VSV嵌合载体

本发明涉及VSV嵌合载体，其特征在于所述载体包含编码Dandenong病毒(DANDV)或Mopeia病毒(MOPV)的糖蛋白GP的基因且缺乏编码VSV的包膜蛋白G的功能基因。本发明还提供了VSV嵌合载体系统。此外，本发明涉及本发明的VSV嵌合载体和系统的用途，包括在医学中的用途，如在实体肿瘤治疗中的用途。

现有技术的描述

在过去的几十年中，已经对病毒在癌症治疗中的使用进行了深入研究。溶瘤病毒(OV)被认为是癌症治疗中的重要物质。溶瘤病毒提供了肿瘤特异性细胞裂解和免疫刺激的有吸引力的治疗组合。此外，OV可以进行基因修饰以优化肿瘤选择性和增强免疫刺激，并且可以容易地与其他药剂(如检查点抑制性抗体分子和其他免疫治疗剂)组合使用。OV的有效性已在许多临床前研究中以及最近在人体中得到了证明，美国食品药品监督管理局批准了溶瘤疱疹病毒talimogene laherparepvec[1，2]。

迄今为止，正在对各种具有不同特性的病毒进行临床前和临床研究。溶瘤病毒的大小和复杂程度从大型双链DNA病毒(如牛痘病毒(190kb)[3]和1型单纯疱疹病毒(152kb)[4])到小型单链RNA病毒(如水疱性口炎病毒)(VSV)[5,6]，麻疹病毒(MV)[7]或新城疫病毒(NDV)[8]，其基因组大小在11至16kb之间。但是，每个溶瘤病毒平台都有其优点和缺点。显然，一种有前景的溶瘤方法是将不同的病毒与自然允许其复制的肿瘤类型相匹配。另一方面，某些平台具有广泛的天然受体向性，例如基于牛痘和水疱性口炎病毒的载体，可用于许多不同类型的癌症。

基于VSV的载体平台被认为是非常有前途的病毒疗法，这不仅是由于其广泛的受体向性，而且还因为其在允许的细胞中巨大的复制能力以及诱导强烈的CPE的能力，从而引起局部炎症，在被感染的肿瘤内产生免疫反应。然而，在溶瘤病毒疗法中使用野生型VSV有几个缺点。首先，野生型VSV染色被认为具有神经毒性。如果病毒意外穿过血脑屏障并在受治疗个体的大脑内扩散，则野生型VSV可能引起导致死亡的严重脑炎。其次，VSV感染的个体能够以主要针对核蛋白和糖蛋白的高抗体滴度快速引发强烈的体液反应。除了对位于核蛋白内的表位特异的CD8+细胞产生强烈的CTL反应外，与VSV的包膜糖蛋白G结合的中和抗体也被认为对控制VSV感染是重要的。靶向VSV的糖蛋白G的中和抗体能够限制病毒传播，并且它们能够介导保护个体免受VSV再感染。然而，载体中和限制了溶瘤剂向癌症患者的重复应用。

为了消除VSV野生型的这些缺点，在WO 2010/040526中描述了名为VSV-GP的重组VSV载体。在VSV-GP中，被认为是神经毒性和载体中和的主要决定因素的内源性糖蛋白VSV-G的编码区被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)株WE-HPI的包膜糖蛋白GP替代。用LCMV-GP(WE HPI)替代VSV病毒包膜蛋白G所提供的优势为(i)VSV-G介导的神经毒性的丧失[9]和(ii)仅在小鼠模型中缺乏抗体的载体中和[10,11]。然而，仍然需要中和抗体诱导降低的并因此用于治疗中的适合性提高的载体。

因此，本发明要解决的技术问题是提供改进的VSV嵌合载体以及相应的用途和方法。通过本文提供的和要求保护的实施方案解决了该技术问题。

发明概述

本发明提供了VSV嵌合载体，其特征在于所述载体包含编码Dandenong病毒(DANDV)或Mopeia病毒(MOPV)的糖蛋白GP或其功能片段或变体的基因且缺乏编码VSV的包膜蛋白G的功能基因。在本发明的范围内优选VSV的包膜蛋白G被DANDV或MOPV的GP或其功能片段或变体替代。在本发明的替换实施方案中，提供了VSV嵌合载体，其特征在于载体包含编码Ippy病毒(IPPYV)、Latino病毒(LATV)或Olivero病毒(OLIVV)的糖蛋白或其功能片段或变体的基因且缺乏编码VSV的包膜蛋白G的功能基因。

在本领域改进基于VSV的OV的尝试中，发明人令人惊讶地发现了VSV载体中的DANDV或MOPV的表面蛋白GP导致了不显示出中和抗体滴度或仅显示出低的中和抗体滴度并在肿瘤细胞中维持基于VSV载体的复制能力的嵌合载体。此外，VSV-GP载体的向性和神经毒性的缺乏得到了保留。

发明人因此令人惊讶地发现了沙粒病毒(特别是DANDV和MOPV)的包膜蛋白GP用于VSV的框架中时生成了在小鼠中颅内应用后没有显示出神经毒性的重组载体。同时，嵌合VSV载体令人惊讶地维持了现有技术的VSV载体的细胞向性。与具有LCMV的GP的VSV相比，由于病毒诱导的细胞病变作用(CPE)，可以显示出对选定的人肿瘤细胞系提高的杀灭，这使发明人感到非常惊讶。在体内已经证实了这种效果，特别是与VSV-LCMV-GP相比，VSV-G(x)-DANDV和VSV-G(x)-MOPV在人肺癌异种移植模型中的功效出乎意料地得到了提高。此外，在静脉内免疫后，VSV-G(x)-DANDV和VSV-G(x)-MOPV在兔模型中显示出明显延迟的载体中和抗体的诱导。

因此，在一个实施方案中，本发明涉及VSV嵌合载体，其特征在于所述载体包含编码Dandenong病毒(DANDV)或Mopeia病毒(MOPV)的糖蛋白GP的基因且缺乏编码VSV的包膜蛋白G的功能基因，其中在相同条件下与用LCMV的GP假型化的VSV载体相比，所述载体显示出降低的中和抗体诱导。在本发明的再一个实施方案中，所述载体包含编码Ippy、Olivero或Latino病毒的糖蛋白GP的基因。“中和抗体”是结合抗原并由此防止由抗原给予的生物效应的抗体。许多宿主外源的抗原诱导了宿主的免疫系统的反应，包括中和抗体的产生。然而，本发明的VSV嵌合载体优于已知的嵌合VSV载体得到了改进，因为它们仅导致降低的中和抗体诱导，并且因此可以对靶向的宿主细胞显示出提高的生物效应。本领域技术人员周知怎样确定是否诱导了中和抗体以及诱导程度的方式和方法。因此，本领域技术人员可以容易地确定本发明的VSV嵌合抗体是否诱导了中和抗体以及与使用LCMV的GP假型化的VSV嵌合载体相比是否降低了诱导。这样的测定可以提供定量或定性结果。例如，测定可以提供中和抗体诱导能力的绝对测量，随后可以将其与使用LCMV的GP假型化的VSV嵌合载体的预定数量进行比较。另外地或替换地，测定可以定量提供诱导中和抗体的相对能力。本发明内可以使用的示例性测定提供于实施例5中。如图9中所示，结果令人惊讶地和出乎预料地显示了本发明的载体显示出显著降低的中和抗体诱导。因此，示例性测定可以包括在测定加入来自免疫后不同时间点的血清样品中的中和抗体的存在中使用p-硝基-磷酸苯酯(pNPP)。在不存在nAb的情况下，携带替代表面蛋白的分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)基因的GP假型化病毒(分别为LCMV-GP、DANDV-GP或MOPV-GP)能够感染BHK21Cl.13细胞，从而导致SEAP的表达。相反，如果病毒被血清中的抗体中和，则该病毒不能感染细胞，且因此不会表达SEAP。因此，可以将nAb活性确定为SEAP活性的函数。通过非线性曲线拟合，可以计算EC50值。

