一种降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于毒素降解技术领域，特别涉及一种降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂及其制备方法。

背景技术

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、串珠镰刀菌、等多种镰刀菌属产生的一种次级代谢产物，通常可在谷物及其副产物中发现。ZEN及其衍生物的结构与17β-雌二醇非常相似，因此能竞争性与雌激素受体结合，引发一系列类雌激素效应。因此，ZEN进入动物体内，会对动物生殖系统造成损害。除此之外，ZEN还具有遗传毒性、细胞毒性、免疫毒性、致癌性等。ZEN大量存在于发霉的玉米、高梁、小麦等作物中，是世界范围内粮食饲料的污染物之一，据联合国粮农组织估计，全世界每年有25％的农作物被霉菌毒素污染，其中受ZEN污染严重，这不仅给畜牧业带来了巨大经济损失，同时给动物及人类健康带来严重威胁。

传统的去除ZEN的方法主要有物理、化学、生物法。物理脱毒法主要靠吸附剂的吸附能力处于玉米赤霉烯酮，但此种方法脱毒不彻底，容易造成二次污染。化学方法利用一些活性物质与ZEN发生化学反应，从而改变其结构，达到去毒的目的，此种方法效果不稳定，成本较高，损失较多营养成分，去毒效果不理想。微生物法一是利用微生物菌体的吸附作用，二是通过微生物将毒素转化为无毒的物质。微生物降解法具有特异性强、效率高、无污染等优点，备受行业研究者们的关注。目前有很多研究报道，一些细菌、真菌及代谢酶等能降解ZEN，但有些微生物降解活性低，降解酶难以分离纯化，降解产物不能做到无毒等，另外有些降解活性高的微生物不能直接添加至饲料中，从而限制了其在畜牧行业的应用。

因此，为解决饲料及原料中ZEN污染问题，克服现有ZEN微生物降解菌活性低、难以实现生产利用等问题。有必要研发出可安全、高效降解饲料及原料中ZEN的微生物制剂。

发明内容

本发明的目的在于提供本发明提供一种用于降解饲料中玉米赤霉烯酮的微生物制剂，该微生物制剂即可高效降解饲料中玉米赤霉烯酮、安全无害，又可直接在饲料中添加使用。

本发明的另一目的在于提供一种用于降解饲料中玉米赤霉烯酮的微生物制剂的制备方法，以获得能够有效地降解饲料中玉米赤霉烯酮的微生物制剂，并且其制备方法简单，成本较低。

为实现上述目的，本发明提供了一种降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂的制备方法，其特征在于，包括：

将斯塔普氏菌和贝莱斯芽孢杆菌分别进行培养，得到斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液；

斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液混合，得到复合菌菌液；

将所述复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵；

所述复合菌菌液中的所述斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液细胞数比为17:10～17:15。

进一步，上述技术方案中，进行所述混合发酵是将所述复合菌培养基装入发酵罐，将所述复合菌菌液接入所述复合菌培养基中，在温度30～31℃，压力0.05～0.08MPa，通气量0.8～1.0，PH 6.5～7.0，发酵32～36h；复合菌培养基装入发酵罐的装料系数为0.6；所述复合菌培养基按重量浓度计包括蔗糖38～41g/L，豆粕39～42g/L，(NH4)

进一步，上述技术方案中，所述斯塔普氏菌来自菌株保藏号CGMCC No.17759，贝莱斯芽孢杆菌来自菌株保藏号CGMCC No.17328。

进一步，上述技术方案中，将所述斯塔普氏菌进行培养是将所述斯塔普氏菌接入LB液体培养基中进行培育，得到第一次斯塔普氏菌活化种子液后，将一次斯塔普氏菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中培养得塔普氏菌菌液；将所述贝莱斯芽孢杆菌进行培养是将所述贝莱斯芽孢杆菌接入LB液体培养基中进行培育，得到第一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液后，将一次活化种子液继续接种至LB液体培养基中培养得贝莱斯芽孢杆菌菌液。

进一步，上述技术方案中，将所述LB液体培养基pH值调整为7.2。

进一步，上述技术方案中，将斯塔普氏菌接入LB液体培养基中，35～39℃、200～220r培养23～25h，得到第一次斯塔普氏菌活化种子液，将一次斯塔普氏菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中，35～39℃、200～220r培养34～36h后得塔普氏菌菌液。

