用于改进的固相DNA杂交和扩增的低结合载体

本申请要求于2018年11月14日提交的美国临时申请第62/767,343号、2018年12月7日提交的美国临时申请第62/776,898号和2019年3月25日提交的美国申请第16/363,842号的权益，每个申请的全部内容通过引用整体并入本文。

背景技术

在过去的二十年中已经开发并商业化了多种DNA测序方法(参见近期综述，例如，E.Mardis(2008),“Next-Generation DNA Sequencing Methods”,Annu.Rev.GenomicsHum.Genet.9:387–402；以及J.Heather和B.Chain,(2016),“The Sequence ofSequencers:The History of Sequencing DNA”,Genomics 107:1–8)。许多“第二代”和“第三代”测序技术利用大规模并行的循环阵列方法进行合成测序(SBS)，在这种方法中，对栓系在固体载体上的单链模板寡核苷酸序列的准确解码取决于对通过聚合酶将由A、G、C和T核苷酸逐步添加到互补寡核苷酸链中产生的信号成功地进行分类。这些方法通常需要用固定长度的已知衔接子序列来修饰寡核苷酸模板，通过与与衔接子序列互补的已知序列的表面栓系探针杂交，以随机或图案阵列固定在固体载体上，然后使用例如单分子(非扩增)同步合成测序(smSBS)方法(例如Helicos技术)或单分子异步合成测序(smASBS)方法(例如Pacific Biosciences技术)进行探测。在smSBS方法中，使用用荧光标签编码的终止子核苷酸，使得复制酶每个循环只能掺入单个碱基。例如，Helicos技术使用单个荧光标签，并按顺序引入A、G、C、T——每个循环一个碱基。在各循环中，进行成像步骤以对阵列上各单分子模板的正确“碱基”进行分类。在成像步骤之后，移除可逆连接的标签，使得复制酶(聚合酶)可以掺入下一个模板碱基。这些循环重复多次以最终解码随机阵列上的模板寡核苷酸链并确定它们各自的序列。

虽然成功，但循环阵列方法通常存在两个基本不足：(i)将各连续核苷酸添加到互补链的循环时间长，以及(ii)逐步添加单个核苷酸产生的信号弱(通常通过使用荧光标记和荧光成像技术检测)，并如下文将详细讨论的，表现出低的对比度噪声比(CNR)，因此需要使用包括高精度光学器件在内的昂贵仪器进行长时间的成像以实现准确的碱基识别(basecalling)。

已经尝试解决循环阵列测序方法的循环时间问题，例如通过单分子异步合成测序(smASBS)方法的出现，例如Pacific Biosciences技术，在该技术中四种不同光谱的荧光标签连接到各个A、G、C和T核苷酸，然后可以“实时”分类它们的添加。在这种方法中，所有四种标记的核苷酸同时引入，并在整个链复制过程中获取图像。根据检测到的光的光谱，序列中的各位置被分类为“A”、“G”、“C”和“T”。在本文中，循环时间理论上可以与聚合酶催化的复制速率一样快，但权衡是降低CNR，从而引入分类错误，最终导致准确性降低，并更加依赖高精度光学器件和昂贵的仪器。

已经通过在过程中掺入扩增步骤来尝试解决一些循环阵列测序方法(即，非单分子方法)中的信号限制。以随机或图案阵列栓系到固体载体上的模板DNA分子的固相扩增增加了要测序的靶标的拷贝数，使得将可检测碱基逐步添加到其各自的互补链后，从复制模板分子的“集落”产生的信号可分类为“A”、“G”、“C”或“T”。成功分类的概率(以及碱基识别的准确性)取决于各检测事件期间的相应CNR，这通常是有限的。

因此，需要用于核酸测序的改进的固体载体和固相扩增方法，它们将增加碱基添加信号的量级，减少非特异性背景信号，从而提高CNR，从而提高碱基识别的准确性，可能会缩短循环时间，并减少测序过程对高精度光学器件和昂贵仪器的依赖。

发明内容

一些实施方案涉及一种用于进行核酸序列测定的方法，该方法包括：a)提供表面；其中该表面包括：i)基底；ii)至少一层亲水性聚合物涂层；iii)附接至至少一层亲水性聚合物涂层的多个寡核苷酸分子；iv)表面的至少一个离散区域，该离散区域包含固定至多个附接的寡核苷酸分子的多个克隆扩增的样品核酸分子，其中多个固定化克隆扩增的样品核酸分子以至少5000个分子/mm

本文公开的表面包括基底、至少一层亲水性的低非特异性结合(即，低背景)涂层和附接至至少一层亲水性、低结合性、低背景涂层的多个寡核苷酸分子。

所公开的低非特异性结合固体载体可用于多种生物测定，包括但不限于DNA测序和基因分型。这些载体包括温度稳定和化学稳定的官能化的基底，可耐受暴露于多次溶剂交换和温度变化，并在整个测定过程中赋予低非特异性结合特性。所公开的载体可具有以下部分或全部的特性：

1.使用极性质子溶剂、极性非质子溶剂和/或非极性溶剂的任意组合进行的表面官能化相比于传统方法使得生物测定性能的效果提高>5倍(例如，分别改进反应速率和/或所需产物形成)。

2.官能化后接触角测量值(例如，<35度)最小，通过连续的溶剂变化和温度变化来保持。

3.生物分子相对于特异性结合分子的低非特异性结合(例如，大于1个特异性结合分子对比<0.25个非特异性结合分子/感兴趣的区域)。当使用各种检测方法中的任何一种时，这可以直接转化为改进的对比度噪声比(CNR)。

本文公开的表面包括：a)基底；b)至少一层亲水性聚合物涂层；c)附接至至少一层亲水性聚合物涂层的多个寡核苷酸分子；以及d)表面的至少一个离散区域，该离散区域包含多个克隆扩增的样品核酸分子，这些样品核酸分子已与多个附接的寡核苷酸分子退火，其中表面的荧光图像表现出至少20的对比度噪声比(CNR)。

在一些实施方案中，当样品核酸分子或其互补序列被花青染料-3(Cy3)荧光团标记时，同时将表面浸入缓冲液(例如，25mM ACES，pH 7.4缓冲液)中，当使用配备有20x、0.75NA物镜、532nm光源、针对532nm激发和Cy3荧光发射进行了优化的带通和二向色镜滤光片组以及相机(例如，Andor sCMOS，Zyla 4.2)的Olympus IX83倒置荧光显微镜在非信号饱和条件下获取荧光图像时，表面的荧光图像表现出至少20的对比度噪声比(CNR)。

在一些实施方案中，表面的荧光图像表现出至少40的对比度噪声比(CNR)。在一些实施方案中，表面的荧光图像表现出至少60的对比度噪声比(CNR)。在一些实施方案中，基底包括玻璃。在一些实施方案中，基底包括塑料。在一些实施方案中，至少一层亲水性聚合物涂层包含PEG。在一些实施方案中，表面进一步包括第二亲水性聚合物涂层。在一些实施方案中，至少一个亲水性聚合物层包含具有至少4个分支的支化亲水性聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，至少一个亲水性聚合物层包含具有至少8个分支的支化亲水性聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，至少一个亲水性聚合物层包含具有至少16个分支的支化亲水性聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，至少一个亲水性聚合物层包含具有至少32个分支的支化亲水性聚合物，例如PEG。在一些实施方案中，多个寡核苷酸分子以至少50,000个分子/μm

本文还公开了这样的表面，所述表面包括：a)基底；b)至少一层亲水性聚合物涂层；c)附接至至少一层亲水性聚合物涂层的多个寡核苷酸分子，其中表面表现出小于约0.25个分子/μm

在一些实施方案中，表面表现出小于约0.1个分子/μm

本文公开了在基底表面上沉积寡核苷酸的方法，该方法包括：a)将第一亲水性聚合物与第一层中的基底表面缀合；b)将第二亲水性聚合物与第一层缀合以形成第二层，其中第二层的亲水性聚合物分子通过每个分子至少两个共价键连接至第一层；c)将最外面的亲水性聚合物与第二层缀合，其中最外面的亲水性聚合物分子在与第二层缀合之前包含与其共价连接的寡核苷酸分子。

在一些实施方案中，第二层的亲水性聚合物分子通过每个分子至少四个共价键连接至第一层。在一些实施方案中，第二层的亲水性聚合物分子通过每个分子至少八个共价键连接至第一层。在一些实施方案中，该方法进一步包括将最外面的亲水性聚合物直接与第二层缀合。在一些实施方案中，该方法进一步包括将第三亲水性聚合物与第二层缀合以形成第三层，以及将最外面的亲水性聚合物通过第三层与第二层缀合。在一些实施方案中，该方法进一步包括将第三亲水性聚合物与第二层缀合以形成第三层，将第四亲水性聚合物与第三层缀合以形成第四层，以及将最外面的亲水性聚合物通过第四层和第三层与第二层缀合。在一些实施方案中，第一亲水性聚合物包含PEG。在一些实施方案中，第一亲水性聚合物包含PGA。在一些实施方案中，至少一层亲水性聚合物包含支化聚合物。在一些实施方案中，支化聚合物包含至少4个支链。在一些实施方案中，支化聚合物包含至少8个支链。在一些实施方案中，支化聚合物包含16-32个支链。在一些实施方案中，第四层的亲水性聚合物分子通过每个分子至少两个共价键连接至第三层。在一些实施方案中，第四层的亲水性聚合物分子通过每个分子至少四个共价键连接至第三层。在一些实施方案中，第四层的亲水性聚合物分子通过每个分子至少八个共价键连接至第三层。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含乙醇的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含甲醇的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含二甲亚砜(DMSO)的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含乙腈的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含缓冲磷酸盐的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含缓冲的3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含75％乙腈、25％磷酸盐缓冲液的溶剂中被递送至基底表面。在一些实施方案中，亲水性聚合物在包含90％甲醇、10％MOPS缓冲液的溶剂中被递送至基底表面。

本文公开了这样的表面，所述表面包含每平方微米至少10,000个分子的密度的寡核苷酸的表面，其中寡核苷酸通过多层亲水性聚合物层栓系在表面上，其中寡核苷酸均匀分布在多层亲水性聚合物层的最外层中。

在一些实施方案中，寡核苷酸以每平方微米至少50,000个分子的表面密度分布。在一些实施方案中，寡核苷酸以每平方微米至少100,000个分子的表面密度分布。在一些实施方案中，寡核苷酸以每平方微米至少500,000个分子的表面密度分布。在一些实施方案中，至少10％的拴系寡核苷酸与靶标(或样品)寡核苷酸退火。在一些实施方案中，多层亲水性聚合物层被亲水溶剂饱和。在一些实施方案中，表面包括玻璃、熔融石英、硅或聚合物(例如塑料)基底的表面。在一些实施方案中，多层亲水性聚合物层包括三个以上的聚合物层。在一些实施方案中，多层亲水性聚合物层包括五个以上的聚合物层。在一些实施方案中，亲水性聚合物层的一层或多层包含支化PEG、支化PVA、支化聚(乙烯基吡啶)、支化PVP、支化PAA、支化PNIPAM、支化PMA、支化PHEMA、支化PEGMA、支化PGA、支化聚赖氨酸、支链聚葡萄糖苷或右旋糖苷。在一些实施方案中，亲水性聚合物层的一层或多层包含支化PEG分子。在一些实施方案中，支化PEG分子包含至少4个支链。在一些实施方案中，支化PEG分子包含至少8个支链。在一些实施方案中，支化PEG分子包含16-32个支链。在一些实施方案中，亲水性聚合物层的至少第一层和第二层使用共价酰胺键相互栓系。在一些实施方案中，亲水性聚合物层的至少第一层和第二层通过每个聚合物分子至少两个共价键相互栓系。在一些实施方案中，亲水性聚合物层的至少第一层和第二层通过每个聚合物分子至少四个共价键相互栓系。在一些实施方案中，亲水性聚合物层的至少第一层和第二层通过每个聚合物分子至少八个共价键相互栓系。在一些实施方案中，栓系的寡核苷酸的表面密度为每平方微米至少50,000个分子。在一些实施方案中，栓系的寡核苷酸的表面密度为每平方微米至少100,000个分子。在一些实施方案中，表面表现出小于0.25个分子/μm

本文公开了用于进行固相核酸杂交的方法，该方法包括：a)提供本文公开的任一表面；b)进行固相核酸杂交反应，其中模板核酸分子与拴系的寡核苷酸退火。本文还公开了用于进行固相核酸扩增的方法，该方法包括：a)提供本文公开的任一表面；b)使用与栓系的寡核苷酸杂交的模板核酸分子进行固相核酸扩增反应。

在一些实施方案中，固相核酸扩增包括热循环。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括等温扩增。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括滚环扩增。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括桥扩增。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括等温桥扩增。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括多重置换扩增。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括解旋酶处理。在一些实施方案中，固相核酸扩增包括重组酶处理。在一些实施方案中，在固相核酸扩增反应的至少30个循环中，栓系的寡核苷酸的表面密度没有变化。在一些实施方案中，在固相核酸扩增反应的至少40个循环中，栓系的寡核苷酸的表面密度没有变化。在一些实施方案中，在固相核酸扩增反应的至少50个循环中，栓系的寡核苷酸的表面密度没有变化。

本文公开了进行核酸序列测定的方法，该方法包括：a)提供本文公开的任一表面；b)使用与栓系的寡核苷酸杂交的模板核酸分子进行固相核酸扩增反应；c)进行一系列循环的单核苷酸结合或掺入反应，其中核苷酸被可检测标签标记。

在一些实施方案中，可检测标签是荧光团。在一些实施方案中，荧光团是Cy3，其中在结合或掺入第一Cy3标记的核苷酸之后在非信号饱和条件下如本文别处所述获得的表面的荧光图像表现出至少20的对比度噪声比(CNR)。在一些实施方案中，对比度噪声比(CNR)为至少50。在一些实施方案中，对比度噪声比(CNR)为至少100。在一些实施方案中，对比度噪声比(CNR)为至少150。在一些实施方案中，对比度噪声比(CNR)为至少200。在一些实施方案中，固相核酸扩增反应包括桥扩增反应。在一些实施方案中，固相核酸扩增反应包括等温桥扩增反应。在一些实施方案中，固相核酸扩增反应包括滚环扩增(RCA)反应。在一些实施方案中，固相核酸扩增反应包括解旋酶依赖性扩增反应。在一些实施方案中，固相核酸扩增反应包括重组酶依赖性扩增反应。

本文公开了用于进行核酸扩增的装置，该装置包括：a)本文公开的任一表面；其中表面包括毛细管腔的表面或流动池的至少一个内表面。

在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一个进入毛细管腔的流体入口。在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一个流体出口。在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一个泵。在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一个流体混合歧管。在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一个温度控制元件。在一些实施方案中，该装置进一步包括至少一个光学窗口。

本文公开了用于进行核酸测序的系统，该系统包括：a)至少一个本文公开的装置；b)流体控制模块；c)成像模块。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用以其整体并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入。在本文中的术语与并入的参考文献中的术语之间发生冲突的情况下，以本文中的术语为准。

附图说明

专利或申请文件包含至少一张彩色附图。将根据专利局要求提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本，并提供必要的费用。

在所附权利要求书中具体阐述了本发明的一些新颖特征。通过参考下面的利用了本发明原理的说明性实施方式的详细描述并结合附图可以更好地理解本发明的特征和优点，在附图中：

图1提供了本公开内容的低结合固体载体的一个实施方案的示意图，其中该载体包含玻璃基底和亲水涂层的交替层，所述亲水涂层共价或非共价地粘附到玻璃上，并且其进一步包含用作寡核苷酸引物附着位点的化学反应性官能团。

图2提供了利用硅烷反应将第一聚合物共价偶联至基底(例如玻璃)表面以产生第一聚合物层的示意图。

图3提供了支化聚合物与诸如图2所示的表面共价偶联以在基底表面上形成第二聚合物层的示意图。

图4提供了用于将一个或多个寡核苷酸衔接子或引物序列(例如，序列1(点线)和序列2(虚线))共价连接至支化聚合物的偶联反应的示意图。

图5提供了包含共价连接的寡核苷酸衔接子或引物序列的支化聚合物与诸如图3所示的表面共价偶联以在基底表面上形成第三聚合物层的示意图。

图6A-图B提供了模拟荧光强度数据的示例，其图示了在核酸测序和碱基识别应用中采用信噪比(SNR)和对比度噪声比(CNR)作为数据质量的度量之间的差异。图6A：模拟数据的示例，其中SNR＝2且CNR＝1.25。图6B：模拟数据的示例，其中SNR＝2且CNR＝12.29。