在本发明的一个实施方案中，提高的生物效应可以是与相同条件下的用LCMV的GP假型化的VSV载体相比提高的肿瘤细胞杀灭。因此，在一个实施方案中，本发明涉及VSV嵌合载体，其特征在于所述载体包含编码Dandenong病毒(DANDV)或Mopeia病毒(MOPV)的糖蛋白GP的基因且缺乏编码VSV的包膜蛋白G的功能基因，其中所述载体在相同条件下与用LCMV的GP假型化的VSV载体相比显示出提高的肿瘤细胞杀灭。本领域技术人员周知怎样确定肿瘤细胞是否被杀灭以及杀灭程度的方式和方法。因此，本领域技术人员可以容易地确定本发明的VSV嵌合载体是否杀灭肿瘤细胞以及与表达LCMV的GP的VSV嵌合载体相比所述杀灭是否得到了提高。此类测定可以提供定性或定量的结果。例如，测定可以提供肿瘤细胞杀灭能力的绝对测量，随后可以将其与表达LCMV的GP的VSV嵌合载体的预定数量进行比较。另外地或替换地，测定可以定量地提供杀灭肿瘤细胞的相对能力。示例性测定提供于实施例4中。这样的测定可以包括用IFN预先孵育待感染的细胞并随后用本发明的VSV嵌合载体和/或LCMV的VSV-GP感染。孵育后，例如，三天，可以根据制造商的推荐，使用基于MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)的体外细胞毒性测定来分析细胞的生活力。随后可以在550nm下在常规微平板阅读器中测量样品。可以将值标准化至未用干扰素(IFN)预处理的模拟感染细胞，并以存活细胞的百分比来表示。

Dandenong病毒(DANDV)是一种旧世界沙粒病毒[12]。迄今为止，只有一株本领域技术人员已知的菌株，其包含糖蛋白GP，并且可以在本发明中用作本发明的VSV嵌合载体中包含的GP的供体。本发明的VSV嵌合载体中包含的DANDV GP具有超过6个糖基化位点，特别是7个糖基化位点。示例性的优选GP是可以以Genbank编号EU136038访问的包含在DANDV中的。因此，在一个实施方案中，编码DANDV的GP的基因具有如SEQ ID NO:1所示的核酸序列或与SEQ ID NO:1的核酸序列具有至少80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列，同时保持包含由SEQ ID NO:1所示的核酸序列编码的GP的嵌合VSV载体的功能特性。

Mopeia病毒(MOPV)是一种旧世界沙粒病毒[13]。存在几种本领域技术人员已知的菌株，其包含糖蛋白GP，并且可以在本发明中用作本发明的VSV嵌合载体中包含的GP的供体。本发明的VSV嵌合载体中包含的MOPV GP具有超过6个糖基化位点，特别是7个糖基化位点。示例性的优选GP是可以以Genbank编号AY772170访问的包含在Mopeia病毒中的。因此，在一个实施方案中，编码MOPV的GP的基因具有如SEQ ID NO:3所示的核酸序列或与SEQ IDNO:3的核酸序列具有至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列，同时保持包含由SEQ ID NO:3所示的核酸序列编码的GP的嵌合VSV载体的功能特性。

Ippy病毒(IPPYV)是一种首先从野外捕捉到的啮齿动物分离的旧世界沙粒病毒[14]。存在几种本领域技术人员已知的菌株，其包含糖蛋白GP，并且可以在本发明中用作本发明的VSV嵌合载体中包含的GP的供体。本发明的VSV嵌合载体中包含的IPPYV GP具有超过6个糖基化位点，优选超过8个糖基化位点，特别是10个糖基化位点。示例性的优选GP是可以以Genbank编号DQ32887访问的包含在IPPYV中的。因此，在一个实施方案中，编码Ippy病毒的GP的基因具有如SEQ ID NO:5所示的核酸序列或与SEQ ID NO:5的核酸序列具有至少60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列，同时保持包含由SEQ IDNO:5所示的核酸序列编码的GP的嵌合VSV载体的功能特性。

Latino病毒(LATV)是一种首先从成年怀孕雌性胼胝暮鼠(Calomys callosus)分离的新世界沙粒病毒[15]。存在几种本领域技术人员已知的菌株，其包含糖蛋白GP，并且可以在本发明中用作本发明的VSV嵌合载体中包含的GP的供体。本发明的VSV嵌合载体中包含的LATV GP具有超过6个糖基化位点，优选超过8个糖基化位点，特别是10个糖基化位点。示例性的优选GP是可以以Genbank编号AF485259访问的包含在LATV中的。因此，在一个实施方案中，编码LATV的GP的基因具有如SEQ ID NO:7所示的核酸序列或与SEQ ID NO:7的核酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列，同时保持包含由SEQ ID NO:7所示的核酸序列编码的GP的嵌合VSV载体的功能特性。

Olivero病毒(OLIVV)是一种首先从啮齿动物暗色雷鼠(Bolomys obscures)分离的新世界沙粒病毒[16]。存在几种本领域技术人员已知的菌株，其包含糖蛋白GP，并且可以在本发明中用作本发明的VSV嵌合载体中包含的GP的供体。本发明的VSV嵌合载体中包含的OLIVV GP具有超过6个糖基化位点，优选超过8个糖基化位点，特别是9个糖基化位点。示例性的优选GP是可以以Genbank编号U34248访问的包含在OLIVV中的。因此，在一个实施方案中，编码OLIVV的GP的基因具有如SEQ ID NO:9所示的核酸序列或与SEQ ID NO:9的核酸序列具有至少50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％序列同一性的序列，同时保持包含由SEQ ID NO:9所示的核酸序列编码的GP的嵌合VSV载体的功能特性。

鉴于以上所述的以及所附实施例中所示的本发明的VSV嵌合载体令人惊讶且出乎预料的技术优势，在本发明的范围内提供本发明的载体用于医学用途并且因此提供特异设计以适于此类用途的载体。因此，在本发明的一个实施方案中，提供了本发明的包含至少一种转基因的载体。“转基因”是包含已经从一个生物体分离并引入不同生物体中的基因序列的DNA区段。在本发明内，本发明的载体中包含的一个或多个转基因可以是任何来源的并且对靶向的细胞具有任何生物效应。