进一步，上述技术方案中，将贝莱斯芽孢杆菌接入LB液体培养基中，35～39℃、200～220r培养23～25h，得到第一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液，将一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中，35～39℃、200～220r培养34～36h后得贝莱斯芽孢杆菌菌液。

进一步，上述技术方案中，所述复合菌菌液接入所述复合菌培养基中质量比为1％～1.5％。

同时，本发明提供了一种降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂，由上述技术方案中降解玉米赤霉烯酮的微生物制剂的制备方法制成。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过将斯塔普氏菌和贝莱斯芽孢杆菌分别进行培养，得到斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液，然后将斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液混合，得到复合菌菌液，最后将所述复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵得到降解饲料中玉米赤霉烯酮的发酵菌剂，该微生物菌剂安全有效，对固体饲料中ZEN降解效果突出，24h降解率均在90％以上，可以作为饲料添加剂直接添加至饲料中。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施例1

(1)将保藏号CGMCC No.17759斯塔普氏菌菌株接种至LB液体培养基中(接种量1％)，37℃、200r培养24h得一次斯塔普氏菌活化种子液。将一次斯塔普氏菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中(接种量1％)，37℃、200r培养36h后得塔普氏菌菌液。

LB培养基为(每升)含蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，pH值调整到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(2)将保藏号CGMCC No.17328贝莱斯芽孢杆菌菌株接种至LB液体培养基中(接种量1％)，37℃、200r培养24h得一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液。将一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中(接种量1％)，37℃、200r培养36h后得贝莱斯芽孢杆菌菌液。

LB培养基为(每升)含蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，pH值调整到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(3)在得到的斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数17:13的比例进行混合，得到复合菌菌液。

(4)将复合菌菌液接种至灭菌后的发酵培养基中(采用500L发酵罐)，接种量为1％，发酵后制得液体微生物复合制剂。

发酵条件为：装料系数0.6，温度31℃，压力0.05～0.08MPa，通气量0.8～1.0，Ph6.5～7.0，发酵时间36h。

复合菌培养基(g/L)：蔗糖40，豆粕40，(NH4)

(5)将已制取的斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液中连同得到的用于降解饲料中玉米赤霉烯酮的微生物复合制剂分别对饲料中玉米赤霉烯酮进行降解试验。

试验方法为：将等量的各组菌液均匀喷洒在受ZEN污染的饲料中(其中ZEN含量大于500μg/ml)，以喷涂未接菌的培养液为对照组。加入50％灭菌后的蒸馏水搅拌均匀，37℃培养分别8h、16h、24h，烘干粉碎，用霉菌毒素快检设备测饲料样品中ZEN浓度，并计算降解率。其中ZEN降解率＝(初始饲料中ZEN浓度-取样时ZEN浓度)/初始饲料中ZEN浓度×100％。

试验结果如表1：

表1

通过表1试验数据可以看出当斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成的微生物菌剂对于饲料中的玉米赤霉烯酮的降解率最大，24h达到91.3％，斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液虽然对饲料中玉米赤霉烯酮也具备一定降解作用，24h分别为62.1％和68.8％，但是降解率偏低，斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成的发酵菌液大大提高了对饲料中的玉米赤霉烯酮降解效果。

实施例2

(1)将保藏号CGMCC No.17759斯塔普氏菌菌株接种至LB液体培养基中(接种量1.5％)，35℃、200r培养23h得一次斯塔普氏菌活化种子液。将一次斯塔普氏菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中(接种量1.5％)，39℃、220r培养36h后得塔普氏菌菌液。

LB培养基为(每升)含蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，pH值调整到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(2)将保藏号CGMCC No.17328贝莱斯芽孢杆菌菌株接种至LB液体培养基中(接种量1.5％)，39℃、220r培养25h得一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液。将一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中(接种量1.5％)，35℃、200r培养34h后得贝莱斯芽孢杆菌菌液。

LB培养基为(每升)含蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，pH值调整到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(3)在得到的斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数17:15的比例进行混合，得到复合菌菌液。

(4)将复合菌菌液接种至灭菌后的发酵培养基中(采用500L发酵罐)，接种量为1.5％，发酵后制得液体微生物复合制剂。

发酵条件为：装料系数0.6，温度30～31℃，压力0.05～0.08MPa，通气量0.8～1.0，Ph 6.5～7.0，发酵时间36h。

复合菌培养基：蔗糖41g/L，豆粕39g/L，(NH4)