图7提供了改进的CNR如何影响固体载体上克隆扩增的核酸集落的准确检测和信号分类(碱基识别)所需的成像时间的示例。

图8图示了由于不同的标记核苷酸掺入到每个克隆扩增的模板分子的互补链中而在固体载体上进行的核酸测序反应的不同循环所获得的不同图像。该图还图示了需要通过从嘈杂的间质(interstitial)背景图像和细胞内(intrastitial)背景图像中区分核苷酸特异性信号来进行迭代点检测的检测平台对整体检测信号的不同背景贡献。

图9提供了来自研究的图像数据的示例，以确定绿色荧光染料与根据不同表面修饰方案处理的玻璃基底表面的非特异性结合的相对水平。

图10提供了来自研究的图像数据的示例，以确定红色荧光染料与根据不同表面修饰方案处理的玻璃基底表面的非特异性结合的相对水平。

图11提供了根据不同表面修饰方案处理的基底表面的寡核苷酸引物接枝数据的示例。

图12提供了在根据不同表面修饰方案处理的基底表面的非特异性结合测试期间获得的复制图像的示例。

图13提供了测序染料混合物与根据不同表面修饰方案处理的基底表面的非特异性结合的数据示例。出于比较的目的，在测序染料混合物与接枝有Cy3标记的寡核苷酸的单个珠子的非特异性结合的相同的一组实验条件下测得的荧光强度为约1,500个计数。

图14提供了绿色荧光染料和红色荧光染料与根据不同表面修饰方案处理的基底表面的非特异性结合的图像和数据的示例。出于比较的目的，在偶联单个Cy3标记的核苷酸碱基后，在同一组实验条件下测量的克隆扩增的模板集落的荧光强度为约1,500个计数。

图15提供了证明通过改变基底上的寡核苷酸引物密度在低结合固体载体上进行“可调”核酸扩增的图像和数据的示例。蓝色直方图：低引物密度。红色直方图：高引物密度。通过调整寡核苷酸引物密度将低非特异性结合和可调的核酸扩增效率相结合，产生高的CNR并改进随后的核酸测序性能。

图16提供了本公开内容的低结合固体载体的荧光图像的示例，该固体载体上已使用不同的引物密度、等温扩增方法和扩增缓冲液添加剂扩增了栓系的寡核苷酸。

图17提供了凝胶图像的示例，其证明通过使用扩增缓冲液添加剂减少了非特异性核酸扩增，同时保持了靶序列的特异性扩增。凝胶图像显示了对应于靶标(箭头)的特异性扩增和其他凝胶定量扩增产物的条带。

图18提供了荧光图像的示例，其证明了为提高扩增特异性而改变制剂对低结合载体表面的影响。

图19A-图19B提供了图像数据的非限制性示例，其证明了如本文所述可通过用于固相核酸扩增的杂交缓冲液的重新配制而实现杂交严格性、速度和效率的改进。图19A提供了两种不同杂交缓冲液制剂和方案的图像数据的示例。图19B提供了使用标准杂交缓冲液和方案获得的相应图像数据的示例。

图20图示了使用所公开的低结合载体和本公开内容的扩增反应制剂进行核酸测序的工作流程，以及可实现的处理时间的非限制性示例。

图21提供了本公开内容的低结合载体的荧光图像和强度数据的示例，在该载体上进行固相核酸扩增以产生模板寡核苷酸序列的克隆扩增簇。

图22提供了本公开内容的低结合载体的荧光图像和强度数据的第二示例，在该载体上进行固相核酸扩增以产生模板寡核苷酸序列的克隆扩增簇。

图23提供了本公开内容的低结合载体的荧光图像和强度数据的示例，在该载体上进行固相核酸扩增以产生模板寡核苷酸序列的克隆扩增簇。

图24提供了用于估计拴系在载体表面上的引物寡核苷酸的表面密度的荧光校准曲线的示例。

图25A-图25B提供了具有包含荧光标记的核苷酸的结合扩增子的本公开内容的修饰的玻璃和聚合物表面的非限制性示例。图25A：修饰的玻璃表面。在插图中，可以看到表面产生226的CNR。图25B：修饰的塑料表面。在插图中，可以看到表面产生109的CNR。

图26A-图26B提供了对图25A和图25B的图像的分析。在图26A中，对于玻璃表面和塑料表面中的每一种，可以看到左侧的信号强度和右侧的背景强度。对于每一种，信号强度都明显大于背景强度。在图26B中，可以看到玻璃表面和塑料表面中的每一种的CNR值的图形描述。在左侧，玻璃产生226的CNR，而在右侧，塑料产生109的CNR，与图25A和图25B的插图一致。

图27提供了关于其表面数据准确性的分析。在两个通道中收集数据，并从(上图)以散点图描绘该数据，且从左到右量化(下图)每种市售的低CNR和高CNR表面。

图28提供了与包含高表面密度的寡核苷酸衔接子或引物分子的表面(左)和与包含较低表面密度的寡核苷酸衔接子或引物分子的表面(右)杂交的多聚靶寡核苷酸序列的示意图。

图29提供了在本公开内容的低结合载体表面上进行传统杂交反应和在本公开内容的低结合载体表面上进行优化的杂交反应的实验结果的比较。

图30提供了在本公开内容的低结合载体上进行传统杂交反应，然后进行RCA或桥扩增的实验结果的说明。

图31提供了在本公开内容的低结合载体上进行优化的杂交反应，随后进行RCA或桥扩增的实验结果的图示。

图32提供了在使用改进的偶联化学制备的本公开内容的低结合载体上进行优化的杂交反应以将寡核苷酸衔接子或引物分子附接至表面，随后进行RCA或桥扩增的实验结果的图示。

图33提供了传统载体表面和本公开内容的靶寡核苷酸已与其杂交和扩增的低结合载体表面的荧光图像的非限制性示例。该图图示了从图像测量的对比度噪声比，所述图像例如实施例中提供的那些图像，在实施例中用桥扩增方案的聚丙烯酰胺表面、用标准桥扩增方案的低结合载体和引物密度<1000个寡核苷酸/um

具体实施方式

本文公开了用于固相核酸扩增和测序或其他生物测定应用的新型固体载体。本文公开的固体载体表现出蛋白质和其他扩增反应组分的低非特异性结合，以及对重复暴露于不同溶剂、温度变化、化学危害(如低pH)或长期储存的改进稳定性。

单独或与改进的核酸杂交和扩增方案组合，本文公开的一些载体引起以下一项或多项：(i)降低对必需的起始材料量的要求，(ii)降低对等温或热梯度扩增方案的温度要求，(iii)提高扩增速率，(iv)提高扩增特异性(即，对扩增集落的单链模板分子进行更具选择性的扩增，同时减少表面引物和引物二聚体的非特异性扩增)，(v)允许更好地区分序列特异性信号与背景信号(例如来自胞质背景和细胞内背景的信号)，从而与常规核酸扩增和测序方法相比提供改进的对比度噪声比(CNR)和碱基识别准确度。

实现上述改进或其任意组合的起点是所公开的包含一层或多层的聚合物涂层(例如，PEG聚合物膜)的低非特异性结合载体，使蛋白质和标记的核苷酸与固体载体的非特异性结合最小化。可以通过本公开内容的以下一个或多个其他方面来实现改进的核酸杂交和扩增速率以及特异性的后续证明：(i)引物设计(序列和/或修饰)，(ii)固体载体上栓系的引物密度的控制，(iii)固体载体的表面组成，(iv)固体载体的表面聚合物密度，(v)在扩增之前和期间使用改进的杂交条件和/或(vi)使用降低非特异性引物扩增或提高模板扩增效率的改良扩增制剂。

所公开的低非特异性结合载体的优势以及相关的杂交和扩增方法为任何测序系统带来了以下一项或多项附加优势：(i)减少了流体洗涤时间(由于减少了非特异性结合，因此测序周期时间更快)、(ii)减少成像时间(因此测定读数和测序周期的周转时间更快)、(iii)减少了总体工作流程时间要求(由于减少了周期时间)、(iv)降低了检测仪器成本(由于CNR的改进)、(v)提高了读数(碱基识别)的准确性(由于CNR的改进)、(vi)提高了试剂的稳定性并降低了试剂的使用要求(从而降低了试剂成本)，以及(vii)由于核酸扩增失败而导致的运行失败更少。

通过使用以下的任意组合来产生用于表面生物测定例如基因分型和测序测定的低结合亲水性表面(多层和/或单层)。

极性质子、极性非质子和/或非极性溶剂用于在基底表面上沉积和/或偶联线性或多分支的亲水性聚合物亚基。一些多分支的亲水性聚合物亚单元可含有官能端基以促进与其他聚合物亚单元的共价偶联或非共价结合相互作用。合适的官能端基的示例包括生物素基、甲氧基醚基、羧酸酯基、胺基、酯化合物基、叠氮化物基、炔基、马来酰亚胺基、硫醇基和硅烷基。

线性、支化或多分支聚合物亚基的任意组合通过修饰的偶联化学/溶剂/缓冲体系、通过随后的分层加成而偶联，所述偶联化学/溶剂/缓冲体系可包括具有正交末端偶联化学的单个亚基，或任何相应的组合，使得所得表面是亲水的并显示出蛋白质和其他分子测定组分的低非特异性结合。在一些情况下，本公开内容的亲水性官能化的基底表面显示出不超过35度的接触角测量值。

除上述溶剂之外的相容的缓冲体系，具有5-10的期望的pH范围。示例包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、磷酸盐缓冲液、TAPS、MES、MOPS或这些的任意组合。

借助下文所述的各种单独的缀合化学中的任何一种或其任意组合，随后在低结合/亲水性基底上进行生物分子附接(例如蛋白质、肽、核酸、寡核苷酸或细胞)。可以使用溶剂混合物进行层沉积和/或共轭反应，所述溶剂混合物可以包含任何比例的以下组分：乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、DMSO、DMF、H

定义：除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本公开内容所属领域的本领域普通技术人员通常所理解的相同含义。

如本说明书和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包括复数引用，除非上下文另外明确指出。除非另有说明，否则本文中任何引用的“或”旨在涵盖“和/或”。

如本文所用，术语“约”是指该数字加上或减去该数字的10％。在范围内使用“约”一词是指该范围减去其最小值的10％和其最大值的10％。

如本文中所使用的，短语在系列的上下文中的“至少一个”涵盖包括单独的该系列的单个成员、该系列的两个成员、最高达包括该系列的所有成员，或在一些情况下结合未列出的组分的列表。

如本文所用，如果荧光源自退火或以其他方式束缚于表面(例如通过具有与表面上的寡核苷酸的相应区段反向互补的区域并退火至所述相应区段)的荧光团，那么它是“特异性的”。这种荧光与源自没有通过这样的退火过程束缚在表面上，或者在一些情况下是表面的背景荧光的荧光团的荧光形成对比。

核酸：如本文所用，“核酸”(也称为“多核苷酸”、“寡核苷酸”、核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))是由两个或更多个通过共价核苷间键连接的核苷酸的线性聚合物，或其变体或功能片段。在核酸的天然示例中，核苷间键通常是磷酸二酯键。然而，其他示例任选地包含其他核苷间键，例如硫代磷酸酯键，并且可以包含或可以不包含磷酸基团。核酸包括双链和单链DNA，以及双链和单链RNA、DNA/RNA杂合体、肽核酸(PNA)、PNA与DNA或RNA之间的杂合体，还可以包括其他类型的核酸修饰。

如本文所用，“核苷酸”是指核苷酸、核苷或其类似物。在一些情况下，核苷酸是嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷(例如，含有2-脱氧-D-核糖的脱氧核糖核苷或含有D-核糖的核糖核苷)。其他核苷酸类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸等。

核酸可以任选地例如通过共价键合或非共价键以核酸的5’或3’端连接到一个或多个非核苷酸部分，例如标记和其他小分子、大分子(例如蛋白质、脂质、糖等)和固体或半固体载体。标记包括使用本领域技术人员已知的多种检测方法中的任何一种可检测的任何部分，并因此使得所连接的寡核苷酸或核酸具有相似的可检测性。一些标记会发出可光学检测或可见的电磁辐射。替代地或组合地，一些标记包括使标记的寡核苷酸或核酸在质谱数据中可见的质量标签，或使标记的寡核苷酸或核酸可通过安培法或伏安法检测的氧化还原标签。一些标记包括有助于标记的寡核苷酸或核酸的分离和/或纯化的磁性标签。核苷酸或多核苷酸通常不连接在标记上，并且直接检测寡核苷酸或核酸的存在。

所公开的低非特异性结合载体以及相关的核酸杂交和扩增方法可以用于分析源自本领域技术人员已知的多种不同细胞、组织或样品类型中的任一种的核酸分子。例如，可以从源自真核生物(例如动物、植物、真菌、原生生物)、古细菌或真细菌的细胞或包含一种或多种类型细胞的组织样品中提取核酸。在一些情况下，可以从原核或真核细胞，例如贴壁或非贴壁真核细胞中提取核酸。从各种各样地例如原代或永生的啮齿动物、猪、猫、犬、牛、马、灵长类或人细胞系中提取核酸。可以从多种不同的细胞、器官或组织类型(例如，白细胞、红细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、配子或来自心脏、肺、大脑、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、胸腺、膀胱、胃、结肠或小肠的细胞)中提取核酸。可以从正常或健康细胞中提取核酸。替代地或组合地，从患病细胞(例如癌细胞)或感染宿主的致病细胞中提取酸。某些核酸可以从细胞类型的不同子集中提取，所述细胞类型例如免疫细胞(例如T细胞、细胞毒性(杀伤性)T细胞、辅助性T细胞、αβT细胞、γδT细胞、T细胞祖细胞、B细胞、B细胞祖细胞、淋巴干细胞、骨髓祖细胞、淋巴细胞、粒细胞、自然杀伤细胞、浆细胞、记忆细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、单核细胞、树突状细胞和/或巨噬细胞或任何它们的组合)、未分化的人类干细胞、已被诱导分化的人类干细胞、稀有细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC)、循环上皮细胞、循环内皮细胞、循环子宫内膜细胞、骨髓细胞、祖细胞、泡沫细胞、间充质细胞或滋养细胞)。可预期其他细胞并且与本文的公开内容一致。

可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任一种从细胞或其他生物样品中提取核酸。例如，典型的DNA提取程序包括(i)收集要从中提取DNA的细胞样品或组织样品，(ii)破坏细胞膜(即细胞裂解)以释放DNA和其他细胞质成分，(iii)用浓盐溶液处理裂解的样品以沉淀蛋白质、脂质和RNA，然后离心以分离出沉淀的蛋白质、脂质和RNA，以及(iv)从上清液中纯化DNA以去除去污剂、蛋白质、盐或在细胞膜裂解步骤中使用的其他试剂。

多种合适的市售核酸提取和纯化试剂盒与本文的公开内容一致。示例包括但不限于来自Qiagen(Germantown,MD)的QIAamp试剂盒(用于从人类样品中分离基因组DNA)和DNAeasy试剂盒(用于从动物样品或植物样品中分离基因组DNA)，或来自Promega(Madison,WI)的

用于固相核酸杂交和扩增的低非特异性结合载体：本文公开的固体载体包含低非特异性结合表面组合物，其能够改进核酸杂交和扩增性能。一般而言，所公开的载体可以包含基底(或载体结构)、一个或多个共价或非共价连接的低结合化学改性层(例如硅烷层、聚合物膜)以及一个或多个共价或非共价连接的引物序列，该引物序列可用于将单链模板寡核苷酸栓系至载体表面(图1)。在一些情况下，可以改变表面的制剂(例如，一层或多层的化学组成)，用于使一层或多层与载体表面和/或彼此交联的偶联化学试剂，以及层的总数，从而相对于可比较的单层最小化或减少蛋白质、核酸分子以及其他杂交和扩增反应组分与载体表面的非特异性结合。通常，可以改变表面的制剂，使得相对于可比较的单层，最小化或减少载体表面上的非特异性杂交。可以改变表面的制剂，使得相对于可比较的单层，最小化或减少载体表面上的非特异性扩增。可以改变表面的制剂，使得最大化载体表面上的特异性扩增速率和/或产率。在本文公开的一些情况下，在不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或30个以上的扩增循环中实现了适合于检测的扩增水平。

可以用来制造基底或载体结构的材料的示例包括但不限于玻璃、熔融石英、硅、聚合物(例如聚苯乙烯(PS)、大孔聚苯乙烯(MPPS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯(HDPE)、环烯烃聚合物(COP)、环烯烃共聚物(COC)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))或其任意组合。玻璃和塑料基底的各种组成都是可以预期的。

