一种CAR-CXCL12 T淋巴细胞及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种CAR-CXCL12 T淋巴细胞及其制备方法。

背景技术

嵌合抗原受体基因修饰T(chimeric antigen receptor gene-modified T，CART)细胞疗法是当前肿瘤免疫细胞治疗的研究热点及重点。它将抗体对肿瘤抗原的高度亲和性和T淋巴细胞的杀伤机制有机结合，使CAR-T能特异性地识别肿瘤细胞，还能不依赖MHC的限制性而直接杀伤肿瘤细胞。有研究表明，它在血液系统肿瘤治疗已经取得重要进展，并且正在逐渐延伸到实体瘤的临床治疗中，有望攻克实体瘤治疗的难关。嵌合型抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是一种融合分子，由胞外抗原结合区，跨膜区及与T细胞受体(T cell receptor，TCR)的胞内信号区构成。其中胞外抗原结合区是赋予CAR-T细胞识别特定肿瘤抗原的关键部分，它源于抗体的抗原结合基序，具备连接VH和VL序列构建单链可变区(single chain fragment variable，ScFv)的作用。这决定了重组CARs与抗原的结合可以不依靠MHC的递呈，这可以避免肿瘤细胞MHC表达下调这一免疫逃逸机制；跨膜区连接胞外抗原结合区和胞内信号区，一般由二聚体膜蛋白组成，主要包括CD3ζ、CD4、CD8、CD28等，能将CARs结构锚定于T细胞膜上。胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(immune-receptor tyrosine-based activationmotifs，ITAM)，CARs接受肿瘤相关抗原(tumor-associated angtige，TAA)信息后，不直接传递信号，而是通过CD3或高亲和性受体Fc RI的胞内区使T细胞活化，活化后的T细胞分泌孔蛋白、颗粒酶及细胞因子协同作用杀死肿瘤细胞，发挥效应功能。免疫细胞治疗技术中的CAR-T疗法近年来发展非常迅速，通过基因改造的技术给T细胞加入嵌合抗体后，其靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的T细胞有所提高。CAR-T技术不仅可以克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态，还可以每次只靶向一种类型的肿瘤抗原，为肿瘤治疗带来了新的希望。

现有的嵌合抗原受体T淋巴细胞治疗(CAR-T)只是针对血液系统肿瘤，在实体瘤中的应用未见突破。具体原因多为：1、缺少特异性靶点；2、CAR-T细胞不能进入实体瘤内。本发明是在和肿瘤放疗联合解决了肿瘤的特异性靶点问题及实体瘤的屏障问题，是一种广谱的肿瘤细胞治疗方法。

发明内容

本发明的目的在于提出一种CAR-CXCL12 T淋巴细胞及其制备方法，通过基因芯片筛选靶点CXCR4，针对靶点CXCR4制备了其嵌合抗原受体CXCL12，感染制备T淋巴细胞，通过体外杀伤实验、荷瘤大鼠动物实验后显示了优越的抗肿瘤治疗的疗效且未发现明显的不良反应。同时，这是一种广谱的肿瘤细胞治疗方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供一种CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞，所述T细胞的表达靶向CXCR4的嵌合抗原受体为CAR-CXCL12，其基因序列见SEQ ID NO.1。

本发明进一步保护一种上述CAR-CXCL12修饰的淋巴T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的T淋巴细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向CXCR4的嵌合抗原受体CAR-CXCL12，从而获得CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞。

作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

S1.准备待改造的T淋巴细胞：将新鲜血液稀释后加入Ficoll，离心，吸取中间白膜层，洗涤，培养，得到待改造的T淋巴细胞；

S2.制备CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞：向改造的T淋巴细胞中加入CXCL12二代CAR的慢病毒和感染试剂，培养48h后加入新鲜培养基，继续培养5天，得到CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述洗涤方法为加入生理盐水后混匀，离心，分离，重复2-3次。

作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述培养条件为37℃，5％CO

作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述感染试剂为TRANS B。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中所述培养条件为37℃，5％CO

本发明进一步保护一种制剂，所述制剂含有上述的CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明进一步保护上述的CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备选择性杀伤肿瘤的药物或制剂。

本发明进一步保护一种选择性杀伤肿瘤的方法，包括：给需要治疗的对象施用安全有效量的上述的CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞、或上述的制剂。