在再一个实施方案中，本发明涉及VSV嵌合载体系统，其特征在于所述系统包含至少两个互补复制VSV载体，其中所述系统包含编码VSV的蛋白N、L、P和M的基因n、l、p和m，编码Dandenong-GP或Mopeia-GP的基因gp并缺乏编码VSV的G蛋白的功能基因，其中所述系统的每个载体缺乏基因n、l、p、m和gp中的一个，并且其中所缺乏的基因存在于系统的任何其他载体上。本发明的VSV嵌合载体中包含的各GP基因是编码包含在如上所述的本发明的VSV嵌合载体中的GP蛋白的基因之一。

在再一个实施方案中，本发明涉及嵌合VSV病毒体，其特征在于病毒体包含Dandenong病毒或Mopeia病毒的GP蛋白作为包膜蛋白。在再一个实施方案中，病毒体可以包含Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GP作为包膜蛋白。因此，本发明还提供了包含以上所述的任何GP基因产物作为包膜蛋白的病毒体，病毒颗粒。在这个方面，本领域技术人员已知病毒体的包膜蛋白用于鉴定并结合宿主细胞膜上的受体位点。因此，本发明的病毒体在其表面上包含嵌合GP蛋白作为包膜蛋白，即，不同于VSV的GP蛋白的GP蛋白。然而，病毒体核酸序列内容的组成没有特别限制。即，例如，嵌合VSV病毒体可以包含编码VSV的GP的非功能基因。嵌合VSV病毒体还可以缺乏编码VSV的GP的基因。在本发明的嵌合VSV病毒体的表面上表达的GP是编码如上进一步描述的Dandenong病毒或Mopeia病毒的GP蛋白的基因的基因产物。在再一个实施方案中，本发明的嵌合VSV病毒体的表面上表达的GP可以是如上进一步描述的Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GP的基因的基因产物。因此，GP蛋白可以包含如SEQ ID NO:2或4任一个所示的氨基酸序列。或者，GP蛋白可以包含SEQ ID NO:6、8或10任一个所示的氨基酸序列。本发明的嵌合VSV病毒体还可以包含如下蛋白作为包膜蛋白，所述蛋白包含与SEQ ID NO:2具有60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，或与SEQ IDNO:4具有45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，或与SEQ ID NO:6具有45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，或与SEQ ID NO:8具有92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性或与SEQ ID NO:10具有60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性的氨基酸序列，其中包膜蛋白保持包含如下GP作为包膜蛋白的嵌合VSV病毒体的细胞向性和功能性，所述GP包含SEQ ID NO:2、4、6、8或10任一个所示的氨基酸序列。

本发明还提供了病毒生产细胞，其特征在于所述细胞产生本发明的嵌合VSV病毒体。所述细胞可以是任何来源的并且可以作为分离的细胞或作为包含在细胞群中的细胞存在。优选产生本发明的假型化VSV病毒体的细胞是哺乳动物细胞。在更优选的实施方案中，本发明的病毒生产细胞的特征在于所述哺乳动物细胞是多能成年祖细胞(MAPC)、神经干细胞(NSC)、间充质干细胞(MSC)、HeLa细胞、任何HEK293细胞、Vero细胞或骨髓衍生的肿瘤浸润细胞(BM-TIC)。或者，病毒生产细胞可以是人细胞、猴细胞、小鼠细胞或仓鼠细胞。本领域技术人员已知适用于测试给定的细胞是否产生病毒的方法，并且因此获知特定的细胞是否落入本发明的范围内。在这个方面，由本发明的细胞产生的病毒量不受特别限制。优选的病毒滴度为感染后没有进一步下游处理，给定的细胞培养物的粗制上清液中≥1×10

在特定的实施方案中，本发明的病毒生产细胞的特征在于细胞包含一个或多个用于表达至少一种基因的表达盒，所述基因选自编码VSV的蛋白N、L、P和M的基因n、l、p和m以及编码Dandenong-GP或Mopeia-GP糖蛋白的基因gp。

本发明的病毒生产细胞可以用于例如基因治疗中。对于这样的目的，提供了病毒生产细胞，其特征在于所述细胞包含用于包装至用Dandenong或Mopeia病毒的GP假型化的VSV病毒体中的基因转移载体，其中所述基因转移载体包含转基因。在这个方面中，转基因可以是解决特定宿主需求的任何基因。

本发明含义内的转基因可以使用本文提供的方式转移至细胞中。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种在体外或在体内将转基因转移至细胞中的方法，其特征在于用本发明的嵌合病毒体转导细胞，其中所述病毒体包含转基因。还可以使用本发明的病毒生产细胞转移转基因。因此，在再一个实施方案中，提供了一种用于在体外将转基因转移至细胞中的方法，其特征在于将细胞接触本发明的病毒生产细胞。优选将转基因转移至其中的细胞是肿瘤细胞。

在再一个实施方案中，本发明涉及包含本文提供的任一种工具的药物组合物。因此所述药物组合物的特征在于所述组合物包含本发明的VSV嵌合载体、本发明的VSV嵌合载体细胞、本发明的嵌合VSV病毒体或本发明的病毒生产细胞。

在再一个实施方案中，将本文提供的工具提供用作药物，所述工具特别是本发明的VSV嵌合载体、本发明的VSV嵌合病毒系统、本发明的嵌合VSV病毒体、本发明的病毒生产细胞或本发明的药物组合物。

本发明进一步涉及本发明的VSV嵌合载体、本发明的VSV嵌合病毒系统、本发明的嵌合VSV病毒体、本发明的病毒生产细胞或本发明的药物组合物，用于治疗癌症中。在优选的实施方案中，所述癌症是实体癌症。在更优选的实施方案中，所述实体癌症可以是脑癌、结直肠癌、口咽鳞状细胞癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺腺癌、胆管癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、脑瘤或小细胞肺癌。

在本发明的再一个实施方案中，提供了本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合病毒系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物，其中将VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物与PD-1或PD-L1拮抗剂组合。这样的组合可以在给药前进行，即，可以在给药于需要其的患者之前将本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物与PD-1或PD-L1拮抗剂组合以形成组合制剂。或者，本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物可以分开给药，以形成组合治疗。因此，本发明还涉及包含本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物与PD-1或PD-L1拮抗剂的药物组合物，用于本文提供的用途中。此外，本发明涉及一种治疗方法，包括给药本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物并给药PD-1或PD-L1拮抗剂。

在本发明内，本领域技术人员，特别是临床医师，可以选择合适的给药途径用于本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物。在特定的实施方案中，提供了本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物，其中VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物可以肿瘤内或静脉内给药。在另一个实施方案中，提供了用于根据本发明的用途的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物，其中将VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物肿瘤内且随后静脉内给药。即，本发明的VSV嵌合载体、VSV嵌合载体系统、嵌合VSV病毒体、病毒生产细胞或药物组合物可以合适地配制用于静脉内或肿瘤内给药。

本发明还提供了用于治疗受试者的方法，特别是人受试者，其中受试者患有癌症，特别是实体肿瘤，所述方法包括给药治疗有效量的本发明的VSV嵌合载体、本发明的VSV嵌合载体系统、本发明的嵌合VSV病毒体、本发明的病毒生产细胞或本发明的药物组合物。在特定的实施方案中，所述实体癌症是脑癌、结直肠癌、口咽鳞状细胞癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺腺癌、胆管癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、脑瘤或小细胞肺癌。