可以以本领域技术人员已知的多种几何形状和尺寸中的任何一种来呈现基底或载体结构，并且基底或载体结构可以包含本领域技术人员已知的多种材料中的任何一种。例如，在一些情况下，基底或载体结构可以是局部平坦的(例如，包括显微镜玻璃载玻片或显微镜玻璃载玻片的表面)。总体上，基底或载体结构可以是圆柱形的(例如，包括毛细管或毛细管的内表面)、球形的(例如，包括无孔珠粒的外表面)或不规则的(例如，包括不规则形状、无孔的珠粒或颗粒的外表面)。在一些情况下，用于核酸杂交和扩增的基底或载体结构的表面可以是固体、无孔的表面。在一些情况下，用于核酸杂交和扩增的基底或载体结构的表面可以是多孔的，使得本文所述的涂层穿透多孔表面，并且可以在孔内发生在其上进行的核酸杂交和扩增反应。

包括一个或多个化学改性层(例如，低非特异性结合聚合物的层)的基底或载体结构可以是独立的或集成到另一结构或组件中。例如，在一些情况下，基底或载体结构可在集成或组装的微流体流动池内包括一个或多个表面。基底或载体结构可包括微板版式内的一个或多个表面，例如微板中的孔的底表面。如上所述，在一些优选实施方式中，基底或载体结构包括毛细管的内表面(例如内腔表面)。在替代的优选实施方式中，基底或载体结构包括被蚀刻成平面芯片的毛细管的内表面(例如内腔表面)。

化学改性层可以均匀地施加在基底或载体结构的表面上。或者，基底或载体结构的表面可以不均匀地分布或图案化，使得化学改性层被限制在基底的一个或多个离散区域中。例如，可以使用光刻技术对基底表面进行图案化，以在表面上形成化学改性区域的有序阵列或随机图案。替代地或组合地，可以使用例如接触印刷和/或喷墨印刷技术对基底表面进行图案化。在一些情况下，化学改性的离散区域的有序阵列或随机图案可包含至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400，500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000或更多个离散区域，或本文范围内的任何中间数。

为了获得低非特异性结合表面(在本文中也称为“低结合”或“钝化”表面)，可以将亲水性聚合物非特异性地吸附或共价接枝到基底或载体表面上。通常，钝化是利用聚(乙二醇)(PEG，也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)单甲醚甲基丙烯酸酯(POEGMA))、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、右旋糖苷或其他具有不同分子量和端基的亲水性聚合物，这些聚合物使用例如硅烷化学方法连接到表面。远离表面的端基可以包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、马来酰亚胺和双硅烷。在一些情况下，两层或多层亲水性聚合物，例如线性聚合物、支化聚合物或多分支聚合物，可以沉积在表面上。在一些情况下，两层或多层可以彼此共价偶联或内部交联以提高所得表面的稳定性。在一些情况下，可以将具有不同碱基序列和碱基修饰的寡核苷酸引物(或其他生物分子，例如酶或抗体)以各种表面密度拴在所得的表面层上。在一些情况下，例如，可以改变表面官能团密度和寡核苷酸浓度以靶向某个引物密度范围。另外，可以通过用带有相同官能团的其他分子稀释寡核苷酸来控制引物密度。例如，在与NHS-酯涂覆的表面反应中，可以用胺标记的聚乙二醇稀释胺标记的寡核苷酸以降低最终引物密度。在杂交区域和表面附接官能团之间具有不同长度的接头的引物也可以用于控制表面密度。合适的接头的示例包括在引物的5’端的多聚胸苷酸(poly-T)链和多聚腺苷酸(poly-A)链(例如0至20个碱基)、PEG接头(例如3至20个单体单元)和碳链(例如C6、C12、C18等)。为了测量引物密度，可以将荧光标记的引物栓系在表面上，然后将荧光读数与已知浓度的染料溶液的荧光读数进行比较。

在一些实施方式中，亲水性聚合物可以是交联的聚合物。在一些实施方式中，交联的聚合物可以包括与另一种类型的聚合物交联的一种类型的聚合物。交联聚合物的示例可包括与选自以下的另一种聚合物交联的聚乙二醇：聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)单甲醚甲基丙烯酸酯(POEGMA))、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡萄糖苷、链霉亲和素、右旋糖酐或其他亲水性聚合物。在一些实施方式中，交联的聚合物可以是与聚丙烯酰胺交联的聚(乙二醇)。

由于本文公开的表面钝化技术的结果，蛋白质、核酸和其他生物分子不会“粘附”到基质上，也就是说，它们显示出低非特异性结合(NSB)。下文示出了使用具有不同玻璃制备条件的标准的单层表面制备方法的示例。已经钝化以实现蛋白质和核酸超低NSB的亲水性表面需要新颖的反应条件，以提高引物沉积反应效率，杂交性能并诱导有效扩增。所有这些方法都需要寡核苷酸附接以及随后的蛋白质结合和递送到低的结合表面。如下所述，新的引物表面偶联制剂(Cy3寡核苷酸移植物滴定)与所得的超低的非特异性背景(使用红色和绿色荧光染料进行的NSB功能测试)的组合产生的结果证明了所公开方法的可行性。本文公开的一些表面显示出荧光团(例如Cy3)特异性(例如，与栓系的引物或探针杂交)与非特异性的结合(例如，B

为了缩放底漆表面密度并为亲水或两性表面增加尺寸，已经开发了包含PEG和其他亲水性聚合物的多层涂层的基底。通过使用亲水和两性的表面分层方法，所述方法包括但不限于以下所述的聚合物/共聚物材料，可以显著增加表面上的底漆装载密度。传统的PEG涂覆方法使用单层引物沉积，通常已报道其用于单分子应用，但在核酸扩增应用中不会产生高拷贝数。如本文所述，“层化”可以使用任何相容的聚合物或单体亚单元使用传统的交联方法来完成，使得可以顺序地构建包含两个或更多个高度交联的层的表面。合适的聚合物的示例包括但不限于链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、右旋糖苷、聚赖氨酸以及聚赖氨酸和PEG的共聚物。在一些情况下，不同的层可以通过各种偶联反应相互连接，所述偶联反应包括但不限于生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-NHS酯反应、硫醇-马来酰亚胺反应、带正电的聚合物和带负电的聚合物之间的离子相互作用。在一些情况下，可以在溶液中构建高底漆密度的材料，然后通过多个步骤将其层叠在表面上。

图2提供了将第一亲水性聚合物层接枝到基底(例如玻璃基底)的一个非限制性示例的示意图。在使用本领域技术人员已知的多种方法(例如，用食人鱼溶液(Piranhasolution)处理、等离子体清洁等)中的任一种清洁玻璃表面之后，将基底用硅烷溶液(例如，硅烷PEG5K溶液)处理，冲洗、干燥并在高温下固化以与表面形成共价键。远离表面的聚合物末端可以包含多种化学反应性官能团或受保护的官能团中的任一种。胺反应性NHS基团示于图2中。

图3提供了将包括具有诸如图2中所图示的NHS-官能团的第一聚合物层的衍生基底与伯胺官能化的支化聚合物(例如，16个支链的PEG聚合物或32个支链的PEG聚合物(也分别称为16臂PEG或32臂PEG))偶联的一个非限制性示例的示意图，以形成包含过量的未反应的官能团的第二亲水性聚合物层。

图4提供了使包含反应性官能团的支化聚合物(例如，4-支化NHS-PEG)与一种或多种寡核苷酸衔接子或引物序列(例如，包含伯胺的寡核苷酸，如点线和虚线所示的)在溶液中反应，然后沉积在基底表面上以产生包含共价连接的寡核苷酸分子的亲水层的一个非限制性示例的示意图。通过改变寡核苷酸分子(或其他待栓系的生物分子，例如肽、蛋白质、酶、抗体等)与支化聚合物的摩尔比，可以以受控方式改变所得的附接的寡核苷酸序列的表面密度。在一些情况下，一个或多个寡核苷酸分子(或其他生物分子)可以在现有聚合物层已经沉积在表面上之后共价栓系到该现有聚合物层。

图5提供了将包含共价连接的寡核苷酸引物的支化聚合物偶联至层状亲水性表面(例如图3中所示的层状亲水性表面)的一个非限制性示例的示意图。在该示例中，包含两种不同的寡核苷酸引物(由点线和虚线表示)和胺反应性NHS基团的支化聚合物与前一层的伯胺偶联，从而形成含有受控的栓系的寡核苷酸引物的表面密度的多层三维亲水性表面。

用于将第一化学改性层接枝到载体表面的附着化学通常取决于制造载体的材料和层的化学性质。在一些情况下，第一层可以共价附接于载体表面。在一些情况下，第一层可以例如通过非共价相互作用如静电相互作用、氢键或第一层的表面与分子组分之间的范德华相互作用非共价连接例如吸附到表面上。无论哪种情况，都可以在附接或沉积第一层之前对基底表面进行处理。本领域技术人员已知的多种表面处理技术中的任何一种都可以用于清洁或处理载体表面。例如，可以使用食人鱼溶液(硫酸(H

硅烷化学构成一种非限制性方法，用于共价修饰玻璃或硅表面上的硅烷醇基以连接更多的反应性官能团(例如胺基或羧基)，然后可用于偶联接头分子(例如各种长度的线性烃分子，例如C6、Cl2、C18烃或线性聚乙二醇(PEG)分子)或层分子(例如，支链的PEG分子或其他聚合物)附接在表面上。可用于产生任何所公开的低结合性载体表面的合适硅烷的示例包括但不限于(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)、(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、多种PEG-硅烷(例如，具有1K、2K、5K、10K、20K等的分子量)、氨基-PEG硅烷(即具有游离的氨基官能团)、马来酰亚胺-PEG硅烷、生物素-PEG硅烷等中的任何一种。

本领域技术人员已知的多种分子中的任何一种，包括但不限于氨基酸、肽、核苷酸、寡核苷酸、其他单体或聚合物或其组合都可以用于在载体表面上产生一种或多种化学修饰的层，其中可以改变所用的组分的选择以改变载体表面的一种或多种性质，例如官能团和/或栓系的寡核苷酸引物的表面密度、载体表面的亲水性/疏水性，或载体表面的三个三维性质(即“厚度”)。可用于在任何公开的载体表面中产生一层或多层低非特异性结合材料的优选聚合物的示例包括但不限于各种分子量和分支结构的聚乙二醇(PEG)、链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、右旋糖酐、聚赖氨酸和聚赖氨酸共聚物，或其任意组合。可用于将一层或多层材料(例如聚合物层)接枝到载体表面和/或使层彼此交联的共轭化学方法的示例包括但不限于生物素-链霉亲和素相互作用(或其变体)、其标签-Ni/NTA共轭化学、甲氧基醚共轭化学、羧酸酯共轭化学、胺共轭化学、NHS酯、马来酰亚胺、硫醇、环氧化物、叠氮化物、酰肼、炔烃、异氰酸酯和硅烷。

多层表面的一层或多层可以包含支化聚合物或可以是线性的。合适的支化聚合物的示例包括但不限于：支化的PEG、支化的聚乙烯醇(支化的PVA)、支化的聚(乙烯基吡啶)、支化的聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化的PVP)、支化的)、聚(丙烯酸)(支化的PAA)、支化的聚丙烯酰胺、支化的聚(N-异丙基丙烯酰胺)(支化的PNIPAM)、支化的聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化的PMA)、支化的聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化的PHEMA)、支化的聚(低聚(乙二醇)单甲醚甲基丙烯酸酯(支化的POEGMA)、支化的聚谷氨酸(支化的PGA)、支化的聚赖氨酸、支化的聚葡萄糖苷和右旋糖酐。

在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的支化聚合物可以包括至少4个分支、至少5个分支、至少6个分支、至少7个分支、至少8个分支、至少9个分支、至少10个分支、至少12个分支、至少14个分支、至少16个分支、至少18个分支、至少20个分支、至少22个分支、至少24个分支、至少26个分支、至少28个分支、至少30个分支、至少32个分支、至少34个分支、至少36个分支、至少38个分支或至少40个分支。分子通常显示出“2的幂”数量个分支，例如2、4、8、16、32、64或128个分支。

示例性的PEG多层包括在PEG-胺-APTES上的PEG(8臂、16臂、8臂)。在暴露于8uM引物的PEG-胺-APTES上观察到3层多臂PEG(8臂、16臂、8臂)和(8臂、64臂、8臂)的相似浓度，并且3层多臂PEG(8臂、8臂、8臂)使用星形PEG-胺代替16臂和64臂。还考虑具有可比较的第一、第二和第三PEG层的PEG多层。

用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以为至少500、至少1,000、至少1,500、至少2,000、至少2,500、至少3,000、至少3,500、至少4,000、至少4,500、至少5,000、至少7,500、至少10,000、至少12,500、至少15,000、至少17,500、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000或至少50,000道尔顿。在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以为至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多17,500、至多15,000、至多12,500、至多10,000、至多7,500、至多5,000、至多4,500、至多4,000、至多3500、至多3,000、至多2500、至多2,000、至多1,500、至多1,000或至多500道尔顿。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，用于产生本文公开的任何多层表面中的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量范围可以为约1,500道尔顿至约20,000道尔顿。本领域技术人员将认识到，用于产生本文公开的任何多层表面的一个或多个层的线性、支化或多支化聚合物的分子量可以具有在该范围内的任何数值，例如，约1,260道尔顿。

在一些情况下，例如，其中多层表面的至少一层包括支化聚合物，被沉积的层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数量可以在约每个分子一个共价键和每个分子约32个共价键的范围内。在一些情况下，新层的分支聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数目可以为每个分子至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少12、至少14、至少16、至少18、至少20、至少22、至少24、至少26、至少28、至少30、至少32或32个以上的共价键。在一些情况下，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数目可以为至多32、至多30、至多28、至多26、至多24、至多22、至多20、至多18、至多16、至多14、至多12、至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1个。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，新层的分支聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数目可以为大约4到大约16。本领域技术人员将认识到，新层的支化聚合物分子与前一层的分子之间的共价键的数目可以具有在该范围内的任何数值，例如，在一些情况下为约11，或在其他情况下平均值为约4.6。

在材料层偶联至载体表面之后残留的任何反应性官能团可任选地通过使用高产率偶联化学方法偶联小的惰性分子而被封闭。例如，在使用胺偶联化学将新材料层连接到前一层的情况下，任何残留的胺基随后可通过与小氨基酸(例如，甘氨酸)偶联而被乙酰化或失活。

沉积在所公开的低结合性载体表面上的低非特异性结合材料例如亲水性聚合物材料的层数可以在1至约10的范围内。在一些情况下，层数为至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10层。在一些情况下，层数可以是至多10、至多9、至多8、至多7、至多6、至多5、至多4、至多3、至多2或至多1层。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些情况下，层数可以在约2至约4的范围内。在一些情况下，所有层可以包括相同的材料。在一些情况下，每一层可以包括不同的材料。在一些情况下，多个层可以包括多种材料。在一些情况下，至少一层可以包含支化聚合物。在一些情况下，所有层都可以包含支化聚合物。

在一些情况下，可以使用极性质子溶剂、极性质子惰性溶剂、非极性溶剂或它们的任意组合将一层或多层低非特异性结合材料沉积在基底表面上和/或与基底表面结合。在一些情况下，用于层沉积和/或偶联的溶剂可以包括醇(例如，甲醇、乙醇、丙醇等)，另一种有机溶剂(例如乙腈、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等)、水、缓冲水溶液(例如磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)等)或其任意组合。在一些情况下，所使用的溶剂混合物的有机组分可占总数的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或在本文范围内或接近其的任何百分比，余量由水或缓冲水溶液补足。在一些情况下，所使用的溶剂混合物的含水组分可占总数的至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％，或在本文范围内或接近其的任何百分比，余量由有机溶剂补足。所用溶剂混合物的pH值可小于5、5、5、5、6、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或大于10，或在本文所述范围内或接近其的任何数值。

在一些情况下，可以使用有机溶剂的混合物将一层或多层低非特异性结合材料沉积在和/或缀合在基底表面，其中至少一种组分的介电常数小于40，并且构成总混合物体积的至少50％。在一些情况下，至少一种组分的介电常数可以小于10、小于20、小于30、小于40。在一些情况下，至少一种组分构成总混合物体积的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。