(5)将已制取的斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液中连同得到的用于降解饲料中玉米赤霉烯酮的微生物复合制剂分别对饲料中玉米赤霉烯酮进行降解试验。

试验方法为：将等量的各组菌液均匀喷洒在受ZEN污染的饲料中(其中ZEN含量大于500μg/ml)，以喷涂未接菌的培养液为对照组。加入50％灭菌后的蒸馏水搅拌均匀，37℃培养分别8h、16h、24h，烘干粉碎，用霉菌毒素快检设备测饲料样品中ZEN浓度，并计算降解率。其中ZEN降解率＝(初始饲料中ZEN浓度-取样时ZEN浓度)/初始饲料中ZEN浓度×100％。

试验结果如表1：

表1

通过表1试验数据可以看出当斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成的微生物菌剂对于饲料中的玉米赤霉烯酮的降解率最大，24h达到93.7％，斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液虽然对饲料中玉米赤霉烯酮也具备一定降解作用，24h分别为63.5％和67.5％，但是降解率偏低，斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成的发酵菌液大大提高了对饲料中的玉米赤霉烯酮降解效果。

实施例3

(1)将保藏号CGMCC No.17759斯塔普氏菌菌株接种至LB液体培养基中(接种量1.3％)，39℃、220r培养25h得一次斯塔普氏菌活化种子液。将一次斯塔普氏菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中(接种量1.3％)，35℃、200r培养34h后得塔普氏菌菌液。

LB培养基为(每升)含蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，pH值调整到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(2)将保藏号CGMCC No.17328贝莱斯芽孢杆菌菌株接种至LB液体培养基中(接种量1.3％)，35℃、200r培养23h得一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液。将一次贝莱斯芽孢杆菌活化种子液继续接种至LB液体培养基中(接种量1.3％)，39℃、220r培养36h后得贝莱斯芽孢杆菌菌液。

LB培养基为(每升)含蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母浸粉5g，pH值调整到7.2，121℃蒸汽灭菌20min。

(3)在得到的斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液中取一定的量按照细胞数17:10的比例进行混合，得到复合菌菌液。

(4)将复合菌菌液接种至灭菌后的发酵培养基中(采用500L发酵罐)，接种量为1.3％，发酵后制得液体微生物复合制剂。

发酵条件为：装料系数0.6，温度30～31℃，压力0.05～0.08MPa，通气量0.8～1.0，Ph 6.5～7.0，发酵时间32h。

复合菌培养基：蔗糖38g/L，豆粕42g/L，(NH4)

(5)将已制取的斯塔普氏菌菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液中连同得到的用于降解饲料中玉米赤霉烯酮的微生物复合制剂分别对饲料中玉米赤霉烯酮进行降解试验。

试验方法为：将等量的各组菌液均匀喷洒在受ZEN污染的饲料中(其中ZEN含量大于500μg/ml)，以喷涂未接菌的培养液为对照组。加入50％灭菌后的蒸馏水搅拌均匀，37℃培养分别8h、16h、24h，烘干粉碎，用霉菌毒素快检设备测饲料样品中ZEN浓度，并计算降解率。其中ZEN降解率＝(初始饲料中ZEN浓度-取样时ZEN浓度)/初始饲料中ZEN浓度×100％。

试验结果如表3：

表3

通过表3试验数据可以看出当斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成的微生物菌剂对于饲料中的玉米赤霉烯酮的降解率最大，24h达到90.8％，斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液虽然对饲料中玉米赤霉烯酮也具备一定降解作用，24h分别为61.7％和67.2％，但是降解率偏低，斯塔普氏菌液和贝莱斯芽孢杆菌菌液按照本实施例中的比例混合在一起发酵形成的微生物菌剂大大提高了对饲料中的玉米赤霉烯酮降解效果。

综上所述，本发明复合菌菌液放入复合菌培养基中进行混合发酵得到降解饲料中玉米赤霉烯酮的发酵菌剂，该发酵菌剂可以快速有效降解饲料中玉米赤霉烯酮，在反应24h后降解率可达到90％以上，且制成的发酵菌剂安全有效，可以作为饲料添加剂直接添加至饲料中。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。