本发明此外涉及包含本文提供的工具的试剂盒。

附图简述

图1是一张表(表1)：旧世界沙粒病毒(A)和新世界沙粒病毒进化枝C(B)GPC序列的比较。

序列获自NCBI。N-连接的糖基化信号NxT或NxS的数量是从翻译的核苷酸序列推断出来的，且范围从6(LCMV)到10(IPPV，OLIVV)信号。给定的氨基酸位置对应于从翻译起始的甲硫氨酸开始的各个序列的序列位置。通过成对的MUSCLE比对将GPC序列与LCMV-GP WEHPI进行比较[17]。显示了相对序列同一性(％Seq Id.)，绝对同一性(n)和序列相似性。aa：氨基酸，nt：核苷酸。

图2：沙粒病毒糖蛋白的多序列比对。

使用MUSCLE对LCMU-GP WE HPI、DANVD GP、IPPYV GP、MOPV GP、OLIVV GP和LATVGP的氨基酸序列进行比对[17]。黑色箭头指示信号肽酶和细胞枯草杆菌蛋白酶kexin同工酶1(SKI-1)/位点1蛋白酶(S1P)的切割位点，它们将前体糖蛋白GPC切割成SSP、GP1和GP2。用虚线框表示预测的沙粒病毒GP的GP1肽内的N-连接的糖基化信号序列NxT或NxS。

图3是一张表(表2)：在选定的旧世界和新世界进化枝C沙粒病毒之间的GPC区中的核苷酸和氨基酸序列同一性。

图4：感染反式-互补的VSV*M

非细胞病变性VSV*M

图5是一张表(表3)：VSV*M

VSV*M

图6：VSV-G(x)DANDV和MOPV复制动力学。

将Vero细胞以4×10

图7：I型干扰素(IFN)限制了人肿瘤细胞系中的VSV-G(x)复制。

将人Calu6(A)和22Rv1(B)细胞用所示量的IFN预孵育16小时。随后，用0.1、1或10MOI的VSV-GP、VSV-G(x)DANDV、VSV-G(x)MOPV或VSV-G(x)OLIVV一式四份感染细胞，或不感染作为阴性对照。感染后三天，使用MTT测定分析细胞的生活力。该图显示平均±SEM，并将未用IFN预处理的未感染细胞的生活力标准化至100％。

图8：I型干扰素(IFN)限制了鼠肿瘤细胞系中的VSV-G(x)复制。

将鼠SCCVII(A)、Ct26Cl.25(B)或LLC1(C)细胞用所示量的IFN预孵育16小时。随后，用0.1、1或10MOI的VSV-GP、VSV-G(x)DANDV、VSV-G(x)MOPV或VSV-G(x)OLIVV一式四份感染细胞，或不感染作为阴性对照。感染后三天，使用MTT测定分析细胞的生活力。该图显示平均±SEM，并将未用IFN预处理的未感染细胞的生活力标准化至100％。

图9：兔子治疗和监测的时间表。

时间表显示三个处理中的一个的设计。所有处理周期都是相同的，从D0、D14和D28开始，使用i.v.注射VSV-GP或VSV-G(x)病毒。操纵兔子的时间点由箭头来表示。nAb，中和抗体；BW，体重；BT，体温；WBC，全血计数。

图10：用LCMV-GP、DANDV-GP和MOPV-GP重组VSV载体免疫的兔子中的中和抗体诱导。

分析在第-4天、每次病毒治疗后第10天(初次、第一次加强、第二次加强)和实验结束时收集的血清中对抗自体沙粒病毒糖蛋白的中和抗体。使用方法部分中详细描述的用LCMV-GP WE HPI、DANDV-GP或MOPV-GP假型化的VSVΔG SEAP测试血清的中和能力。(A)相对于1:10至1:31.250的血清稀释度，绘制了标准化至无血清对照的感染率[以％计]。初次免疫(空心方块)后，所有兔子均未显示针对LCMV、DANDV或MOPV的沙粒病毒GP的nAb。与VSV-GP免疫的兔子血清相比，用VSV-G(x)DANDV和MOPV免疫的兔子的首次加强血清仅显示自体VSVΔG SEAP病毒的部分中和，因此不适用相应EC50值的计算(n.a.)。在非线性曲线拟合(B)后计算了EC50值。LCMV-GP中和抗体KL25对VSV-ΔG SEAP GP的中和用作测定间对照(C)。

图11：肺癌异种移植小鼠模型中用不同的沙粒病毒糖蛋白GP重组VSV载体的肿瘤内治疗的功效。

将5×10

图12是一张表(表4)：评价病毒诱导的细胞毒性的评分。

受感染小鼠的神经毒性评分基于不同的类别，如总体外观、临床观察、身体状况引起的行为运动和呼吸。不同类别的分数范围为0-3。图12所示的累积毒物得分是通过将每个类别的评分相加计算得出的。

图13：Swiss CD1小鼠中的神经毒性。

Swiss CD-1小鼠通过立体定向注入右侧纹状体中接受了单次颅内注射3μl，含1×10

详述

如上所述，本发明总体上涉及提供嵌合VSV载体，其中VSV载体缺乏编码VSV的包膜蛋白GP的功能基因，而是包括编码沙粒病毒(特别是Dandenong病毒或Mopeia(MOPV)病毒)的糖蛋白GP的基因。或者，载体可以包含Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GP。如技术人员所知，糖蛋白GP是存在于病毒体表面上的包膜蛋白，其负责病毒体与宿主生物体的细胞之间的结合。因此，包膜蛋白决定了病毒体的向性。通过改变VSV的向性，可以制备适用于医学中的嵌合VSV载体。此类嵌合载体/病毒体已经在现有技术中提供，例如，WO 2010/040526中。然而，需要进一步改进的嵌合载体，其提供甚至更有效的治疗选择和甚至更好的用于医疗用途的适合性。本发明满足了这一需要。

除非另外限定，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义，并参考公开的文本，其为本领域的技术人员提供了本申请中所使用的许多术语的一般性指导。提供以下定义仅是为了清楚起见，并不旨在限制所要求保护的发明。

术语“a”或“an”是指一个或多个，例如，“基因(a gene)”理解为表示一个或多个这样的基因。因此，术语“a”(或“an”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。如本文使用的，术语“约”表示与给定的参照之间的差异为10％，除非另外指出。

关于以下描述，意图在另一个实施方案中，本文所述的每种组合物在本发明的方法中是有用的。另外，在另一个实施方案中，意图在于本文所述的在方法中有用的每种组合物本身也是本发明的实施方案。虽然说明书中的各种实施方案是使用“包含”语言来呈现的，但是在其他情况下，也意图使用“由……组成”或“基本上由……组成”的语言来解释和描述相关的实施方案。