如所指出的，本公开内容的低非特异性结合载体显示出降低的蛋白质、核酸和用于固相核酸扩增的杂交和/或扩增制剂的其他组分的非特异性结合。可以定性或定量地评估由给定载体表面显示出的非特异性结合度。例如，在一些情况下，在标准的一组条件下，可以将表面暴露于荧光染料(例如，Cy3、Cy5等)、荧光标记的核苷酸、荧光标记的寡核苷酸和/或荧光标记的蛋白质(例如聚合酶)，随后进行指定的冲洗程序和荧光成像用作定性工具，用于比较在包含不同表面制剂的载体上的非特异性结合。在一些情况下，可以在标准的一组条件下，可以将表面暴露于荧光染料，荧光标记的核苷酸，荧光标记的寡核苷酸和/或荧光标记的蛋白质(例如，聚合酶)，随后进行指定的冲洗规程和荧光成像用作定量工具，用于比较在包含不同表面制剂的载体上的非特异性结合——前提是要确保在荧光信号与载体表面上荧光团的数目呈线性相关(或者以可预测的方式相关)的条件下(例如，在信号饱和和/或荧光团的自猝灭不成问题的条件下)使用合适的校准标准进行荧光成像。在一些情况下，可以用本领域技术人员已知的其他技术例如放射性同位素标记和计数方法来定量评估本公开内容的不同载体表面制剂显示出的非特异性结合的程度。

本文公开的一些表面显示出荧光团例如Cy3的特异性与非特异性结合的比值为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或本文范围内的任何中间值。本文公开的一些表面显示出荧光团例如Cy3的特异性荧光与非特异性荧光的比值为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16，17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或本文范围内的任何中间值。

如所指出的，在一些情况下，可以使用用于使表面与标记的蛋白质(例如，牛血清白蛋白(BSA)、链霉亲和素、DNA聚合酶、逆转录酶、解旋酶、单链结合蛋白(SSB)等，或其任意组合)、标记的核苷酸、标记的寡核苷酸等，在一组标准的温育和漂洗条件下接触，随后检测残留在表面上的标记量，并将由此产生的信号与适当的校准标准进行比较可以评估由所公开的低结合性载体显示出的非特异性结合的程度。在一些情况下，标记可以包括荧光标记。在一些情况下，标记可以包含放射性同位素。在一些情况下，标记可以包括本领域技术人员已知的任何其他可检测标记。在一些情况下，由给定的载体表面制剂所显示出的非特异性结合的程度由此可以根据每单位面积上非特异性结合的蛋白质分子(或其他分子)的数量来评估。在一些情况下，本公开内容的低结合性载体可以显示出小于0.001个分子/μm

在一些情况下，本文公开的表面显示出荧光团例如Cy3的特异性与非特异性结合的比值为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或本文范围内的任何中间值。在一些情况下，本文公开的表面显示出荧光团例如Cy3的特异性与非特异性荧光信号的比值为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、75、100或大于100，或本文范围内的任何中间值。

与本文的公开内容一致的低背景表面可以显示出至少3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1的特定染料附接(例如，Cy3附接)与非特定染料吸附(例如，Cy3染料吸附)的比值或所吸附的每个分子非特异性附接大于50个的特定染料分子。类似地，当受到激发能时，与本文所公开内容一致的已附接有荧光团(例如Cy3)的低背景表面可能会显示出特定荧光信号(例如，源自附接在表面的Cy3标记的寡核苷酸)与非特异性吸附染料荧光信号的比值为至少3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、30:1、40:1、50:1或大于50:1。

在一些情况下，可以例如通过测量水接触角(其中将小水滴放置在表面，使用例如光学张力计测量与表面的接触角)来评估所公开的载体表面的亲水性程度(或与水溶液的“润湿性”)。在一些情况下，可以确定静态接触角。在一些情况下，可以确定前进或后退接触角。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以在约0度至约50度的范围内。在一些情况下，本文公开的亲水性、低结合性载体表面的水接触角可以不超过50度、45度、40度、35度、30度、25度、20度、18度、16度、14度、12度、10度、8度、6度、4度、2度或1度。在许多情况下，接触角不超过该范围内的任何数值，例如不超过40度。本领域技术人员将认识到，本公开内容的给定的亲水性、低结合性的载体表面可以表现出具有在该范围内的任何数值的水接触角，例如约27度。

在一些情况下，本文公开的亲水性表面通常由于减少了生物分子与低结合表面的非特异性结合而有助于减少用于生物测定的洗涤时间。在一些情况下，可以在少于60、50、40、30、20、15、10或少于10秒的时间内执行足够的洗涤步骤。例如，在一些情况下，可以在少于30秒的时间内执行足够的洗涤步骤。

本公开内容的一些低结合表面对长期暴露于溶剂和高温，或溶剂暴露或温度变化的重复循环表现出稳定性或耐久性的显著改进。例如，在一些情况下，所公开表面的稳定性可以通过荧光标记表面上的官能团或表面上的栓系的生物分子(例如寡核苷酸引物)，并在长期暴露于溶剂和高温，或溶剂暴露或温度变化的重复循环的之前、期间和之后监测荧光信号来检测。在一些情况下，用于评估表面质量的荧光变化程度可以在暴露于溶剂和/或高温的1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时或100小时的时间段内小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％(或在这些时间段内测量的这些百分比的任意组合)。在一些情况下，用于评估表面质量的荧光变化程度可以在重复暴露于溶剂变化和/或温度变化的5个循环、10个循环、20个循环、30个循环、40个循环、50个循环、60个循环、70个循环、80个循环、90个循环、100个循环、200个循环、300个循环、400个循环、500个循环、600个循环、700个循环、800个循环、900个循环或1,000个循环内小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％(或在此循环范围内测量的这些百分比的任意组合)。

在一些情况下，本文公开的表面可以表现出特定信号与非特定信号或其他背景的高比率。例如，当用于核酸扩增时，一些表面表现出的扩增信号可以比表面的相邻非密集区域的信号大至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100倍或超过100倍。类似地，一些表面表现出的扩增信号比表面的相邻扩增核酸群体区域的信号大至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、75、100或超过100倍。

荧光激发能量在特定荧光团和方案之间变化，并且激发波长的范围可以从小于400nm到超过800nm，与本文公开的表面的荧光团选择或其他使用参数一致。

因此，本文公开的低背景表面相对于本领域已知的表面表现出低背景荧光信号或高对比度噪声(CNR)比。例如，在一些情况下，在包含杂交的核酸分子簇或由例如通过热循环的20个核酸扩增循环产生的克隆扩增的核酸分子簇的表面空间上不同的位置处或从该表面上的标记特征(例如，表面的标记的点、簇、离散区域、子部分或子组)移除的位置处的表面的背景荧光可以比在进行所述杂交或所述20个核酸扩增循环之前在相同位置处测量的背景荧光大不超过20倍、10倍、5倍、2倍、1倍、0.5倍、0.1倍或小于0.1倍。

在一些情况下，公开的低背景表面的荧光图像在用于核酸杂交或扩增应用中以产生杂交或克隆扩增的核酸分子簇(例如，已经被荧光团直接或间接标记)时显示出至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、210、220、230、240、250或大于250的对比度噪声比(CNR)。

寡核苷酸引物和衔接子序列：通常，一层或多层低非特异性结合材料中的至少一层可包含用于共价或非共价连接寡核苷酸分子的官能团，例如衔接子或引物序列，或至少一层在沉积在载体表面上时可能已经包含共价或非共价连接的寡核苷酸衔接子或引物序列。在一些情况下，拴系到至少一个第三层的聚合物分子的寡核苷酸可以在整个层中以多个深度分布。

在一些情况下，即在将聚合物偶联或沉积在表面上之前，将寡核苷酸衔接子或引物分子与溶液中的聚合物共价偶联。在一些情况下，在寡核苷酸衔接子或引物分子已经偶联或沉积在表面上之后，其被共价偶联至聚合物。在一些情况下，至少一个亲水性聚合物层包含多个共价连接的寡核苷酸衔接子或引物分子。在一些情况下，至少两层、至少三层、至少四层或至少五层亲水性聚合物包含多个共价连接的衔接子或引物分子。

在一些情况下，可使用本领域技术人员已知的多种合适的缀合化学中的任一种将寡核苷酸衔接子或引物分子偶联至一层或多层亲水性聚合物。例如，寡核苷酸衔接子或引物序列可包含与胺基、羧基、硫醇基等反应的部分。可以使用的合适的胺反应性共轭化学反应的示例包括但不限于涉及异硫氰酸酯基、异氰酸酯基、酰基叠氮化物基团、NHS酯基、磺酰氯基、醛基、乙二醛基、环氧化物基团、环氧乙烷基、碳酸酯基、芳基卤化物基团、酰亚胺酯基、碳二亚胺基、酸酐基和氟苯基酯基的反应。合适的羧基反应性共轭化学反应的示例包括但不限于涉及碳二亚胺化合物的反应，例如水溶性EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCL)。合适的巯基反应性共轭化学物质的示例包括马来酰亚胺、卤代乙酰基和吡啶基二硫化物。

可以将一种或多种类型的寡核苷酸分子附接或拴系在载体表面上。在一些情况下，一种或多种类型的寡核苷酸衔接子或引物可包含间隔子序列、用于与衔接子连接的模板文库核酸序列杂交的衔接子序列、正向扩增引物、反向扩增引物、测序引物和/或分子条形码序列或其任意组合。在一些情况下，可以将1个引物或衔接子序列栓系至表面的至少一层。在一些情况下，可以将至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或超过10个不同的引物或衔接子序列拴系在表面的至少一层上。

在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以在约10个核苷酸至约100个核苷酸的范围内。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以是至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个核苷酸。在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以是至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个核苷酸。该段落中描述的任何下限值和上限值可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以在约20个核苷酸至约80个核苷酸的范围内。本领域技术人员将认识到，拴系的寡核苷酸衔接子和/或引物序列的长度可以具有在该范围内的任何数值，例如约24个核苷酸。

在一些情况下，拴系的衔接子或引物序列可以包含设计成促进在低结合性载体上进行的核酸扩增的特异性和效率的修饰。例如，在一些情况下，引物可包含聚合酶终止点，使得在表面结合点和修饰位点之间的引物序列的拉伸始终为单链形式，并充当一些依赖解旋酶的等温扩增方法中的5’至3’解旋酶的加载位点。可用于产生聚合酶终止点的引物修饰的其他示例包括但不限于将PEG链插入引物主链的两个核苷酸之间朝向5’端，插入无碱基核苷酸(即，既没有嘌呤也没有嘧啶碱基的核苷酸)或可被解旋酶绕过的病变部位。

如将在下文的实施例中进一步讨论的，可能需要改变拴系在载体表面上的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度和/或远离载体表面拴系的衔接子或引物的间距(例如，通过改变用于将衔接子或引物栓系到表面的接头分子的长度)，以便在使用给定的扩增方法时“调节”载体以获得最佳性能。如下所述，调整拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度可能会影响载体上观察到的特异性和/或非特异性扩增的水平，其方式会根据所选的扩增方法而有所不同。在一些情况下，可以通过调节用于产生载体表面的分子组分的比例来改变拴系的寡核苷酸衔接子或引物的表面密度。例如，在使用寡核苷酸引物-PEG缀合物产生低结合性载体的最终层的情况下，可以改变寡核苷酸引物-PEG缀合物与非缀合的PEG分子的比例。然后可以使用本领域技术人员已知的多种技术中的任何一种来评估或测量所栓系的引物分子的表面密度。示例包括但不限于使用放射性同位素标记和计数方法、可裂解分子的共价偶联，所述可裂解分子包括可从限定区域的载体表面裂解的光学可检测标签(例如，荧光标签)，将其收集在固定体积的适当溶剂中，然后通过将荧光信号与已知光学标签浓度的校准溶液的荧光信号进行比较或使用荧光成像技术(只要已注意标记反应条件和图像采集设置)以确保荧光信号与表面上的荧光团数量线性相关(例如，表面上的荧光团没有明显的自猝灭)。

在一些情况下，本公开内容的低结合性载体表面上的寡核苷酸衔接子或引物的所得表面密度可以在约100个引物分子/μm

如上所列的衔接子或引物分子的局部表面密度不排除整个表面上密度的变化，使得表面可包含具有例如500,000/um

核酸分子与低结合性载体的杂交：在本公开内容的一些方面，描述了杂交缓冲液制剂，其与所公开的低结合性载体组合提供了提高的杂交速率、杂交特异性(或严格性)和杂交效率(或产量)。如本文所用，杂交特异性是栓系的衔接子序列、引物序列或寡核苷酸序列通常仅与完全互补序列正确杂交的能力的量度，而杂交效率是通常与互补序列杂交的总可利用的栓系的衔接子序列、引物序列或寡核苷酸序列的百分比的量度。

可以通过优化与所公开的低结合表面一起使用的杂交缓冲液制剂来实现改善的杂交特异性和/或杂交效率，并且将在以下实施例中更详细地讨论。可以被调节以实现更高性能的杂交缓冲液组分包括但不限于缓冲液类型、有机溶剂混合物、缓冲液pH、缓冲液粘度、去污剂和两性离子组分、离子强度(包括单价和二价离子浓度的调节)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、BSA、聚乙二醇、右旋糖酐硫酸酯、甜菜碱、其他添加剂等。

作为非限制性示例，用于配制杂交缓冲液的合适的缓冲液可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、乙酸盐、Tris、TAPS、MOPS、PIPES、HEPES、MES等。合适的缓冲液的选择通常取决于杂交缓冲液的目标pH。通常，缓冲溶液的期望pH将在约pH 4至约pH 8.4的范围内。在一些实施方式中，缓冲液pH可以为至少4.0、至少4.5、至少5.0、至少5.5、至少6.0、至少6.2、至少6.4、至少6.6、至少6.8、至少70、至少7.2、至少7.4、至少7.6、至少7.8、至少8.0、至少8.2或至少8.4。在一些实施方式中，缓冲液pH可为至多8.4、至多8.2、至多8.0、至多7.8、至多7.6、至多7.4、至多7.2、至多7.0、至多6.8、至多6.6、至多6.4、至多6、至多6.0、至多5.5、至多5.0、至多4.5或至多4.0。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，期望的pH可以在约6.4至约7.2的范围内。本领域技术人员将认识到，缓冲液pH可以具有该范围内的任何数值，例如约7.25。

用于杂交缓冲液制剂的合适的去污剂包括但不限于两性离子去污剂(例如，1-十二烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、3-(4-叔丁基-1-吡啶基)-1-丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十四烷基铵)丙磺酸盐、3-(N,N-二甲基十四烷基铵)丙磺酸盐、ASB-C80、C7BzO、CHAPS、CHAPS水合物、CHAPSO、DDMAB、二甲基乙基铵丙磺酸铵盐、N,N-二甲基十二烷基胺N氧化物、N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐或N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵-1-丙磺酸盐和阴离子去污剂、阳离子去污剂和非离子去污剂。非离子型去污剂的实例包括聚氧乙烯醚和相关的聚合物(例如，

单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可以产生比常规杂交方案快约2倍至约20倍的相对杂交速率。在一些情况下，相对杂交速率可以是常规杂交方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍或至少40倍。

在一些情况下，单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体对于这些完成指标中的任何一个可产生少于60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟的总的杂交反应时间(即，达到90％、95％、98％或99％的完成该反应所需的时间)。

在一些情况下，单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可产生与常规杂交方案相比提高的杂交特异性。在一些情况下，可以实现的杂交特异性优于在10个杂交事件中发生1个碱基错配、在20个杂交事件中发生1个碱基错配、在30个杂交事件中发生1个碱基错配、在40个杂交事件中发生1个碱基错配、在50个杂交事件中发生1个碱基错配、在75个杂交事件中发生1个碱基错配、在100个杂交事件中发生1个碱基错配、在200个杂交事件中发生1个碱基错配、在300个杂交事件中发生1个碱基错配、在400个杂交事件中发生1个碱基错配、在500个杂交事件中发生1个碱基错配、在600个杂交事件中有1个碱基错配、在700个杂交事件中发生1个碱基错配、在800个杂交事件中发生1个碱基错配、在900个杂交事件中发生1个碱基错配、在1,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在2,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在13,000个杂交事件中发生一个碱基错配、在4,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在5,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在6,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在7,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在8,000个杂交事件中发生1个碱基错配、在9,000个杂交事件中发生1个碱基错配，或在10,000个杂交事件中发生1个碱基错配。

在一些情况下，单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可产生与常规杂交方案相比提高的杂交效率(例如，与靶寡核苷酸序列成功杂交的载体表面上的可用寡核苷酸引物的分数)。在一些情况下，对于下文指定的任何输入靶寡核苷酸浓度以及在上述任何指定的杂交反应时间可获得的杂交效率均优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些情况下，例如，其中杂交效率小于100％，与载体表面杂交的靶核酸序列的所得表面密度可以小于该表面上的寡核苷酸衔接子或引物序列的表面密度。

