-烯酸甲酯(4B.1)

使用通用方法M，氧化2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(600mg,1.42mmol,1当量)，然后经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:80:20→70:30→60/40)，得到2-氟-3,7-二-氧代-5β-胆-1-烯酸甲酯，为树胶状固体(400mg,0.96mmol,67％)。

LRMS(ESI+)m/z:419.5[M+H]

C.2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(4C.1)

使用通用方法B，还原2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(400mg,0.96mmol,1当量)，然后经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:70:30→60:40→50:50)，得到2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯，为树胶状固体(99mg,0.22mmol,25％)。

LRMS(ESI

D.2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸(对比化合物F)

使用通用方法C，水解来自步骤A的2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(60mg,0.14mmol,1当量)，得到2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸(化合物F)，为白色固体(40mg,0.10mmol,70％)。

LRMS(ESI

E.2-氟-3,7-二氧代-5β-胆-1-烯酸(对比化合物G)

使用通用方法C，水解来自步骤B的2-氟-3,7-二-氧代-5β-胆-1-烯酸甲酯(50mg,0.12mmol,1当量)，得到2-氟-3,7-二氧代-5β-胆-1-烯酸(化合物G)，为白色固体(45mg,0.11mmol,93％)。

LRMS(ESI

F.2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸(对比化合物H)

使用通用方法C，水解来自步骤C的2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(50mg,0.11mmol,1当量)，得到2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸(化合物H)，为浅白色固体(45mg,0.11mmol,97％)。

LRMS(ESI

生物学实施例

缩写

实施例6

A.原代成纤维细胞的培养、iNPC的产生和培养

将成纤维细胞在DMEM(Invitrogen)中培养，每3-5天使用胰蛋白酶常规传代一次，以便将它们分离。如前所述产生诱导的神经祖细胞(iNPC)(Meyer等人“Direct conversionof patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity ofastrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS”Proc Natl Acad SciUSA 2014)。将iNPC维持在纤连蛋白(Millipore)包被的组织培养皿中的DMEM/Ham F12(Invitrogen)；N2、B27补充剂(Invitrogen)和FGFb(Peprotech)中，并且每2-3天使用Accutase常规传代一次，以便使它们脱粘附。

B.iNPC的多巴胺能神经元分化

简言之，将iNPC接种在6孔板中，在含有Glutamax

C.免疫荧光染色和ELISA

将细胞接种于96孔板中，使用4％多聚甲醛固定30分钟。PBS洗涤细胞后，使用0.1％Triton

按照制造商的说明使用多巴胺研究ELISA试剂盒(Labor Diagnostika NordGmbH&Co.KG)进行多巴胺ELISA。多巴胺释放是在37℃下温育细胞获得，每行同时使用三种不同的条件。去除所有孔中的培养基，然后第一个孔在含Ca

培养成纤维细胞并以每孔10000个细胞在Griener黑色384μ

ATP方案一般如Mortiboys等人“Mitochondrial function and morphology areimpaired in parkin-mutant fibroblasts”,Ann Neurol.2008年11月；64(5):555-65中所述进行。简言之，将成纤维细胞培养并接种到白色384孔板中，每孔5000个细胞且培养基体积为50μl。将板在温育箱中放置过夜，使成纤维细胞粘附在板表面。第二天早上，将基于葡萄糖的培养基替换为25μl的基于半乳糖的培养基。使用ECHO 550液体处理系统将化合物添加到板中。对孔进行给药以提供0.06nM-300nM的8个点浓度范围的化合物。给药后，向孔中再加入25μl基于半乳糖的培养基，然后在培养箱中放置24小时。在此温育之后，将培养基从板中除去，并用无菌PBS将孔洗涤两次。向孔中填充25μl无菌PBS，然后加入12.5μl来自ATPlite

ATP检测后立即用

使用如下公式确定每个孔的ATP定量：

在每行和每化合物一式三份重复测定后，将数据输入到Graph pad Prism 7软件组中，其中使用默认的“[激动剂]与响应的关系(三个参数)”方程生成剂量响应曲线。

根据EC

来自显示为“[激动剂]与响应的关系(三个参数)”方程结果不明确的化合物的结果被排除在几何平均值计算之外，因为包含它们会引入高偏离。

将成纤维细胞在Seahorse 24孔板中铺板，每孔有50,000个细胞。使细胞附着2天。将培养基更换为含有葡萄糖和丙酮酸钠的Seahorse DMEM培养基，并在37度正常空气CO

将离体小鼠大脑在250mM蔗糖、20mM HEPES、3mM EDTA、pH 7.5的缓冲液中于4℃匀化。对于皮质样品，使用Dounce匀化器进行匀化，对于分离的纹状体，通过重复通过0.5mm注射器进行匀化。然后将样品与30μl来自AbCam比色复合物I检测试剂盒的洗涤剂一起在冰上温育20分钟。然后将样品以13,000rpm速度离心30min。使用试剂盒封闭缓冲液在AbCam比色复合物I测定试剂盒板上封闭每个条件下的一式三份样品3小时。然后使用试剂盒洗涤缓冲液洗涤样品3次，然后加入含有NADH和比色染料的试剂盒测定缓冲液。将测定板在读板器上以动力学测定程序读取450nm的数值，以30秒的间隔读取50分钟。