在这个方面中，本发明的载体基于水疱性口炎的病毒，并且与逆转录病毒载体相比，至少具有以下一般优势：

(i)VSV载体是溶瘤的，并且与其他溶瘤病毒载体相比具有特别高的溶瘤活性。

(ii)VSV载体优先在肿瘤细胞中复制并且与其他溶瘤病毒载体相比具有特别高的复制能力。

(iii)VSV载体感染活跃分裂的细胞以及静息细胞。

(iv)VSV载体诱导强烈的先天性体液和细胞免疫反应。

(v)VSV载体纯在胞质中复制，即作为RNA病毒，它们无法整合到宿主细胞基因组中或重组成具有复制能力的病毒。

(vi)VSV载体易于包装。

(vii)VSV糖蛋白可与外来包膜蛋白互换。先前结合至VSV包膜中的糖蛋白的实例为：HIVgp160[19]、HCVE1/E2[20]、SARS S[21]、Lassa GP[22]或LCMV GP。

然而，本发明的载体具有优于现有技术的其他优势，且特别是优于用LCMV的GP假型化的VSV。

具体地，本发明的载体令人惊讶地显示出在相同条件下与用LCMV的GP假型化的VSV载体相比降低的中和抗体诱导。技术人员已知可以用于测定中和抗体诱导的测定。

通过使用如实施例5中所述的测定，本发明令人惊讶地发现了中和抗体的诱导降低了。这样的效果是出乎技术人员的合理预期的。此外，这个效果的显著性证明了本文提供的载体以及进一步的工具提供了明显的优势。在这点上，优选本文提供的载体/病毒体对中和抗体的诱导与用LCMV的GP假型化的VSV载体相比降低了。

在相同条件下，与用LCMV的GP假型化的VSV载体相比，本发明的载体/病毒体不仅证明了降低中和抗体，而且另外显示出提高的肿瘤细胞杀灭。技术人员已知可以用于测定/定量肿瘤细胞杀灭的测定。优选本发明的载体/病毒体对肿瘤细胞的杀灭与用LCMV的GP假型化的VSV载体相比提高了。

为了实现上述令人惊讶的效果，VSV的GP是非功能性的，而掺入了Dandenong病毒或Mopeia(MOPV)病毒的GP或VSV的GP被Dandenong病毒或Mopeia(MOPV)病毒的GP替代。或者，VSV的GP是非功能性的，而掺入了Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GP，或VSV的GP被Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GO替代。如何使用上述任何GP对VSV载体进行假型化，存在多种可能性。因此，本发明载体的确切核酸序列可以变化，只要在病毒体表面上基本上不存在VSV的GP，而在病毒体表面上表达以上任何病毒的GP。在本发明内，示例性的优选载体包括包含SEQ ID NO：1或3、5、7或9的核酸序列或包含与SEQ ID NO：1、3、5、7或9中的任何一个具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或100％相同的核酸序列。在这方面，SEQ ID NO：1对应于编码Dandenong病毒的GP的优选核酸序列，SEQ ID NO：3对应于编码Mopeia病毒的GP的优选核酸序列，SEQ ID NO：5对应于编码Ippy病毒的GP的优选核酸序列，SEQ ID NO：7对应于编码Latino病毒的GP的优选核酸序列，而SEQ ID NO：9对应于编码Olivero病毒的GP的优选核酸序列。

将相对参照核酸序列的“百分比(％)核酸序列同一性”定义为候选序列中与参照序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。测定相同核苷酸的百分比的方法是本领域技术人员已知的。在本发明内，优选使用计算机软件，如BLAST。参数可以由技术人员容易地确定。

尽管编码用于假型化VSV的任一个GP基因的核酸序列可以改变，但重要的是维持由以上提供的优选基因序列编码的GP所给予的功能性。维持的功能性参数优选是中和抗体的诱导、肿瘤细胞的杀灭和/或向性。在这点上，可以使用以上提供的测定。此外，技术人员已知可以用于测定病毒颗粒/病毒体向性的测定。

如技术人员将获知的，核酸序列可以改变，具有改变或未改变编码的多肽的一级序列。在本发明内，优选由用于假型化的基因编码的多肽序列相对于分别由SEQ ID NO:1、3、5、7或9编码的GP蛋白保持未改变。即，优选本发明的病毒体中包含的GP蛋白对应于Dandenong或Mopeia病毒的GP蛋白。更特别地，优选本发明的病毒体包括包含由SEQ ID NO:2、4、6、8或10所示的任一个氨基酸序列的GP蛋白。然而，技术人员已知多肽的氨基酸序列可以改变而没有影响其功能性。因此，本发明还包括包含可替换序列的多肽，只要基本上保持以上任一个氨基酸序列的功能性。

因此，在某些实施方案中，考虑了包含本文提供的GP蛋白的氨基酸序列变体的病毒体。可以通过将适当的修饰引入编码各GP的核苷酸序列中，或通过肽合成，来制备氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，GP的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或置换。可以进行缺失、插入和置换的任意组合，以获得最终的构建体，只要最终的构建体具有所需的特征，例如，中和抗体的诱导、肿瘤细胞的杀灭和/或向性。

在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸置换的变体。保守性置换显示于表5中的“优选置换”标题下。更实质性的改变提供于表5中的“示例性置换”标题下，并且参照氨基酸侧链类别在以下进一步描述。可以将氨基酸置换引入目标GP中，并针对所需的活性筛选产物/病毒体。

根据共有的侧链性质，可以将氨基酸分组：

(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性：Asp、Glu；

(4)碱性：His、Lys、Arg；

(5)影响链方向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

表5

氨基酸置换

非保守性置换将需要将这些类别中的一个的成员交换为另一个类别。在本发明的范围内，包含在本发明的病毒体中的变体GP蛋白保持了分别由Dandenong病毒、Mopeia病毒、Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的未改变的GP蛋白赋予病毒体的功能性。这样的变体GP蛋白可以与SEQ ID NO:2具有60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，或与SEQID NO:4具有45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，或与SEQ ID NO:6具有45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，或与SEQ ID NO:8具有92、93、94、95、96、97、98或99％序列同一性或与SEQ ID NO:10具有60、65、70、75、80、85、90或95％序列同一性，其中包膜蛋白维持嵌合VSV病毒体的细胞向性和功能性，所述嵌合VSV病毒体包括包含SEQ ID NO:2、4、6、8或10任一个中所示氨基酸序列的GP作为包膜蛋白。

将关于参照氨基酸序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列且为了获得最大百分比序列同一性如果需要引入缺口后，并且不考虑任何保守性置换作为序列同一性的一部分，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸相同的氨基酸百分比。可以以本领域技术人员能力范围内的各种方式来实现为了确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对，例如，使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。那些本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括为了在全长待比较序列上获得最大比对所需的任何算法。

在再一个实施方案中，本发明涉及具有Dandenong或Mopeia GP蛋白，或Ippy、Latino或Olivero GP中的任一个的功能性的变体GP序列，其中变体GP蛋白包含20、15、10或5个，或优选4、3、2或1个改变。