在一些情况下，使用常规杂交(或扩增)方案或优化的杂交(或扩增)方案将所公开的低结合性载体用于核酸杂交(或扩增)应用中可导致对与载体表面接触的靶(或样品)核酸分子的输入浓度的需求降低。例如，在一些情况下，靶(或样品)核酸分子可以以约10pm至约1μm的浓度与载体表面接触(即，在退火或扩增之前)。在一些情况下，可以以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至少10pM、至少20pM、至少30pM、至少40pM、至少50pM、至少100pM、至少200pM、至少300pM、至少400pM、至少500pM、至少600pM、至少700pM、至少800pM、至少900pM、至少1nM、至少10nM、至少20nM、至少30nM、至少40nM、至少50nM、至少60nM、至少70nM、至少80nM、至少90nM、至少100nM、至少200nM、至少300nM、至少400nM、至少500nM、至少600nM、至少700nM、至少800nM、至少900nM或至少1μM。在一些情况下，可以以以下浓度来施用靶(或样品)核酸分子：至多1μM、至多900nM、至多800nm、至多700nM、至多600nM、至多500nM、至多400nM、至多300nM、至多200nM、至多100nM、至多90nM、至多80nM、至多70nM、至多60nM、至多50nM、至多40nM、至多30nM、至多20nM、至多10nM、至多1nM、至多900pM、至多800pM、至多700pM、至多600pM、至多500pM、至多400pM、至多300pM、至多200pM、至多100pM、至多90pM、至多80pM、至多70pM、至多60pM、至多50pM、至多40pM、至多30pM、至多20pM或至多10pM。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，可以以约90pm至约200nm的浓度范围施用靶(或样品)核酸分子。本领域技术人员将认识到，可以以在具有该范围内的任何数值例如约855nm的浓度来施用靶(或样品)核酸分子。

在一些情况下，单独或与优化的杂交缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子的表面密度(即，在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的范围为约0.0001个靶寡核苷酸分子/μm

换句话说，在一些情况下，单独或与优化的杂交缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可能会导致杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子(即在进行任何后续固相或克隆扩增反应之前)的表面密度为约100个杂交的靶寡核苷酸分子/mm

在一些情况下，与附接于低结合性载体表面的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度范围可以为约0.02千碱基(kb)至约20kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.00kb、至少0.005kb、至少0.00kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少0.6kb、至少0.7kb、至少0.8kb、至少0.9kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb或至少40kb，或本文所述范围内的任何中间值，例如长度至少为0.85kb。

在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可以包含单链或双链的多聚核酸分子，所述多聚核酸分子还包含重复的规则存在的单体单元。在一些情况下，单链或双链多聚核酸分子的长度可以是至少0.00kb、至少0.005kb、至少0.00kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb、至少20kb、至少30kb、至少40kb，或在本文所述范围内的任何中间值，例如长度为约2.45kb。

在一些情况下，靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单链或双链多聚核酸分子，所述多聚核酸分子包含约2至约100个规则重复的单体单元的拷贝。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有该范围内的任何数值，例如约17。因此，在一些情况下，即使杂交效率小于100％，就每单位面积的载体表面上的靶标序列的拷贝数而言，杂交靶标序列的表面密度也可能超过寡核苷酸引物的表面密度。

核酸表面扩增(NASA)：如本文所用，短语“核酸表面扩增”(NASA)可与短语“固相核酸扩增”(或简称为“固相扩增”)互换使用。在本公开内容的一些方面，描述了核酸扩增制剂，其与所公开的低结合性载体组合，提供了提高的扩增速率、扩增特异性和扩增效率。如本文所用，特异性扩增是指已经共价或非共价拴系在固体载体上的模板文库寡核苷酸链的扩增。如本文所用，非特异性扩增是指引物二聚体或其他非模板核酸的扩增。如本文所用，扩增效率是在给定的扩增循环或扩增反应期间成功扩增的载体表面上的栓系寡核苷酸的百分比的量度。在本文公开的表面上进行的核酸扩增可获得至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或大于95％(例如98％或99％)的扩增效率。

多种热循环或等温核酸扩增方案中的任何一种均可与所公开的低结合性载体一起使用。可以与公开的低结合性载体一起使用的核酸扩增方法的示例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、多置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、核酸序列扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、桥扩增、等温桥扩增、滚环扩增、环间扩增、解旋酶依赖性扩增、重组酶依赖性扩增或单链链结合(SSB)蛋白依赖性扩增。

通常，单独或与扩增反应组分的制剂组合使用所公开的低结合性载体，可以实现扩增速率、扩增特异性和扩增效率的改善。除了包含核苷酸、一种或多种聚合酶、解旋酶、单链结合蛋白等(或其任意组合)以外，还可以通过多种方式调节扩增反应混合物以实现更高的性能，包括但不限于缓冲液类型、缓冲液pH值、有机溶剂混合物、缓冲液粘度、去污剂和两性离子组分、离子强度(包括一价和二价离子浓度的调节)、抗氧化剂和还原剂、碳水化合物、BSA、聚乙二醇、右旋糖酐硫酸酯、甜菜碱、其他添加剂等的选择。

单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合性载体与使用常规载体和扩增方案获得的那些相比可以产生提高的扩增速率。在一些情况下，对于上述任何一种扩增方法，可以达到的相对扩增速率可以是使用常规的载体和扩增方案的至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少12倍、至少14倍、至少16倍、至少18倍或至少20倍。

在一些情况下，单独或与优化的缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体对于这些完成指标中的任何一个可产生少于180分钟、120分钟、90分钟、60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、3分钟、1分钟、50秒、40秒、30秒、20秒或10秒的总的扩增反应时间(即，达到90％、95％、98％或99％的完成反应所需的时间)。

本文公开的一些低结合性载体表面显示出荧光团(例如Cy3)的特异性结合与非特异性结合的比值至少为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1，或本文范围内的任何中间值。本文公开的一些表面显示出荧光团(例如Cy3)的特异性信号与非特异性荧光信号的比值至少为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1，9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、75:1、100:1或大于100:1，或本文范围内的任何中间值。

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可以实现不超过60分钟、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟或10分钟的更快的扩增反应时间(即，达到90％、95％、98％或99％的完成扩增反应所需的时间)。类似地，单独使用公开的低结合性载体或与优化的缓冲液制剂组合使用可使扩增反应在一些情况下完成不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、15个循环，或不超过30个循环。

在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案相比，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合性载体可产生增加的特异性扩增和/或减少的非特异性扩增。在一些情况下，可以实现的特异性扩增与非特异性扩增的所得比值为至少4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1，20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、200:1、300:1、400:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1或1,000:1。

在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案相比，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用低结合性载体可产生提高的扩增效率。在一些情况下，在上述指定的任何扩增反应时间中，可实现的扩增效率均优于50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。

在一些情况下，与附接在低结合性载体表面上的寡核苷酸衔接子或引物分子杂交的克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)的长度可以为约0.02千碱基(kb)至约2kb或约0.1千碱基(kb)至约20kb。在一些情况下，克隆扩增的靶寡核苷酸分子的长度可以是至少0.001kb、至少0.005kb、至少0.01kb、至少0.02kb、至少0.05kb、至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或本文所述范围内的任何中间值，例如长度至少0.85kb。

在一些情况下，克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单链或双链的多聚核酸分子，其还包含重复的规则存在的单体单元。在一些情况下，克隆扩增的单链或双链多聚核酸分子的长度可以为至少0.1kb、至少0.2kb、至少0.3kb、至少0.4kb、至少0.5kb、至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少15kb或至少20kb，或本文所述范围内的任何中间值，例如长度约为2.45kb。

在一些情况下，克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单链或双链多聚核酸分子，其包含约2至约100个规则重复的单体单元的拷贝。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以为至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100个。在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以是至多100、至多95、至多90、至多85、至多80、至多75、至多70、至多65、至多60、至多55、至多50、至多45、至多40、至多35、至多30、至多25、至多20、至多15、至多10、至多5、至多4、至多3个或至多2个。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容中包括的范围，例如，在一些情况下，规则重复的单体单元的拷贝数可以在约4至约60的范围内。本领域技术人员将认识到，规则重复的单体单元的拷贝数可以具有该范围内的任何数值，例如约12个。因此，在一些情况下，就每单位面积的载体表面上的靶标序列的拷贝数而言，即使杂交和/或扩增效率小于100％，克隆扩增的靶标序列的表面密度也可能超过寡核苷酸引物的表面密度。

在一些情况下，与使用常规载体和扩增方案相比，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合性载体可产生增加的克隆拷贝数。在一些情况下，例如其中克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子包含单体靶标序列的串联的多聚体重复序列，其克隆拷贝数可能比使用常规载体和扩增方案获得的克隆拷贝数少得多。因此，在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的集落约1个分子至约100,000个分子(例如靶标序列分子)。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的集落至少1、至少5、至少10、至少50、至少100、至少500、至少1,000、至少2,000、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少6,000、至少7,000、至少8,000、至少9,000、至少10,000、至少15,000、至少20,000、至少25,000、至少30,000、至少35,000、至少40,000、至少45,000、至少50,000、至少55,000、至少60,000、至少65,000、至少70,000、至少75,000、至少80,000、至少85,000、至少90,000、至少95,000或至少100,000个分子。在一些情况下，克隆拷贝数可以为每个扩增的集落至多100,000、至多95,000、至多90,000、至多85,000、至多80,000、至多75,000、至多70,000、至多65,000、至多60,000、至多55,000、至多50,000、至多45,000、至多40,000、至多35,000、至多30,000、至多25,000、至多20,000、至多15,000、至多10,000、至多9,000、至多8,000、至多7,000、至多6,000、至多5,000、至多4,000、至多3,000、至多2,000、至多1,000、至多500、至多100、至多50、至多10、至多5或至多1个分子。该段落中描述的下限值和上限值中的任何一个可以组合以形成本公开内容所包括的范围，例如，在一些情况下，克隆拷贝数可以在约2,000个分子至约9,000个分子的范围内。本领域技术人员将认识到，克隆拷贝数可以具有该范围内的任何数值，例如在一些情况下约为2,220个分子，在其他情况下约为2个分子。

如上所述，在一些情况下，扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含单体靶标序列的串联的多聚体重复序列。在一些情况下，扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或核酸分子)可包含多个分子，每个分子均包含单个单体靶标序列。因此，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合性载体可导致靶标序列拷贝的表面密度为约100个靶标序列拷贝/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度为约100个分子/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸分子(或簇)的表面密度为约100个分子/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增缓冲液制剂组合使用所公开的低结合性载体可导致克隆扩增的靶(或样品)寡核苷酸集落(或簇)的表面密度为约100个集落/mm

在一些情况下，单独或与优化的扩增反应制剂组合使用所公开的低结合性载体可从扩增和标记的核酸群体中产生信号(例如，荧光信号)，所述核酸群体的变异系数不大于50％，例如50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或小于5％。

在一些情况下，本文公开的载体表面和方法能够在升高的延伸温度下扩增，例如在15C、20C、25C、30C、40C或更高的温度下，或例如在约21C或23C的温度下。

在一些情况下，使用本文公开的载体表面和方法使得简化的扩增反应成为可能。例如，在一些情况下，使用不超过1、2、3、4或5种离散试剂进行扩增反应。

在一些情况下，使用本文公开的载体表面和方法使得能够在扩增过程中使用简化的温度曲线，从而使反应在15C、20C、25C、30C或40C的低温至40C、45C、50C、60C、65C、70C、75C、80C或大于80C的高温下进行，例如20C至65C的范围内。

也改善了扩增反应，使得较低量的模板(例如靶标或样品分子)足以在表面上产生可辨别的信号，例如1pM、2pM、5pM、10pM、15pM、20pM、30pM、40pM、50pM、60pM、70pM、80pM、90pM、100pM、200pM、300pM、400pM、500pM、600pM、700pM、800pM、900pM、1,000pM、2,000pM、3,000pM、4,000pM、5,000pM、6,000pM、7,000pM、8,000pM、9,000pM、10,000pM或大于10,000pM的样品，例如500nM。在示例性的实施方式中，约100pM的输入足以产生信号，以供确定可靠的信号。

载体表面的荧光成像：所公开的固相核酸扩增反应制剂和低结合性载体可用于多种核酸分析应用中的任何一种，例如核酸碱基鉴别、核酸碱基分类、核酸碱基调用、核酸检测应用、核酸测序应用以及基于核酸的(遗传和基因组)诊断应用。在许多这些应用中，荧光成像技术可用于监测在低结合性载体上进行的杂交、扩增和/或测序反应。

可以使用本领域技术人员已知的各种荧光团、荧光成像技术和荧光成像仪器来进行荧光成像。可以使用的合适的荧光染料的示例(例如，通过与核苷酸、寡核苷酸或蛋白质的结合)包括但不限于荧光素、若丹明、香豆素、花菁及其衍生物，包括花菁衍生物花菁染料-3(Cy3)、花菁染料5(Cy5)、花菁染料7(Cy7)等。可以使用的荧光成像技术的示例包括但不限于宽场荧光显微镜荧光显微镜成像、荧光共聚焦成像、双光子荧光等。可以使用的荧光成像仪器的示例包括但不限于配备有图像传感器或照照相机的荧光显微镜、宽场荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜、双光子荧光显微镜或包括合适选择的光源、透镜、反射镜、棱镜、二向色反射镜、光圈、图像传感器或照相机等的常规仪器。配备有用于获取公开的低结合性载体表面和与其杂交的靶核酸序列的克隆扩增集落(或簇)的图像的荧光显微镜的非限制性实例是Olympus1X83倒置荧光显微镜，其配备有20x、0.75NA、532nm光源、为532nm长通激发和Cy3荧光发射滤波器而优化的带通和二向色镜滤波器组、Semrock 532nm二向色反射镜以及照照相机(Andors CMOS，Zyla4.2)，其中调整激发光强度以避免信号饱和。通常，在获取图像的同时，将载体表面浸入缓冲液(例如25mM ACES，pH 7.4缓冲液)中。

在一些情况下，可以使用荧光成像技术评估使用公开的反应制剂和低结合性载体的核酸杂交和/或扩增反应的性能，其中图像的对比度噪声比(CNR)提供了评估载体上的扩增特异性和非特异性结合的关键指标。CNR通常定义为：CNR＝(信号-背景)/噪声。背景项通常被认为是在指定的相关区域(ROI)中围绕特定特征(衍射极限光斑，DLS)的间质区域测量的信号。虽然信噪比(SNR)通常被认为是整体信号质量的基准，但可以证明，在需要快速图像捕获的应用(例如，必须缩短循环时间的测序应用)中，提高的CNR可以提供比作为信号质量基准的SNR的显著优势，如下文实施例所示。如图6A和图6B所示，在高CNR下，即使CNR有适度改进，也可以大大减少达到准确区分(因此在测序应用中准确碱基识别)所需的成像时间。图6A和图6B提供了作为CNR(在图6A中，CNR＝1.25；在图6B中，CNR＝12.49)和积分时间(在两个图中SNR＝2)的函数而测量的信号和背景强度(实线)和积分平均值(虚线)的模拟数据，这说明了通过使用CNR作为信号质量度量可以实现的改进的区分。图7提供了图像数据中改进的CNR对准确检测特征(例如载体表面上的克隆扩增的核酸集落)所需的成像积分时间的影响的示例。

在大多数基于整体的测序方法中，通常将背景项测量为与“间质”区域相关的信号(参见图8)。除了“间质”背景(B

如下文实施例所证明，在本公开内容的低结合性基底上实施核酸扩增可通过减少非特异性结合来降低B

所公开的低结合性载体，任选的与所公开的杂交和/或扩增方案组合使用，产生固相反应，其表现出：(i)可忽略的蛋白质和其他反应组分的非特异性结合(从而最小化基底背景)，(ii)可以忽略的非特异性核酸扩增产物，和(iii)提供可调的核酸扩增反应。尽管本文主要在核酸杂交、扩增和测序测定的背景下进行了描述，但本领域技术人员将理解，所公开的低结合性载体可以用于多种其他生物测定形式中的任何一种，包括但不限于三明治免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)等。

系统：本文提供了使用本文所述的表面进行碱基区分或碱基分类反应的系统。还提供了一种用于进行本文公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，该系统包括使寡核苷酸分子偶联至附接的寡核苷酸分子、使样品或靶核酸与附接的寡核苷酸分子杂交以及检测表面上的信号或使表面上的信号成像所必需的组分和试剂。

还提供了一种用于进行本文公开的任何测序方法的一个或多个步骤的系统。任选地，该系统包括在基于荧光核苷酸或寡核苷酸的检测的此类测序技术中分析核酸序列所必需的组分和试剂。用于读取此类阵列上的荧光信号的检测仪器可以基于落射荧光或全内反射显微镜。已经提出了一种使用光学合成测序读取器的检测仪器。读取器可以包括从流动池的水通道内的样品诱导荧光的激光器。荧光由包括一个或多个物镜和管透镜的成像光学器件发射和收集。光学成像器包括在感兴趣的区域中照明样品的光源、一个或多个检测器以及将光从感兴趣的区域引导至检测器的光学组件等。光学成像器还可包括聚焦机构，该聚焦机构将光学部件的焦点保持在感兴趣的区域上，以便在检测器处接收的光接收在焦点中。