D.iNeurons中的线粒体功能和形态测量

将细胞在96孔板中铺板；对于活细胞成像，将细胞与80nM四甲基罗丹明(TMRM)、1μM

结果

成纤维细胞

当用本发明的化合物或对比化合物处理时，在来自6(表3)或3(表4)名散发性帕金森病患者的成纤维细胞中测量了线粒体膜电位。结果如表1和表2所示，其中“底部(Bottom)”是指使用最低化合物剂量(0.06nM)时的最大响应值，而“顶部(top)”是指使用最高化合物剂量(300nM)时的最大响应值。

表2：

NB:与对照相比，sPD患者的MMP平均降低18％；因此，来自溶媒处理的sPD患者MMP水平增加为118％使MMP恢复到对照水平。

当用本发明的化合物或对比化合物处理时，在来自6(表3)或3(表4)名散发性帕金森病患者的成纤维细胞中测量了细胞ATP水平。结果如表3和表4中所示，其中“底部”是指使用最低化合物剂量(0.06nM)时的最大响应值，而“顶部”是指使用最高化合物剂量(300nM)时的最大响应值。

NB:与对照相比，sPD成纤维细胞具有的细胞ATP水平平均降低24％。因此，溶媒处理的sPD成纤维细胞的％为124％是相对于对照ATP水平的增加。

上述的MMP和ATP测定连同毒性测量包含化合物在初级患者成纤维细胞中的初步筛选。当考虑哪些化合物在初级筛选中最具有活性时，所有信息都应考虑在内，包括EC50值，表明两种测定的效力和最大反应％；基于综合活性，生物学专家对每种化合物作出决定。

得自Seahorse测定的6个散发性PD患者成纤维细胞系和6个对照的耗氧数据如图1A、1B和1C所示，从中可以看出，sPD成纤维细胞显示基础线粒体呼吸显著降低42％(***p<0.005)，最大呼吸为48％(*p<0.05)，ATP相关的呼吸为18％(*p<0.05)。其并没有通过用UDCA处理得到改善，但是用化合物7处理显著改善了所有三个线粒体参数。注意，两种化合物均以EC90浓度给药，UDCA为100nM，化合物7为50nM。因此，显然化合物7提供了线粒体功能的更大增加，如通过耗氧量所测量的，并且它在较低浓度下提供了这种作用。

与对照相比，sPD成纤维细胞的ECAR(糖酵解的替代测量值)显著降低44％(***p<0.005)。如图2所示，用UDCA处理未改变这一点，但用化合物7处理显著改进了这一点。

上述数据显示化合物对来自sPD患者原代成纤维细胞的线粒体保护作用，然而，在PD中主要影响的细胞类型为多巴胺能神经元。下面的数据显示了得自三个sPD患者的多巴胺能神经元的结果；这些培养物约为96％的多巴胺能神经元，且目前这种方法是从患者细胞中产生这种纯多巴胺能培养物的唯一方案(由Mortiboys,University of Sheffield开发的方法)；因此，这是代表最接近PD中受影响的神经元的患者来源的模型。

下表5显示未处理或用UDCA或化合物7处理时，来自sPD患者与对照组iNeurons相比的线粒体功能和神经元形态测量结果。

表5中的数据非常清楚地表明，化合物7除了改善神经元形态和降低细胞凋亡水平(如通过激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3水平测定的)之外，还对sPD来源的多巴胺能神经元中的两个线粒体参数提供保护作用。细胞凋亡是培养物中多巴胺能神经元和PD患者中多巴胺能神经元细胞死亡的主要机制。

图3显示，在以剂量依赖性方式给予4mg/kg和12mg/kg化合物7后，野生型小鼠全脑匀化物中线粒体呼吸链复合物I活性显著增加。与未处理的对照相比，使用4mg/kg剂量增加了约380％，而使用12mg/kg剂量，复合物I活性增加约800％(*p<0.05)。

图4显示给予如下物质的小鼠的左侧纹状体小鼠脑匀化物中复合物1活性的结果：

·溶媒

·溶媒+12mg化合物7

·MPTP

·MPTP+1mg化合物7

·MPTP+4mg化合物7

·MPTP+12mg化合物7

与未处理的对照相比，单独用化合物7处理导致复合物I活性增加约30％(*p<0.05)。与未处理的对照相比，用MPTP处理导致复合物I活性降低50％(**p<0.01)，但同时使用1mg化合物7和MPTP处理可防止MPTP诱导的复合物I活性丧失并将复合物I保持在正常水平(与单独的MPTP处理相比**p<0.01)，增大剂量的化合物7同时与MPTP组合显然可以防止MPTP对复合物I活性造成的任何损失。

来自sAD和家族性AD(PSEN1突变体)的成纤维细胞使用相同的初步筛选测定法测试总细胞ATP水平。与对照组相比，sAD和PSEN1患者的成纤维细胞减少21％。下表6中显示的数据为用100nM浓度的化合物处理24小时后ATP水平的平均增加值。由于细胞具有的ATP水平平均下降21％，因此，增加21％将恢复到对照水平，任何超过21％的增加都超出对照水平。

数据清楚地表明，与UDCA处理相比，用化合物2、7和8处理具有更有益的细胞ATP水平的恢复。此外，化合物2和8特别有效地显著提高了ATP水平。