除了它们固有的溶瘤特性，可以通过引入至少一种转基因来进一步改进基于其的并且如本文提供的VSV嵌合载体或载体系统。技术人员已知可以用于将这样的转基因引入本发明的载体中的技术以及将它们引入何方。一种示例性的方法包括限制和连接的步骤或PCR和Gibson装配。在本发明内可以使用的转基因没有特别限制，只要通过转基因的递送解决了特定的需求。非限制性的且优选的实例包括编码自杀蛋白、细胞因子/趋化因子、结合免疫相关受体的抗体或抗体片段、用于疫苗接种目的的蛋白质、病毒融合蛋白、标记蛋白或其融合体的转基因。

为了提高在治疗用途中使用可复制病毒过程中的安全性，提供了一种载体系统，其确保VSV病毒的复制、溶瘤和产生只在由至少两种复制缺陷互相互补载体感染的细胞中进行。

因此本发明在一个实施方案中涉及VSV嵌合载体系统，其特征在于系统包含至少两种互补复制VSV，其中系统包含编码VSV的蛋白N、L、P和M的基因n、l、p和m，编码Dandenong-GP或Mopeia-GP，或替换地Ippy-GP、Latino-GP或Olivero-GP的基因gp，且缺乏编码VSV的G蛋白的功能基因，其中系统的每个载体缺乏基因n、l、p、m和gp中的一个，并且其中所缺乏的基因存在于系统的任何其他载体上。这样的互补复制(cr)VSV载体可以在靶向的细胞(例如，肿瘤细胞)内以有限的程度扩散，这提高了基因转移和溶瘤的效率。因此，根据本发明的载体系统允许制备对于靶向细胞(特别是肿瘤细胞)中的基因转移具有有限的复制能力的溶瘤VSV嵌合载体。编码LCMV-GP的基因cp以及可能的其他基因(如治疗基因和/或标记基因)可以存在于系统的任何载体上。

根据本发明的载体系统的不同变体是可能的。例如，载体系统可以由两个载体或超过两个载体组成。当载体系统由两个载体组成时，第一载体可以包含Dandengong病毒或Mopeia病毒的GP，或替换地Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GP，替代VSV的GP，并且删除了编码P蛋白的基因p。此外，第二载体可以不包含VSV-G，但表达VSV的P蛋白。每个载体可以表达VSV的核蛋白(N)和聚合酶(L)以及M蛋白(Mncp)的较少细胞致病变体。第一载体可以另外携带标记基因rfp，而第二载体可以携带转基因。

本发明还提供了包含两个载体的载体系统，其中一个载体包含Dandenong病毒或Mopeia病毒的GP，或替换地Ippy病毒、Latino病毒或Olivero病毒的GP，如本文限定的，且第二载体包含LCMV的GP。包含LCMV的GP的第二载体可以是WO 2010/040526中所述的载体。

本发明还涉及生产本发明的嵌合病毒体的细胞。本发明含义中的病毒生产细胞包括用于从不可复制的载体生产病毒体的经典包装细胞，以及用于从能够复制的载体生产病毒体的生产细胞。包装细胞通常包含一个或多个用于表达必需基因的质粒，所述必需基因不存在于待包装的相应载体中和/或是病毒体生产必需的。这样的细胞可以是哺乳动物细胞，特别是人细胞、猴细胞、小鼠细胞或仓鼠细胞，更特别是HEK293细胞、Hela细胞或Vero细胞。这样的细胞是技术人员已知的，其可以选择适用于所需目的的合适细胞。

在之前的研究中，将包装细胞用于转移病毒载体；然而，这主要涉及成纤维细胞，其没有在肿瘤内移动(Short等，1990，Culver等，1992)。相反，成年干细胞，特别是神经元(NSC)、多能成年祖细胞(MAPC)和间充质干细胞(MSC)具有高迁移潜力。它们仍然局限在肿瘤组织中，从而实现了非常有效但又特异性的基因转移到肿瘤组织中。然而，这些干细胞在体外具有有限的传代能力。

成年间充质干细胞的一个亚群，称为BM-TIC(骨髓衍生的肿瘤浸润细胞)，在注射入实验诱导的神经胶质瘤后会浸润整个肿瘤，此外，还可以追踪远离肿瘤块的单个肿瘤细胞[23]。BM-TIC是从成年骨髓中分离出来的，具有高扩增潜力，且可以用作MLV[24]和VSV载体的迁移生产细胞。

因此，本发明的主题是病毒生产细胞，其产生本发明的VSV嵌合载体。特别地，这些是肿瘤浸润生产细胞，其在所述肿瘤内迁移期间释放所述载体。优选的细胞是成年干细胞，特别是神经元(NSC)和间充质干细胞(MSC)。特别优选的细胞是源自MSC的BM-TIC细胞。

本发明的病毒生产细胞以及因此由所述细胞产生的VSV嵌合载体可以包含编码突变的M蛋白的基因。这种载体变体对肿瘤细胞选择性地溶瘤，而对健康细胞无毒。优选在M蛋白的37PSAP40区域中具有氨基酸交换或在M蛋白的PSAP区域外具有单个(M51R)或多个(V221F和S226R；M33A和M51A)突变的M变体。具有突变M33A、M51R、V22F和S226R的M蛋白是特别优选的。为了确保在包装细胞中的高效病毒生产，可以用病毒干扰素拮抗剂稳定地转染M变体。

在一个实施方案中，病毒产生的特征在于所述细胞包含一个或多个表达至少一个基因的表达盒，所述基因选自编码VSV的蛋白N、L、P和M的基因n、l、p和m，以及编码Dandenong-GP或Mopeia-GP糖蛋白，或替换地Ippy-GP、Latino-GP或Olivero-GP的基因gp。细胞可以进一步包含基因转移载体，用于包装至用Dandenong或Mopeia病毒，或替换地Ippy，Latino或Olivero病毒的GP假型化的VSV病毒体中，其中该基因转移载体包含转基因。

此外，本发明的主题是用于基因转移的体外方法，其中将包含转基因的根据本发明的VSV嵌合载体或根据本发明的VSV嵌合载体系统直接或通过根据本发明的病毒生产细胞(包装细胞)引入细胞中。如果使用具有至少两个载体的cr载体系统，使用至少两种包装细胞，其中每种细胞产生一种(复制无能)cr载体。VSV病毒的产生只在感染了cr载体系统的所有载体并因此包含所有必需病毒基因的细胞中进行。

此外，本发明涉及根据本发明的载体和病毒生产细胞作为治疗方法中的药物的用途。特别地，将根据本发明的载体和病毒生产细胞用于实体癌症的治疗。不受理论的束缚，治疗效果由重组载体和病毒的溶瘤特性以及通过使用治疗基因引起。

实体癌症可以是脑癌、结直肠癌、口咽鳞状细胞癌、胃癌、胃食管结合部腺癌、食道癌、肝细胞癌、胰腺腺癌、胆管癌、膀胱尿路上皮癌、转移性黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、脑瘤或小细胞肺癌。

本发明的主题进一步是药物组合物，其包含本发明的载体、病毒体或病毒生产细胞，和任选的添加剂，如药学上可接受的载体和辅助物质。

为了提高病毒溶瘤和治疗基因的转移效率，连续释放载体的肿瘤浸润病毒生产细胞可以配制成用于直接植入肿瘤中。本文提供的工具因此可以配制用于肿瘤内给药或静脉内给药。

术语“药物制剂”或“药物组合物”是指一种制备物，其以这样的形式使得允许其中所含的活性成分的生物活性是有效的，并且其不含对待给药该制剂的受试者有不可接受的毒性的其他成分。