碱基对分类的方法：本文提供了进行核酸碱基对区分或碱基对分类的方法，该方法包括：a)提供表面；其中该表面包括：i)基底；ii)至少一层亲水性聚合物涂层；iii)附接至至少一层亲水性聚合物涂层的多个寡核苷酸分子；以及iv)表面的至少一个离散区域，该离散区域包含与多个附接的寡核苷酸分子退火的多个克隆扩增的样品核酸分子，其中多个退火的克隆扩增的样品核酸分子以至少10,000个分子/mm

本文提供的还包括通过利用本文所述的表面或系统进行核酸测序的方法。在一些实施方案中，可检测标签是荧光团。在一些实施方案中，可检测标签是花青染料-3(Cy3)，其中在结合或掺入第一Cy3标记核苷酸后，将表面浸入缓冲液中的同时，使用配备有20x、0.75NA、532nm光源、针对532nm长通激发和Cy3荧光发射滤光片进行了优化的带通和二向色镜滤光片组、Semrock 532nm二向色反射器以及相机(Andor sCMOS，Zyla 4.2)的OlympusIX83倒置荧光显微镜，在非信号饱和条件下获取的表面的荧光图像表现出至少20的对比度噪声(CNR)比。

在一些实施方案中，核酸扩增反应包括桥扩增反应。在一些实施方案中，核酸扩增反应包括等温桥扩增反应。在一些实施方案中，核酸扩增反应包括滚环扩增(RCA)反应。在一些实施方案中，核酸扩增反应包括解旋酶依赖性扩增反应。在一些实施方案中，核酸扩增反应包括重组酶依赖性扩增反应。在一些实施方案中，至少一层亲水性聚合物涂层表现出小于50度的水接触角。

实施例

仅出于说明性目的来提供这些实施例，而并非限制本文提供的权利要求的范围。

实施例1–亲水性基底

使用不同分子量和官能端基的聚(乙二醇)(PEG)分子进行研究以制备和评估低非特异性结合载体表面。一层或多层PEG通过与端基官能团偶联的硅烷连接到玻璃表面。可用于偶联的官能团的实例包括但不限于生物素、甲氧基醚、羧酸酯、胺、NHS酯、马来酰亚胺和双硅烷。然后将具有不同碱基序列和碱基修饰的寡核苷酸引物以不同的密度栓系至表面层。改变表面官能团密度和寡核苷酸浓度这两者以达到(target)特定的引物密度范围。此外，可以通过用带有相同官能团的其他分子稀释寡核苷酸来控制引物密度。例如，胺标记的寡核苷酸可以在与NHS酯涂覆的表面反应中用胺标记的聚乙二醇稀释，以降低最终的引物密度。包含位于杂交区和表面附接官能团之间的不同长度接头的引物也可用于控制密度。示例接头包括引物5’端的多聚胸苷酸链和多聚腺苷酸链(长度为0-20个碱基)、PEG接头(长度为3-20个单位)和各种长度的烃链接头(例如，C6、C12、C18等)。为了测量引物密度，将荧光标记的引物固定在表面上，并将荧光读数与已知浓度的染料溶液的荧光读数进行比较。

低非特异性结合(在本文中也称为“钝化的”)基底表面是合乎需要的，使得生物分子(例如蛋白质和核酸)不会“粘”到表面上。下文提供了使用标准单层表面制备和各种玻璃表面处理制备的低非特异性结合(低NSB)表面的实例。在钝化表面上成功进行核酸扩增是一项独特的挑战。由于钝化的亲水性表面表现出超低的蛋白质和核酸NSB，因此必须利用新条件来实现高钝化、改进的引物沉积反应效率、杂交条件并诱导有效的核酸扩增。固相核酸杂交和扩增过程需要将核酸模板附接至低结合或钝化表面，然后将蛋白质递送并结合到表面。新的引物表面缀合制剂(通过Cy3寡核苷酸接枝滴定确定)和由此产生的超低非特异性背景(如使用红色和绿色染料的NSB功能测试结果评估)的组合证明了这些方法的可行性。

为了按比例缩放引物密度并为亲水性表面或两性表面增加额外的维度，已经使用PEG和其他亲水性聚合物涂覆和测试了多层涂层。通过使用亲水性表面和两性表面成层方法——包括但不限于这里描述的聚合物/共聚物材料——可以显著增加载体表面上的引物负载。已经报道了使用单层引物沉积过程的常规PEG涂覆的载体用于单分子测序应用，但它们不会产生用于核酸扩增的高拷贝数。在这里，我们公开了“成层”可以使用传统的交联方法和化学相容的单体或聚合物亚单元来完成，从而可以顺序构建一个或多个高度交联的层。适合使用的聚合物的非限制性实例包括链霉亲和素、聚丙烯酰胺、聚酯、dextram、聚赖氨酸、聚乙二醇和聚赖氨酸共聚物、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(POEGMA)、聚酯、右旋糖酐、聚赖氨酸、聚乙二醇(PEG)、聚丙烯酸(PAA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)和聚赖氨酸共聚物。不同的层可以使用多种共价或非共价反应中的任意一种附接至彼此，多种共价或非共价反应包括但不限于生物素-链霉亲和素结合、叠氮化物-炔烃点击反应、胺-NHS酯反应、硫醇-马来酰亚胺反应以及带正电荷的聚合物和带负电荷的聚合物之间的离子相互作用。也可以想象，这些高引物密度材料可以在溶液中构建，然后在多个步骤中分层到表面上。使用这种方法，可以产生低NSB/低背景基底表面(图9-13)，用于进行固相核酸扩增和测序化学反应，提供显著改进的核酸扩增，使得可以调整信号与背景的比率以满足特定测序应用的需要(图14和图15)。图9提供了来自研究的图像数据的示例，以确定绿色荧光染料与根据不同表面修饰方案处理的玻璃基底表面的非特异性结合的相对水平。图10提供了来自研究的图像数据的示例，以确定红色荧光染料与根据不同表面修饰方案处理的玻璃基底表面的非特异性结合的相对水平。图11提供了根据不同表面修饰方案处理的基底表面的寡核苷酸引物接枝数据的示例。

利用硫醇-马来酰亚胺化学反应制备2层PEG表面的方法：在室温下使用2M KOH处理30分钟来清洁玻璃载玻片，洗涤，然后使用氧等离子体活化表面硅烷醇基团。硅烷-PEG5K-硫醇(Creative PEGWorks,Inc.,Durham,NC)以乙醇中的0.1％的浓度施加。2小时的涂覆反应后，将玻璃载玻片用乙醇和水彻底清洗，然后与2.5mM马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺戊酸酯(MW＝20K)在二甲基甲酰胺(DMF)中反应30分钟。清洗所得表面，并在室温下与5’-胺标记的寡核苷酸引物快速反应2小时。在固定引物后，通过在pH 9下与100mM甘氨酸反应使表面上过量的琥珀酰亚胺酯失活。

利用NHS酯-胺化学反应制备多层PEG表面的方法：在室温下通过2M KOH处理30分钟来清洁玻璃载玻片，洗涤，然后使用氧等离子体活化表面硅烷醇基团。硅烷-PEG2K-胺(Nanocs,Inc.,New York,NY)以在乙醇溶液中的0.5％的浓度施加。2小时的涂覆反应后，将载玻片用乙醇和水彻底清洗。在室温下在溶剂组合物中引入100uM的8臂PEG NHS(MW＝10K，Creative PEGWorks,Inc.,Durham,NC)持续20分钟，该溶剂组合物可包含5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的有机溶剂和5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的低离子强度缓冲液。清洗所得表面并与20μM多臂PEG胺(MW＝10K，Creative PEGWorks,Inc.,Durham,NC)反应2小时。然后将所得的胺-PEG表面与不同浓度的多臂PEG-NHS和胺标记的寡核苷酸引物的混合物反应。可以重复此过程以在表面上生成额外的PEG层。

固相等温扩增：在考虑各种等温扩增方法时，可以表明每种等温扩增方法具有独特的最佳引物密度范围，这需要可调的表面涂层以使扩增效率最大化。在一些情况下，模板拷贝数越大，引物表面密度标度越大(图15)。在一些情况下，虽然较高的引物表面密度可能会为某些扩增方法产生高前景信号(即序列特异性信号)，但它们可能会导致高背景信号，从而证明对其他扩增方法有害。在图16中，引物沉积浓度显示在图的顶部，而测试的各种解旋酶等温扩增制剂则显示在等温扩增反应后所得表面获得的图像中。如果发生了特异性扩增，则预期每个表面的图像都呈红色。从图16中制剂“58”的一系列图像可以明显看出，随着引物密度的增加，颜色从红色变为绿色，因此表明特异性扩增减少。此外，可以看出，在扩增反应制剂中加入甜菜碱(一种常见的缓冲添加剂)会降低非特异性扩增的程度，有利于特异性扩增，从而产生更亮的信号和提高的CNR。低结合、成层的载体表面、可调的引物表面密度、杂交和/或扩增反应制剂的改进(包括缓冲液成分和添加剂的调整(例如，缓冲液、pH、溶剂、离子强度、去污剂、甲酰胺、甜菜碱、拥挤剂(crowding agent)和其他添加剂等的选择))的组合，以及由此产生的扩增速率和特异性的改进，应该会导致下一代核酸测序的空前改进。

本公开内容解决了在亲水性基底上实现文库核酸链的高度单克隆扩增的挑战，用于需要信号增强的多种应用，例如核酸检测、测序和诊断应用。用于产生文库核酸链的单克隆簇的核酸扩增的常规等温方法是受限的并且存在缺陷。它们的性能限制的实例包括长聚类时间(例如，2+小时)、对高温的要求(例如，60℃以上)、无法在某些表面上有效地扩增/聚类、成本高、多克隆性问题、试剂稳定性问题等。尽管文献中描述了大量的等温扩增方法，但成功应用于商业测序应用的方法只有一两种。在这里，我们提出了等温扩增策略，该策略成功地生成了文库DNA片段(或其他核酸)的单克隆拷贝簇，用于DNA测序等应用，并消除或缓解了上述问题。

开发整体DNA扩增/DNA测序组合物变化以减少背景信号(B

实施例2–具有改进的特异性的低结合表面上的解旋酶依赖性扩增

众所周知，解旋酶依赖性扩增高度倾向于非特异性扩增，例如引物二聚体形成。我们可以通过以下方法的任意组合来减少表面上的这种非特异性扩增：(i)设计产生较少引物二聚体的寡核苷酸引物，(ii)调整多层载体表面上的引物表面密度，(iii)在更高的温度下使用嗜热酶进行反应，(iv)使用诸如上述那些扩增缓冲液添加剂和非自引发引物序列的组合，以及(v)引入一个或多个完全的核酸变性和引物杂交步骤。

在不存在SSB蛋白的情况下在低NSB表面上的特异性解旋酶依赖性扩增：线性模板链的解旋酶依赖性扩增可以利用在低结合表面上减少非特异性扩增和高效克隆扩增来实现。使用含聚合酶和解旋酶的扩增反应混合物，表面上的正向引物在单链模板文库链上延伸。然后，任选地，模板链被变性并被洗掉。或者，双链体可通过解旋酶活性展开。任一种方法都使从表面缀合引物延伸的正向链部分或全部以单链形式存在。随后，表面栓系的反向引物与该正向链杂交并且也延伸，从而形成双链桥结构。反应混合物中存在的解旋酶展开中间双链扩增子链，然后可将其重新杂交到其他游离的表面栓系的引物上，用于后续的扩增轮次。为了使其发生，展开的程度不需要很大——只需足以将引物杂交区域转化为单链成分(末端散开(fraying))，以允许随后的表面缀合的引物的杂交。该反应中使用的解旋酶应该能够从桥结构的末端开始展开，并且可以是3’至5’解旋酶或5’至3’解旋酶。在一些情况下，它可能是超家族1、2、3、4、5或6解旋酶。在一些情况下，它可以是一种高度进行性解旋酶(即能够展开许多连续的碱基对而不释放单链结构或双链结构)或具有有限持续合成能力的解旋酶。表现出更高的持续合成能力的超家族1解旋酶的某些突变体，例如解旋酶UvrD的UvrD303突变体，可用于该扩增方案。

为了促进经由5’至3’解旋酶的展开，一个或两个表面栓系引物的全部或部分可以包括修饰以产生用于5’至3’解旋酶的特定加载位点。在从这样的引物延伸的模板核酸上，修饰位点将充当聚合酶终止点，从而使表面缀合点和修饰位点之间的引物序列段始终处于单链形式。该段将作为具有5’至3’方向性的解旋酶的加载位点，因为许多解旋酶具有更好的单链核酸结合亲和力，引导和促进5’至3’解旋酶展开活性，这是载体表面上的解旋酶依赖性扩增所需的。可以使用的引物修饰的实例包括但不限于将PEG链插入引物骨架中朝向5’端的两个核苷酸之间、插入无碱基核苷酸(即，既没有嘌呤或嘧啶碱基的核苷酸)，或可以被解旋酶绕过的病变位点。

许多解旋酶具有激活或增强解旋酶活性的辅助因子蛋白和特定构象。实例包括但不限于来自Bst的PcrA解旋酶的RepD蛋白、大肠杆菌(E.coli)Rep解旋酶的phi X基因蛋白A和UvrD解旋酶的MutL蛋白。添加这些辅助蛋白可以更有效地实现期望的展开活性，从而进一步促进解旋酶依赖性等温扩增。这些辅助因子中的一些具有特异性结合序列或部分，可以将其添加到引物中以引导展开活性。

当使用嗜温解旋酶和链置换聚合酶制剂(该制剂缺少单链结合(SSB)蛋白)(例如，内参制剂#58)时，解旋酶扩增制剂显示减少的非特异性扩增。与大多数解旋酶依赖性扩增方法的情况不同，观察到从制剂中排除单链结合蛋白(通常用于破坏瞬时非特异性杂交)可减少非特异性扩增。多种制剂变化显示出可以减轻低结合表面上非特异性杂交的增加。

改进的解旋酶依赖性扩增的制剂组成改变：众所周知，添加剂(例如甜菜碱)可以降低在溶液中进行的等温扩增反应的非特异性扩增。由于需要高引物表面密度以支持模板核酸集落中的可调扩增和高拷贝数，因此标准变得更加严格。在高引物密度下，非特异性扩增开始助长所得集落中高模板拷贝数的好处(图16)。结果，已经发现了助长模板核酸集落内的非特异性扩增的另外的添加剂制剂。在图16所示的示例中，可以清楚地看到，将甜菜碱添加到制剂#58中会在较高引物密度的表面上产生更多特异性扩增(由红色表示)。除了甜菜碱之外，还可以组合许多不同的反应制剂组分以在溶液中和在低结合表面上(图17和图18)实现更高的扩增特异性。

有机溶剂(例如乙腈、DMSO、DMF、乙醇、甲醇和类似化合物)通过寡核苷酸脱水过程改变单链核酸和双链核酸的结构。已知诸如2-吡咯烷酮和甲酰胺的化合物降低核酸的解链温度，并减少高GC含量的寡核苷酸的二级结构。还已知拥挤剂稳定核酸结构。在低pH缓冲液中，碱基配对中的杂交和氢键结合变得更有利。当组合这些各制剂的每一个的不同属性时，有可能将寡核苷酸序列的特定退火比传统方法提高2个数量级以上。通过组合这些化合物并将它们添加到下述扩增制剂中，非特异性扩增(例如由引物二聚体引起的)被大大减弱，在溶液中(图17)和在公开的低NSB表面上(图18)仍然观察到良好的特异性扩增产物产率。

实施例3-修饰的滚环多重置换扩增(修饰的RCA-MDA)

将核酸文库片段连接到衔接子序列(包含正向引物、反向引物和测序引物，以及任何识别/条形码序列)并在溶液中或在低结合表面上环化。

然后环化的ssDNA被溶液中或表面上的正向表面引物捕获或与其杂交，并通过链置换聚合酶在RCA反应中延伸，该链置换聚合酶产生文库核酸和接头序列的单链串联拷贝。反向引物在多个位置与该串联正向模板杂交，并通过RCA反应混合物进行延伸，从而产生串联反向拷贝。在此过程中，反向链相互置换。上游反向链延伸将取代下游延伸，从而产生单链串联反向链。添加解旋酶可以产生持续足够长的核酸单链区域，以重新开始杂交并触发置换级联，这可以以相对受控的方式增加扩增拷贝数。或者，在称为链侵入的过程中，添加重组酶和辅助蛋白可以将引物杂交到双链DNA的同源区域中。这将重新启动置换和杂交级联，并增加集落中的拷贝数。