本发明具有如下有益效果：本发明通过基因芯片筛选靶点CXCR4，针对靶点CXCR4制备了其嵌合抗原受体CXCL12，感染制备T淋巴细胞，通过体外杀伤实验、荷瘤大鼠动物实验后显示了优越的抗肿瘤治疗的疗效且未发现明显的不良反应。同时，这是一种广谱的肿瘤细胞治疗方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为CAR-CXCL12修饰的淋巴T细胞的制备流程图；

图2为本发明实施例1中CART-对照组感染效率图；

图3为本发明实施例1中CART-CXCL12感染效率图；

图4为本发明测试例1中CART-CXCL12与靶细胞存在下的共聚焦图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1CAR-CXCL12修饰的淋巴T细胞的制备方法

制备方法见图1。

S1.准备待改造的T淋巴细胞

(1)将新鲜血液转移到50mL离心管中。用生理盐水按照1:1(体积比)进行稀释，轻轻上下吹打3-5次混匀。

(2)将6mL Ficoll加入到15mL离心管中，竖直放置到水平台面上静止备用。将稀释好的血液(总体积8mL)用移液管缓慢均匀加入到竖直放置在台面的含Ficoll溶液的离心管中。

(3)将加好血液与Ficoll的离心管轻轻转移至离心机中。在转移离心管过程尽量减少晃动，保持离心管竖直，以避免打破页面分层。室温400g离心30分钟。

(4)离心结束后，轻轻转移离心管至超净台中。用移液器吸取中间的白膜层(即淋巴细胞层)转移至新的50mL离心管中。尽量避免吸取到下层或上层的细胞，避免造成污染。

(5)加入30mL生理盐水至上述转移出来的淋巴细胞中，轻轻吹打混匀，60-100g室温离心10分钟。重复洗涤淋巴细胞，去除上清，加入一定量的完全培养基重悬细胞。

(6)计数调整密度为5×10

S2.制备CAR-CXCL12修饰的T淋巴细胞

(1)收集上述PBMC，室温300g离心4min，调整密度为5×10

(2)将细胞培养板置于37℃，5％CO

(3)第三天每孔加入1ml新鲜的培养基，继续培养。

(4)第七天计数计算扩增倍数。

S3.CART表型和分型检测

(1)计数每个细胞，取出1.0x106个，1000rpm，离心3min，加入100ul FACS buffer重悬细胞，加入15ul APC anti-human CD8、15ul PE anti-human CD4、15ul PerCY5.5anti-human CD3。

(2)4℃避光孵育30min，1000rpm，离心3min，去掉上清加入FACS buffer再洗两遍。

(3)加入150ul FACS buffer重悬细胞，FACS检测荧光。

经检测，结果见图2-3。图2中CART-对照组感染效率约为47.9％，图3中CART-CXCL12感染效率约为31.3％。其中，CART-CXCL12细胞亚群分布比例见表1。

表1

测试例1CART的杀伤实验：

1、体外杀伤：

(1)CART-CXCL12：靶细胞比例为20:1共培养4hr后，靶细胞裂解率为20％。

(2)CART-CXCL12与SGC7901-CXCR4细胞，共孵育在96孔玻璃板中，通过共聚焦显微镜，每隔1小时，共计6小时对CART细胞与靶细胞的相对位置进行拍照。

实验结果与分析：CART-CXCL12与SGC7901-CXCR4在6h之内的相对位置结果如图4，箭头表示被CART细胞识别并即将杀伤的靶细胞

2、动物实验

因为人和大鼠该靶点序列高度一致，因此选用具有免疫力的wistar大鼠walker256细胞株皮下移植瘤模型。

a.制备大鼠walker256细胞株腹水瘤模型，抽取腹水将细胞浓度调整至10

b.成瘤后分别对两组大鼠后肢单侧肿瘤进行8GY×3f(每次8GY，每天1次，连续3天)次进行X线照射治疗，休息一天后进行CART治疗，尾静脉注射细胞量为：5×10

c.结果：

肿瘤大小：治疗组：0.7±0.13cm；对照组1.6±0.16cm；

生存时间：治疗组：中位OS 45天；对照组：中位OS 13天。

从上述实验结果推断该产品具有临床转化潜力。

与现有技术相比，本发明通过基因芯片筛选靶点CXCR4，针对靶点CXCR4制备了其嵌合抗原受体CXCL12，感染制备T淋巴细胞，通过体外杀伤实验、荷瘤大鼠动物实验后显示了优越的抗肿瘤治疗的疗效且未发现明显的不良反应。同时，这是一种广谱的肿瘤细胞治疗方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 李强

<120> 一种CAR-CXCL12 T淋巴细胞及其制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaactcg 60

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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