“药学上可接受的载体”是指药物制剂中除了活性成分以外的成分，其对受试者是无毒的。药学上可接受的载体包括，但不限于，缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

如本文所用的，“治疗(treatment)”(及其语法变体，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指尝试改变待治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以是针对预防进行的或在临床病理的过程中进行。理想的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的出现或复发、缓解症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻病况以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病的发展或减慢疾病的进展。

通过将具有所需纯度的载体、病毒体或细胞与一种或多种任选的药学上可接受的载体[25]混合来制备本文所述的载体、病毒体或细胞的药物制剂，以冻干制剂或水溶液的形式。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者是无毒的，并且包括，但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中示例性的药学上可接受的载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(

本文的制剂还可以按照需要含有超过一种的活性成分，用于特定的待治疗适应症，优选没有不利地彼此影响的具有互补活性的那些。

活性成分可以包埋在例如分别通过凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶态药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)或大乳剂中。这样的技术公开[25]中。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体或免疫缀合物的固态疏水性聚合物的半透性基质，所述基质呈成形制品(例如薄膜或微胶囊)的形式。待用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以容易地实现无菌性，例如通过穿过无菌滤膜过滤。

在一个方面中，提供了用作药物的根据本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物。在更多方面中，提供了用于治疗方法中的根据本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物。在某些实施方案中，提供了用于治疗癌症中的根据本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗患有癌症的个体的方法中的本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物，所述方法包括将有效量的载体、病毒体、细胞或药物组合物给药于个体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括将有效量的至少一种其他治疗剂(例如，如下所述的)给药于个体。

在再一个方面中，本发明提供了本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症，特别是实体肿瘤。在再一个实施方案中，所述药物用于治疗癌症的方法中，特别是实体癌症，所述方法包括将有效量的药物给药于患有癌症的个体，特别是实体癌症。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括将有效量的至少一种其他治疗剂(例如，是PD-1或PD-L1的拮抗剂的治疗剂)给药于个体。

在再一个方面中，本发明提供了治疗癌症的方法，特别是实体癌症。在一个实施方案中，所述方法包括将有效量的本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物给药于患有癌症的个体。在一个这样的实施方案中，所述方法进一步包括将有效量的至少一种如下所述的其他治疗剂给药于个体。

根据以上任一个实施方案的“个体”可以是人。然而，包括需要这些治疗或预防方法的任何哺乳动物，特别包括人。需要这样的治疗或预防的其他哺乳动物包括狗、猫、或其他驯养的动物、马、家畜、实验动物，包括非人灵长类动物等。受试者可以雄性或雌性。在一个实施方案中，受试者患有癌症(更特别地实体肿瘤)，或有发展成癌症(更特别地实体肿瘤)的风险。

如上所述，本发明提供了包含本文提供的任何载体、病毒体或细胞的药物组合物，例如，用于以上任一种方法中。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何载体、病毒体或细胞和药学上可接受的载体。在其他实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何载体、病毒体或细胞和至少一种其他治疗剂，例如，如下所述的。

本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物在疗法中可以单独使用或结合其他药剂使用。例如，本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物可以与至少一种其他治疗剂共同给药。

本发明含义内的“治疗剂”是分子，包括，但不限于，多肽、肽、糖蛋白、核酸、合成的和天然的药物、肽、多烯、大环化合物、糖苷、萜烯、萜类化合物，脂肪族和芳香族化合物及其衍生物。在优选实施方案中，治疗剂是PD-1或PD-L1的拮抗剂。在另一个优选实施方案中，治疗剂是检查点抑制性抗体或刺激个体免疫应答的任何其他免疫治疗剂。在再另一个实施方案中，治疗剂是化疗剂。所述化学治疗剂基本上可以是呈现出对抗对个体中的肿瘤细胞的溶瘤作用并且没有抑制或减弱本发明的溶瘤病毒的溶瘤作用的任何活性剂。该活性剂可以是任何已知或随后发现的化疗剂。例如，已知类型的化疗剂包括例如蒽环类、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶类、亚乙基亚胺、甲基三聚氰胺、氮芥、亚硝基脲、抗生素、抗代谢物、叶酸类似物、嘌呤类似物、嘧啶类似物、酶、鬼臼毒素、含铂活性剂、干扰素和白介素。

合适的治疗剂包括但不限于在Goodman和Oilman的The Pharmacological Basisof Therapeutics(例如，第9版)或The Merck Index(例如，第12版)中提出的那些。治疗剂的种类包括但不限于影响炎症反应的药物、影响体液组成的药物、影响电解质代谢的药物、化疗剂(例如，用于过度增殖性疾病，特别是癌症、寄生虫感染和微生物疾病)、抗肿瘤药、影响血液和造血器官的药物、激素和激素拮抗剂、维生素和营养素、疫苗、寡核苷酸和基因治疗剂。将理解的是，本发明还包括包含组合的组合物，例如两种或更多种活性剂(如两种药物)的混合物或共混物。

以上所述的此类联合疗法包括联合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在相同或分开的制剂中)和分开施用，在这种情况下，本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物的施用可以先于、同时，和/或后于其他治疗剂和/或佐剂的施用。本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物也可以与放疗联合使用。

本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物(和任何其他治疗剂)可以通过任何合适的方式来给药，包括胃肠外、肺内和鼻内给药，并且如果需要局部治疗，则可以病灶内、子宫内或膀胱内给药。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。还设想了直接肿瘤内给药。优选静脉内或肿瘤内给药。给药可以通过任何合适的途径进行，例如通过注射，如静脉内或皮下注射，这部分取决于是否是短暂或长期给药。本文考虑了各种给药方案，包括但不限于在各个时间点上的单次或多次给药、推注给药和脉冲输注。

对于离散的、实体的、可接近的肿瘤，特别考虑了肿瘤内注射或直接注射到肿瘤脉管系统中。局部、区域性或全身性给药也可能是合适的。例如，对于>4cm的肿瘤，待给药的体积大约为4-10mL(合适的是10mL)，而对于<4cm的肿瘤，可以使用大约1-3mL的体积(合适的是3ml)。在一些实施方案中，所给药的活性剂的体积可以高达肿瘤体积的25％或高达33％。以单剂量递送的多次注射包括约0.1至约0.5mL体积。通过以大约1cm的空间间隔，对肿瘤进行多次注射可以有利地接触病毒颗粒。在外科手术干预的情况下，本发明的组合物可以在术前使用，以使不能手术的肿瘤接受切除。在适当的情况下，也可以应用连续给药，例如，通过将导管植入肿瘤或肿瘤脉管系统中。这样的连续灌注可以在开始治疗后的约1-2小时，至约2-6小时，至约6-12小时，至约12-24小时，至约1-2天，至约1-2周或更长的时间段中进行。通常，通过连续灌注的治疗组合物的剂量将等同于在灌注发生的时间段内调节的单次或多次注射所给予的剂量。进一步考虑到肢体灌注可用于给药治疗组合物，特别是在黑素瘤和肉瘤的治疗中。