RCA-MDA集落中的拷贝数由引物表面密度决定，其决定了初始串联体或置换的串联体与正向引物和反向引物杂交的频率和成功率。低结合表面上增加的引物密度已证明在这些簇中产生更高的扩增拷贝数(图15)。总之，可以使用以下方法之一或以下方法的组合来增加拷贝数或特异性扩增，并减少低结合表面上的非特异性扩增：(i)可以利用通过制剂改变提高引物模板杂交的效率来增加特异性拷贝数(图16)，(ii)可以通过增加低结合基底上的引物密度来增加特异性拷贝数(图14和图15)，(iii)可以通过使用上述添加剂减少引物二聚体的非特异性扩增或嵌合DNA的产生，(iv)可以采用热稳定酶与先前描述的制剂改变的结合来提高扩增孵育温度，以减少非特异性扩增，(v)包含非自杂交引物序列的引物组合物可以与添加剂和/或提高的扩增孵育温度组合使用以降低非特异性引物二聚体扩增。

实施例4-单链DNA结合(SSB)蛋白质介导的等温扩增

SSB蛋白可以解析核酸链中的二级结构，稳定展开之后的单链DNA，防止或破坏两条核酸链的瞬时非广泛杂交(引物二聚体扩增的前体)，促进短链寡核苷酸特异性杂交至靶寡核苷酸中的正确互补区域，并使酶与单链核酸和双链核酸的分叉连接相互作用并将酶引导至单链核酸和双链核酸的分叉连接处。据报道，SSB中的C端截短突变消除了与ssDNA的协同结合，而其单体表现出与ssDNA更强的结合，并降低了dsDNA的解链温度。例如，与野生型蛋白的性能相比，噬菌体SSB蛋白的C端截短突变，T4 gp32，产生了将dsDNA的解链温度降低数十度的蛋白(gp32ΔC)。

在该扩增方案中，我们在包含截短型SSB蛋白和野生型SSB蛋白(和链置换聚合酶)的制剂中使用这些蛋白质以瞬时熔解双链核酸桥中间体的末端并允许表面引物杂交和引物延伸。尽管SSB会减慢核酸杂交，但众所周知，它通常会促进特异性杂交。因此，使用截短的SSB蛋白，例如T4 gp32ΔC，可以使桥接核酸结构中的3’末端与其他游离的表面栓系的引物更有效地杂交。虽然这也会破坏新形成的引物模板复合物，但优化的制剂应允许通过链置换聚合酶延伸此类复合物。SSB蛋白存在于多种噬菌体(例如T4 gp32)、细菌、古细菌、真菌和真核生物中。有些是热稳定的SSB蛋白，其中C端截短的形式可以在优化的更高温度下实现更有效的核酸末端熔解，从而实现SSB依赖性嗜热扩增，同时在较高温度下利用较低的非特异性扩增。

通过采用诸如上述那些添加剂、引物序列设计和特异性杂交和/或扩增制剂，以及与合适的温度和化学抗性酶和蛋白质一起使用的优化温度，该扩增方法可以被定制为驱动高特异性扩增，同时消除非特异性扩增。

该方案可用于扩增环状DNA以及线性DNA，其中链置换聚合酶的各延伸引发可导致产生环状DNA模板的串联拷贝的多个后续多重置换扩增事件(参见上述修饰的RCA-MDA的部分)。

我们已经发现环状文库DNA的SSB介导的扩增(使用例如phi29SSB)比传统RCA快得多(例如，仅需要30分钟至1小时的扩增时间，而传统RCA需要2-3小时)。在溶液中进行的SSB介导的扩增产物在凝胶上运行为离散的串联阶梯。

实施例5–低结合表面上的低温热循环桥扩增

通过使用用于改进杂交和/或扩增制剂的添加剂、热稳定SSB蛋白和/或截短的SSB蛋白的组合，已开发出可以在比Mullis的原始PCR公开文献中概述的传统方法更低的温度下进行热循环的PCR制剂。在该方案中，可以使用添加剂来驱动低于其传统值的核酸杂交和去杂交温度。例如，通常使用甲酰胺来降低DNA的解链温度(T

图19A-图19B提供了数据的示例，其图示了与常规杂交制剂的那些相比，使用本公开内容的低非特异性结合载体(图19A)和改进的杂交制剂(图19B)可以获得的杂交效率的改进。

图20图示了使用所公开的低结合载体和本公开内容的杂交/扩增反应制剂进行核酸测序的工作流程，以及由此可实现的处理时间的非限制性示例。

实施例6–利用硫醇-马来酰亚胺化学反应制备2层PEG表面

对玻璃载玻片进行化学处理以去除有机物并活化羟基以用于硅烷偶联(各种方法包括等离子体处理、食人鱼蚀刻、碱洗、碱浴、高温玻璃退火及它们的任意组合)。硅烷-PEG5K-硫醇(Creative PEGWorks,Inc)以在乙醇溶液中的0.1％的浓度施加。2小时的涂覆反应后，将玻璃载玻片用乙醇和水彻底清洗，然后与2.5mM马来酰亚胺-PEG-琥珀酰亚胺戊酸酯(MW 20K)在DMF反应中30分钟。洗涤所得表面，并在室温下与5’-胺标记的寡核苷酸引物快速反应2小时。在固定引物后，在pH 9下用100mM甘氨酸使表面上过量的琥珀酰亚胺酯失活。该方法通过高效的引物和比传统方法高出近2个数量级的聚合物迭代偶联赋予可忽略不计的低结合固体载体表面。

实施例7–利用NHS酯-胺化学反应制备多层PEG表面

对玻璃载玻片进行化学处理以去除有机物并活化羟基以用于硅烷偶联(各种方法包括等离子体处理、食人鱼蚀刻、碱洗、碱浴、高温玻璃退火及它们的任意组合。硅烷-PEG-胺(Nanocs,Inc)以在干净的乙醇溶液中的0.1％-2％的浓度施加。2小时的涂覆反应后，将载玻片用乙醇和水彻底清洗。在室温下在溶剂组合物中引入多臂PEG NHS持续5-30分钟，该溶剂组合物可包含5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的有机溶剂和5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的低离子强度缓冲液。清洗所得表面并与多臂PEG胺(MW 10K，Creative PEGWorks,Inc.)反应。然后将所得的胺-PEG表面与不同浓度的多臂PEG NHS和胺标记的寡核苷酸引物的混合物反应。可以重复此过程以在表面上生成额外的PEG层。这种方法通过高效的引物和比传统方法高出近2个数量级的聚合物迭代偶联赋予可忽略不计的低结合固体载体表面。

实施例8–计算簇数据的CNR

通常，当荧光检测用于固相测定时，信号是通过栓系和/或扩增分子、与报告染料分子偶联或附接报告染料分子之后而产生的。该过程产生特异性和非特异性信号。非特异性成分通常被称为非特异性噪声或背景(由间质或细胞内的贡献产生)，它们会干扰特异性信号的测量并降低对比度噪声比(CNR)。

非特异性背景可以由非特异性吸附到载体表面的染料分子产生，或者由例如表面上引物-二聚体配对的非特异性扩增产生。当使用荧光报告基因标记感兴趣的特异性分子时，这两种机制都会产生大量的荧光背景。

所公开的低结合载体表面和相关的使用方法证明在使非特异性背景最小化方面的显著改进。如下文所述的实施例所示，使用指定的扩增方法和载体表面，估计的非特异性背景远低于总信号的10％。另一方面，传统的扩增方法和载体表面通常会产生占总信号30％到50％的背景信号。

注意，如本文所用，非特异性背景或噪声仅是总系统噪声的一个组成部分，其还可包括来自检测系统的其他贡献，例如光子散粒噪声、自发荧光背景、图像传感器噪声、照明噪声(例如，由照明强度的波动产生)等。在这方面，有可能通过新的载体表面和相关的杂交方法和扩增方法来扩展所公开的CNR改进的方法，以通过例如校正可能从传统的合成测序产生的信号杂质(例如通过使用预定相和定相)，并校正因DNA链丢失和/或在多个测定反应循环中因严格洗涤条件或去封闭(可逆终止子去除)引起的DNA损伤招致的误差，来实现对NGS和其他生物测定技术的更大改进。

一般而言，用于测量固相生物测定的CNR的测定包括以下步骤：

(1)制备待用感兴趣的受体、靶和/或捕获寡核苷酸进行官能化的所公开的低结合基底。

(2)捕获受体、靶和/或捕获寡核苷酸，其可以被直接标记或可以进行随后标记反应的前体。如果不需要扩增或额外的探针标记步骤，则进行第5步。如果需要探针标记步骤来产生报告基因，则进行第4步。否则，进行第3步。

(3)通过传统的免疫测定信号扩增、寡核苷酸复制扩增(例如，使用桥、等温、RCA、HDA或RCA-MDA扩增策略)进行受体、靶和/或捕获寡核苷酸的扩增。

(4)用报告基因标记(例如，通过使用荧光物质或其他类型的报告基因)探测扩增的靶标。该步骤适用于任何基于表面的生物测定，包括但不限于基因分型、核酸测序或基于表面的靶/受体鉴定。

(5)进行适当的检测方法。对于荧光成像，可以以多种方式设置检测方法。例如，传统的光学显微镜方法将包括以下组件的全部或子集：照明或激发光源、物镜、样品、其他光学组件(例如管透镜、滤光器、二向色反射器等)，以及检测方式(例如，使用EMCCD相机、CCD相机、sCMOS、CMOS、PMT、APD或其他用于测量光强级的传统方法)。对于非基于光的检测，可以使用各种方式测量电信号，所述方式包括但不限于场效应晶体管(FET)检测、基于电极的电信号测量(直流或交流)、隧道电流、磁信号的测量等。

使用来自指定视场(FOV)的成像和信号处理来计算CNR在图8中示出，如图所示，其中CNR＝(信号-背景)/(噪声)，其中背景＝(B

对于计算本公开内容的低结合载体上的核酸序列的克隆扩增簇的CNR的以下示例，使用图像分析程序来寻找代表性前景亮点(“簇”)。通常，点被定义为图像像素的小连接区域，其表现出高于特定强度阈值的光强度。只有包含落在指定范围内的总像素数的连接区域才能计数为点或簇。就像素数而言太大或太小的区域将被忽略。

一旦识别出多个点或簇，就计算平均点或前景强度和其他信号统计数据，例如，可以计算最大强度、平均强度和/或内插的(interpolated)最大强度。所有点强度的中值或平均值用于表示点前景强度。

背景区域强度的代表性估计值可以使用几种不同方法中的一种来确定。一种方法是将图像分成多个小“图块”，每个小“图块”包括例如25×25像素。在每个平铺区域内，丢弃一定百分比(例如25％)的最亮像素，并计算剩余像素的强度统计数据。确定背景强度的另一种方法是选择一个至少500像素或更大的区域，该区域没有任何前景“点”(如上一步中所定义)，然后计算强度统计数据。对于这些方法中的任何一种，然后计算具有代表性的背景强度(中值或平均值)和标准偏差。所选区域中强度的标准偏差用作代表性背景变化。

然后将对比度噪声比(CNR)计算为(前景强度-背景强度)/(背景标准偏差)。

图21–图23提供了原始图像数据和强度数据直方图的示例，用于计算核酸扩增方法和本文所述的低结合载体的不同组合的CNR。在这些示例中的每一个中，上部直方图是背景像素强度直方图，下部直方图是前景点强度直方图，并且还包括原始图像的一部分。请注意，图像的强度等级不同，因此视觉亮度感知并不表示实际强度。

对于这些示例，使用先前讨论的方法形成低结合固体载体。使用所公开的方法以不同的密度接枝寡核苷酸引物(一个或两个引物序列，取决于所使用的扩增方案)。这些实验中的每一个的表面密度估计为大约100K个引物/μm

然后将DNA文库序列与栓系的引物杂交。用于文库杂交步骤的杂交方案可以因表面特性而异，但需要受控的文库输入来形成可解析的DNA扩增集落。

本实施例使用以下方案进行DNA扩增：(i)在28个循环下采用约1K个引物/um

扩增后，扩增的DNA与互补的“测序”引物杂交，并加入包含Cy3标记的dNTP的测序反应混合物(“第一碱基”测定)以确定每种相应方法的第一碱基CNR。用于“第一碱基测定”的测序反应混合物可以包括标记核苷酸(从而可以区分4个碱基)、掺入修饰的三磷酸核苷酸(dNTP)的酶、以及相关掺入缓冲液、金属阳离子和辅助因子等的任意组合。

在第一碱基掺入之后，将测序反应混合物更换为缓冲液，使用相同的GE Typhoon仪器进行成像，并在所得图像上计算CNR。

图21提供了本公开内容的低结合载体的荧光图像和强度数据的示例，在该载体上使用桥扩增在28个循环下以大约2K个引物/um

图22提供了本公开内容的低结合载体的荧光图像和强度数据的第二示例，在该载体上使用桥扩增在28个循环下以>5K个引物/um

图23提供了本公开内容的低结合载体的荧光图像和强度数据的示例，在该载体上使用滚环扩增(RCA)以大约100K个引物/um

实施例9–聚合物载体表面的修饰

为了本文公开的目的而对表面进行修饰涉及使表面对许多化学基团(-R)包括胺具有反应性。当在合适的基底上制备时，这些反应性表面可以在室温下长期保存例如至少3个月或更长时间。如本文其他地方所述，此类表面可以进一步用R-PEG和R-引物低聚物接枝以用于核酸的表面扩增。可以使用本领域已知的许多方法中的任何一种来修饰塑料表面，例如环烯烃聚合物(COP)。例如，可以使用Ti：蓝宝石激光烧蚀、UV介导的甲基丙烯酸乙二醇酯光接枝、等离子处理或机械搅拌(例如喷砂或抛光等)处理它们，以产生可对许多化学基团例如胺基保持数月之久的活性的亲水性表面。然后，这些基团可以使钝化聚合物(例如PEG)或生物分子(例如DNA或蛋白质)结合，而不会损失生化活性。例如，DNA引物低聚物的连接允许在钝化的塑料表面上扩增DNA，同时最小化蛋白质、荧光团分子或其他疏水性分子的非特异性吸附。

另外，可以将表面修饰与例如激光印刷或UV掩膜结合以产生图案化的表面。这允许DNA低聚物、蛋白质或其他部分的图案化附接，从而提供基于表面的酶活性、结合、检测或加工。例如，DNA低聚物可仅用于在图案化特征内扩增DNA，或以图案化方式捕获扩增的长DNA串联体。在一些实施方式中，可以在能够与基于溶液的基底反应的图案化区域中产生酶岛。因为塑料表面特别适合于这些加工模式，所以在本文考虑的一些实施方式中，塑料表面可以被认为是特别有利的。

此外，与玻璃基底相比，塑料可以更容易地被注塑、压花或3D打印以形成包括微流体装置在内的任何形状，并且因此可以用来生成用于结合和分析在多种配置(例如，用于生物标记检测或DNA测序的样品-结果微流体芯片)中的生物样品的表面。

可以在修饰的塑料表面上制备特定的局部DNA扩增，当用荧光标记物探测时，可以产生具有超高的对比度噪声比和非常低的背景的点。

我们已经用胺-引物和胺-PEG接枝了代表性的亲水性和胺反应性环烯烃聚合物表面，并发现它支持滚环扩增。然后我们发现，当用荧光团标记的引物探测时，或通过聚合酶将标记的dNTP添加到杂交引物中时，观察到DNA扩增子的亮点，其信噪比大于100，背景极低，表明了高度特异性扩增，以及超低水平的蛋白质和疏水性荧光团结合，这些都是高精度检测系统(如基于荧光的DNA测序仪)的标志。

在此测试塑料流动池，其填充有栓系的DNA簇并探测文库序列的第一碱基。如之前在实施例1和7以及本文其他地方所述，对于带有DNA的表面群体，亲水性的环烯烃聚合物(COP)塑料表面接枝有25聚体胺-引物1、胺-引物2，对于PEG-NHS涂覆的玻璃表面，接枝有胺-5K PEG。5pM的环状DNA文库随后与表面杂交15分钟，除了文库插入片段外，环状DNA文库还包含引物2序列、测序引物序列和与引物1互补的序列。然后如实施例2-5和本文其他地方所述进行滚环扩增(RCA)，以形成长度至多为0.5-1Mb的串联序列DNA卷。将测序引物杂交，并使用荧光团标记的dNTP组用聚合酶掺入第1碱基，使得如图25A所示用3种不同颜色标记簇。

进行使用相同参数的平行实验，从玻璃而不是COP表面(具有如实施例7中所述的表面制备)开始，以提供钝化玻璃表面和钝化COP表面之间的比较。如图25A-图25B所示，在观察点的强度和分辨率方面，通过在COP表面上掺入第一荧光标记碱基产生的信号与在类似处理的玻璃表面上获得的信号相当。这表明本文公开的方法提供了制备用于固定、扩增和检测核酸的表面的通用方法。

强度和CNR是针对玻璃和塑料两者确定的。在图26A中可以看到，玻璃和塑料在检测条件下都表现出明显高于背景的信号强度。对于玻璃和塑料，信号强度在左侧，背景描绘在右侧。在图26B中可以看到，在检测条件下，玻璃和塑料的CNR均高于50。

实施例10–表面制备

如下制备对有机染料和蛋白质表现出可忽略不计的非特异性结合、表现出高达至少95℃的稳定性、对高pH(0.1M NaOH)、低pH(>5.0)；有机溶剂(甲醇、乙醇、乙腈、甲酰胺、氧化剂、膦)的化学稳定性、长期储存稳定性、低输入库要求和可调的引物加载的表面。该方法包括清洁表面和使表面硅烷化或钝化。

使用2M KOH溶液与alconox/hellmanex去污剂组合洗涤表面并使用乙醇冲洗。然后将表面加热到560℃以暴露OH基团。表面交替地或组合地经受等离子体处理。

使用5mg/mL硅烷-5kPEG-NHS(99.9％乙醇/0.01％乙酸)将表面硅烷化并加热至65℃，并使用KOH/去污剂/热清洁的表面进行测试。交替或组合使用10mg/mL硅烷-5kPEG-NHS(90％DMF/10％100mM MES PH5.5)将表面硅烷化并加热至25℃，并使用KOH/去污剂/热清洁的表面或等离子体处理过的表面进行测试。

许多染料与这些表面相容，所述染料例如Cy3-C、R11-U、Cy3.5C、647N-A、Cy5-G、660-U、Cy5.5-C(注意：仅在200nm下的染料)。示例性染料混合物包含Cy3-A、Cy3.5-C、Cy5-U、AHO690-G。

此类表面以低浓度(5.0×10

浓度任选地如下测量。制备不同浓度的Cy3-dCTP溶液，使用GE Typhoon(GEHealthcare Lifesciences，Pittsburgh，PA)或合适的仪器在固定尺寸(0.5mm×5mm或其他面积)的毛细管中测量FL强度。当面积已知且分子数已知时，这会产生引物加载。

已经使用这种方法来测量80,000；160,000；320,000；640,000；1,300,000；2,600,000；和5,100,000个引物/um

观察到表面在储存一周后稳定性没有显著降低。

测量了许多表面变体的密度，结果如下所示。PEG胺-APTES上的3层多臂PEG(8,16,8)，暴露于7uM引物预加载的两个层，在表面上表现出2,000,000至10,000,000的浓度。使用星形PEG-胺代替哑铃形16聚体和64聚体在暴露于8uM引物的PEG胺-APTES上的3层多臂PEG(8,16,8)和(8,64,8)和3层多臂PEG(8,8,8)观察到类似浓度。

使用这些方法，观察到增加的引物密度产生更高的前景强度、更高的集落密度和更高的CNR。例如，10pM输入在引物密度<1.0×10

实施例11–高CNR表面产生高质量数据。

测试现有技术表面以及低CNR表面和高CNR表面(例如本文公开的那些)在对应于第一染料和第二染料的第一通道和第二通道处检测到的它们的荧光。

可以观察到，随着CNR的增加，可以看到单个检测事件的更清晰的分辨率。这些检测事件沿着与染料发射光谱相对应的不同轴对齐，而不是与如图27的顶部三个文件中所见的更高误差“云”对齐。转向图27底部的三个文件，这种更准确的数据收集自身表现为特定预期波长处的更窄、更高的峰，中间位置的数据点更少。这个更清晰分辨的数据集转化为在高CNR表面上进行的检测所产生的更准确的基于荧光的碱基识别。

实施例12–克隆扩增的多聚靶寡核苷酸分子

图28提供了与包含高表面密度的寡核苷酸衔接子或引物分子(例如4,000或更多个分子/um

实施例13–输入核酸需求减少

图29提供了在本公开内容的低结合载体表面上进行传统杂交反应和在本公开内容的低结合载体表面上进行优化杂交反应的实验结果的比较。传统的杂交方法使用SSC缓冲液并加热至95度，然后缓慢冷却2小时。将寡核苷酸引物附接至低结合载体表面后，靶核酸与寡核苷酸引物的有效杂交可能会受到低结合表面上减少的碰撞频率的影响。至少部分地由于减少现有技术表面上捕获寡核苷酸的偶联，用于将靶DNA添加到表面结合的引物的传统杂交方法需要高达10nM的输入DNA浓度(参见图29，左侧，显示标记的靶寡核苷酸与结合载体表面的结合)。即使在这些高浓度下，靶寡核苷酸的偶联也是有限的。相比之下，使用各自相同浓度的非互补寡核苷酸作为阴性对照(图29底行)。相比之下，使用已开发的新的杂交反应条件，包括包含PEG、与水相比具有降低的极性的溶剂(例如乙醇、甲醇、异丙醇、乙腈、丁醇等)、甲酰胺和低pH缓冲液(<7)的混合物，靶核酸序列在低至50pM的靶核酸的输入浓度下与表面附接的寡核苷酸杂交。靶核酸输入浓度的下降表明杂交效率增加了大约200倍(参见图29，右侧，显示标记的靶寡核苷酸与公开的低结合表面的结合)，这为公开的低结合载体表面提供了用于输入文库DNA可能稀缺的测序技术中的显著优势。有效的引物偶联方法和杂交条件可以允许制备具有低非特异性结合和高表面密度的寡核苷酸引物的表面，这是使用本领域所述的传统引物偶联化学反应或杂交条件将无法实现的。相比之下，各自浓度相同的非互补寡核苷酸用作阴性对照(图29底行，右侧)。每个图像的可检测标签是花青染料3(Cy3)，其中表面的荧光图像是通过20x、0.75NA、532nm光源、针对532nm长通激发和Cy3荧光发射滤光片进行了优化的带通和二向色镜滤光片组、Semrock 532nm二向色反射镜以及相机(例如，Andor sCMOS，Zyla4.2)获得。

用杂交报告基因探针(在5’端用Cy

实施例14–低结合载体表面上传统寡核苷酸偶联化学反应、杂交反应条件和扩增技术的比较

图30-图32提供了使用图29描述中概述的方法在本公开内容的低结合载体上进行传统杂交反应或改进的杂交反应的实验结果的比较，其中使用常规偶联化学反应附接寡核苷酸引物，对于NHS–NH2偶联反应通常在pH＝8.3的碳酸氢钠缓冲液中进行，或用改进的偶联化学反应附接寡核苷酸引物，这需要通过添加pH>8.0的缓冲成分来改变偶联缓冲液(有机溶剂)的极性，以及在杂交反应之后进行RCA扩增或桥扩增。通过基于PCR的扩增(“桥”)或滚环扩增，在寡核苷酸引物表面密度小于不同表面密度阈值的低结合载体上扩增靶DNA产生延伸或扩散的靶分子，这产生两个挑战：1)减少的堆积密度，和2)减少的信号。因此，基于这种表面的按比例调整用于高通量测序应用的系统受到严重损害。图30显示了使用传统寡核苷酸偶联化学反应在低结合表面上的PCR扩增(“桥”；右)和滚环扩增(左)的结果，使得寡核苷酸密度<1000个寡核苷酸/um

实施例15–低结合载体表面上扩增反应的比较

图33提供了传统载体表面和本公开内容的靶寡核苷酸已与其杂交和扩增的低结合载体表面的荧光图像的非限制性示例。为了提高测序的准确性，每个扩增的靶核酸必须与载体表面图像中的其他靶核酸清楚地分开。在测序循环期间，每个靶核酸还必须呈现与序列中每个核苷酸的识别(该过程称为“碱基识别”)相关的信号(例如荧光信号)。在许多情况下只是由附接在靶核酸分子上的标记提供的荧光强度的这种碱基识别信号，必须能够清晰准确地分辨出噪声(一个点或靶标内的信号变化)和背景(由于形成实验环境的材料的特性而非特异性产生的伪信号)。对比度和噪声之间的比率(“CNR”)定义了准确确定靶核酸序列中每个位置存在哪个碱基的能力，以及测序系统的读长、再现性和通量。当前公开的低结合载体表面提供减少的非特异性蛋白质和染料结合，从而产生更低的背景信号和更紧凑、更亮的前景信号，从而产生增强的CNR并有助于测序应用中优异的碱基识别结果。图32显示了通常根据常规方法制备的与根据克隆扩增的靶DNA的结合需要进行调整的PEG涂覆的表面(顶部，“传统”)；和本公开内容的低结合载体表面(顶部，“目前的元件”)之间的比较。从图像中可以清楚地看出，目前公开的表面显示出比常规表面更尖锐、更密集的用于测量克隆扩增DNA的点。点强度(由克隆扩增的靶DNA产生的荧光，相当于测序信号)和背景强度两者的定量测量表明，即使在理想的成像条件下，例如使用改进的杂交条件来结合靶DNA时(底部，“传统改进”)，所公开的低结合载体表面(底部，“目前最佳元件”)的CNR远远超过了使用传统表面可实现的CNR(底部，“传统”)。CNR的这种增加大于使用常规载体表面可以合理预期的增加，并且代表了相比现有技术表面的定性和定量这两者的改进。这些改进是通过产生满足一些标准的载体表面来实现的，例如减少的非特异性蛋白质和染料结合、正确密度的寡核苷酸与表面的附接，以及克隆扩增的靶核酸与表面的杂交/结合以产生具有非常高CNR的图像，这可在测序应用中增强碱基识别。

实施例16–使用其他聚合物制备低结合载体的预示性示例

对玻璃载玻片进行物理或化学处理(例如，使用等离子体处理、食人鱼清洁步骤、酸洗、碱洗、高温玻璃退火或它们的任意任意组合)以去除有机污染物并活化用于硅烷偶联的表面羟基。然后将制备的玻璃表面与硅烷反应以共价连接官能团(例如伯胺)的第一层和/或亲水性聚合物层。在一些情况下，例如，使用标准方案使硅烷，例如(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷(APTMS)或(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)3(3-丙烯丙基)三甲氧基硅烷，与表面反应以将伯胺官能团共价连接至表面。在其他情况下，硅烷改性的聚合物，例如在一端包含甲硅烷基而在另一端包含第二官能团(例如伯胺基、羧基等)的亲水性异双官能聚合物可以直接与表面反应(例如，通过将干净的玻璃表面与乙醇中0.1％-2％的浓度的硅烷改性聚合物接触约1-2小时，然后用乙醇和水冲洗)。合适的硅烷改性聚合物的实例包括但不限于硅烷-PEG-NH

在一些情况下，在表面与硅烷或硅烷改性聚合物的初始反应之后，亲水性聚合物层的至少一个附加层偶联至玻璃表面或沉积在玻璃表面上。可以使用本领域技术人员已知的多种亲水性聚合物中的任何一种，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚丙烯酰胺、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMA)、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(PHEMA)、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)、聚谷氨酸(PGA)、聚赖氨酸、聚葡糖苷、链霉亲和素、右旋糖酐或它们的任意组合，其中在共价偶联的情况下，选择包含适当单官能、同双官能和/或异双官能的反应性基团的聚合物以与所选的偶联化学相容。在一些情况下，使用衍生的聚合物，例如PEG-胺、PEG-NHS或PEG-丙烯酸酯。在一些情况下，使用双官能PEG衍生物，例如丙烯酸酯-PEG-NHS。在一些情况下，这些附加的亲水性聚合物层可以通过使表面与乙醇或乙醇/水性缓冲溶液中的0.1％-2％的聚合物在室温下接触约5分钟至约1小时而偶联至前一层或沉积在前一层上，然后用乙醇或乙醇/水性缓冲液冲洗。

在一些情况下，亲水性聚合物的第二、第三、第四、第五或更多个附加层可以偶联至载体表面的初始层或沉积在载体表面的初始层上。在一些情况下，层内的聚合物分子可以使用合适的同官能或异官能交联剂彼此交联。在一些情况下，不同层中的聚合物分子可以相互交联。在一些情况下，亲水性聚合物层中的一个或多个可包含支化聚合物，例如支化PEG、支化聚乙烯醇(支化PVA)、支化聚(乙烯基吡啶)、支化聚(乙烯基吡咯烷酮)(支化PVP)、支化聚(丙烯酸)(支化PAA)、支化聚丙烯酰胺、支化聚(N-异丙基丙烯酰胺)(支化PNIPAM)、支化聚(甲基丙烯酸甲酯)(支化PMA)、支化聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)(支化PHEMA)、支化聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(支化POEGMA)、支化聚谷氨酸(支化PGA)、支化聚赖氨酸、支化聚葡糖苷、支化右旋糖酐或它们的任意组合。

一个或多个亲水性聚合物层可以包含多个共价连接的寡核苷酸衔接子或引物分子，其中使用本领域技术人员已知的多种合适的缀合化学物质中的任一种将寡核苷酸分子共价偶联到聚合物上。在一些情况下，寡核苷酸衔接子或引物分子在溶液中与聚合物共价偶联，即在聚合物偶联至表面或沉积在表面上之前。在一些情况下，寡核苷酸衔接子或引物分子在聚合物已偶联至表面或沉积在表面上之后与聚合物共价偶联。在一些情况下，至少一个亲水性聚合物层包含多个共价连接的寡核苷酸衔接子或引物分子。在一些情况下，至少两层、至少三层、至少四层或至少五层的亲水性聚合物包含多个共价连接的衔接子或引物分子。

所用聚合物的选择、层数、层内和层之间的交联度、包含共价连接的寡核苷酸衔接子或引物分子的层数，以及寡核苷酸衔接子或引物分子的局部浓度或表面密度可以单独或共同调整以“调节”表面的特性，以实现所期望的表面润湿性(例如，通过小于50度的水接触角指示)、长期暴露于测序/基因分型试剂和重复热循环(这通常需要在至少95℃的峰值温度下并保持至少5分钟的温度斜坡并循环多次，至少30个循环)所期望的表面稳定性、以及所期望的寡核苷酸衔接子或引物分子的表面密度(例如，至少1,000个衔接子或引物分子/μm

实施例17-丙烯酸酯偶联的表面

将等离子处理、KOH处理或等离子/KOH处理的玻璃表面或硅晶片，或等离子处理的COP表面用(3-丙烯丙基)三甲氧基硅烷处理，然后与具有从1K到6K变化的平均PEG分子量的双官能丙烯酸酯-PEG-NHS孵育，尤其包括PEG-3.4K。预期500-10K的分子量，限制条件是PEG必须在42℃下溶于水，在37℃下溶于水，在室温下溶于水，在42℃下呈液态，在37℃下呈液态，或在室温下呈液态。PEG掺入任选地通过添加至多0.5％(w/w)2-羟基-2-甲基苯丙酮，然后进行紫外线处理(3.0mW/cm2下10分钟)来辅助。丙烯酸酯-PEG-NHS的使用浓度为3mM和6mM，使用6mM的丙烯酸酯-PEG-NHS可获得优异的结果。洗涤去除未结合的聚合物后，将表面在室温下孵育足够长的时间以允许NHS基团自溶，使游离的末端羧酸根基团保留在结合的PEG分子上。然后通过用EDAC-HCl处理而活化这些表面，并添加5’-氨基寡核苷酸以产生寡核苷酸缀合表面。SP6寡核苷酸(25NT)和SP5P寡核苷酸(带有3’磷酸帽的25NT)的组合以1:1的比例、或1:2、1:5或1:10的比例添加(SP6寡核苷酸是用于表面生长的滚环扩增的引物，而SP5P有助于防止随机引发事件或RCA扩增产物的非特异性缩合/结合)。用在pH 9的MES中的90％EtOH洗涤以去除未结合的寡核苷酸后，添加包含ACES/KCl/EDTA/Tween20的储存缓冲液。在这种缓冲条件下，表面可以至少存放至少7天。

然后将包含附接的引物的表面用于靶核酸的表面上滚环扩增，产生如本文别处所示的缩合核酸分子。预先制备的RCA产物也与表面结合，产生类似的紧凑核酸结构。

尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方式仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实践本发明时，可以以任意组合采用本文所述的本发明的实施方式的各种替代方案。以下权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同项。