本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物将以与良好医学实践一致的方式配制、定量和给药。在该背景下考虑的因素包括正在治疗的特定病症、正在治疗的特定哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的起因、活性剂的递送位点、给药方法、给药进度表和医学从业人员已知的其它因素。载体、病毒体、细胞或药物组合物不是必须，但任选与目前用于预防或治疗所述疾病的一种或多种活性剂一起配制。此类其他活性剂的有效量取决于制剂中存在的载体、病毒体、细胞或药物组合物的量，病症或治疗的类型以及上面讨论的其他因素。这些通常以与本文所述相同的剂量和给药途径来使用，或以本文所述剂量的约1-99％，或以经验/临床确定为合适的任何剂量并通过任何途径来使用。

对于疾病的预防或治疗，本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物(单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂联合使用时)的适当剂量将取决于待治疗的疾病的类型，载体、病毒体、细胞或药物组合物的类型，疾病的严重程度和进程，给药载体、病毒体、细胞或药物组合物是为了预防还是治疗目的，在前的治疗，患者的临床史以及对载体、病毒体、细胞或药物组合物的应答和主治医师的判断。载体、病毒体、细胞或药物组合物可以一次或通过一系列治疗适当地给药于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的载体、病毒体、细胞或药物组合物可以作为最初的候选给药剂量给药于患者，无论例如是通过一次或多次分开的给药，或是通过连续输注。根据上述因素，一种典型的日剂量范围可以为1μg/kg到100mg/kg或更高。对于几天或更长时间的重复给药，根据病症，通常将持续治疗直到出现所需的疾病症状抑制为止。载体、病毒体、细胞或药物组合物的一种示例性剂量将在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围内。因此，可以向患者给药约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一种或多种剂量(或其任何组合)。这样的剂量可以间歇地给药，例如，每周或每三周(例如，使患者接受约两剂至约二十剂，或例如约六剂的载体、病毒体、细胞或药物组合物)。可以给药初始较高的负荷剂量，然后给药一个或多个较低的剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的。可以通过常规技术和测定容易地监控这种疗法的进展。

或者，本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物可以在约50μL至约10mL的体积中递送，包括该范围内的所有数字，这取决于待治疗的面积大小、所用的病毒滴度、给药途径和所需的方法效果。在一个实施方案中，体积为约50μL。在另一个实施方案中，体积为约70μL。在另一个实施方案中，体积为约100μL。在另一个实施方案中，体积为约125μL。在另一个实施方案中，体积为约150μL。在另一个实施方案中，体积为约175μL。在再另一个实施方案中，体积为约200μL。在另一个实施方案中，体积为约250μL。在另一个实施方案中，体积为约300μL。在另一个实施方案中，体积为约450μL。在另一个实施方案中，体积为约500μL。在另一个实施方案中，体积为约600μL。在另一个实施方案中，体积为约750μL。在另一个实施方案中，体积为约850μL。在另一个实施方案中，体积为约1000μL。在另一个实施方案中，体积为约2000μL。在另一个实施方案中，体积为约3000μL。在另一个实施方案中，体积为约4000μL。在另一个实施方案中，体积为约5000μL。在另一个实施方案中，体积为约6000μL。在另一个实施方案中，体积为约7000μL。在另一个实施方案中，体积为约8000μL。在另一个实施方案中，体积为约9000μL。在另一个实施方案中，体积为约10000μL。携带在细胞特异性启动子序列控制下编码所需转基因的核酸序列的病毒体的有效浓度理想地范围为约10

应该理解，可以使用本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物中的任何一种来进行任何上述制剂或治疗方法。

在本发明的另一个方面中，提供了制成品，其含有用于治疗、预防和/或诊断以上所述的病症的材料。制成品包含容器和贴在容器上或与容器结合的标签或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由多种材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器容纳单独的组合物或与另一种可有效地治疗、预防和/或诊断病症的组合物组合的组合物，且可以具有无菌进入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的瓶子)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物。所述标签或包装说明书指示，所述组合物用于治疗选择的病症。此外，制成品可以包含(a)具有包含在其中的组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的载体、病毒体、细胞或药物组合物；和(b)具有包含在其中的组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其它的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制成品还可以包含包装说明书，所述包装说明书指示所述组合物可以用于治疗特定病症，特别是癌症。可替换地，或另外地，制成品可以进一步包含第二(或第三)容器，所述容器包含药学上可接受的缓冲液，如抑制细菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液或葡萄糖溶液。其可以进一步包括从商业和用户观点看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针和注射器。

实施例

实施例1：沙粒病毒GP序列比对

如下以基因库平面文件格式从NCBI核苷酸文库检索S区段的沙粒病毒RNA序列：LCMV GP WE HPI(登录号：AJ297484)、MOPV GP(登录号：JN561684)、DANDV GP(登录号：EU136038)、IPPYV GP(登录号：DQ328877)、OLIVV GP(登录号：U34248)和LATV(登录号：AF485259)。通过翻译由S区段编码的GPC开放阅读框获得了GPC糖蛋白序列。使用Geneious软件包11.0.5版(Biomatters Ltd.)比较了旧世界和新世界进化枝C沙粒病毒GPC序列的核苷酸和蛋白质水平。

通过糖基化信号序列NxS或NxT鉴定糖蛋白GP的GP1肽中的N-连接的糖基化信号。糖基化信号位点的编号对应于从ATG甲硫氨酸翻译起始密码子开始的亲本序列(图1)。

在核苷酸序列或相应的GPC氨基酸序列进行多次比对后，计算绝对和相对序列同一性(％Seq Id)(图2和3)。使用MUSCLE[17]对序列进行比对，使用通过k-mer和pctid聚类的距离矩阵进行最多八次迭代。随后，使用UPMGA方法对序列进行聚类。使用阈值≥1的blosum62矩阵，通过成对比对计算出每种沙粒病毒GPC蛋白与LCMV WE HPI相比的序列相似性。

实施例2：沙粒病毒GP可以与VSV-G互补

DANDV、MOPV以及LATV和OLIVV的GP糖蛋白能够对VSV*MQΔG病毒进行反式互补。与模拟对照相比时，所得的VSV假型能够在随后的传代中感染BHK21Cl.13细胞，并在不同的稀释度下显示出增加的GFP信号(图4A)。在感染了IPPYV GP互补的VSV*MQΔG病毒上清液的BHK21Cl.13细胞中可以观察到的GFP信号与模拟对照相当，并且由输入的VSV*MQΔG病毒产生。为了证实这些结果，用假型化VSV*MQΔG病毒感染稳定表达LCMV-GP的BHK-566细胞。用DANDV-GP、LATV-GP、MOPV-GP或OLIVV-GP反式互补的病毒能够在细胞培养物内扩散，即使在高稀释度下，在感染后48h后导致遍在的GFP表达(图4B)。用DANDV、MOPVV、IPPYV OLIVV和LATV的GP反式补充的VSV*M

对于反式互补，在转染前一天，将0.8-1×10

实施例3-复制动力学

克隆WO 2010/040526中所述的包含VSV载体主链的VSV嵌合载体以及DANDV、MOPV、OLIVV和LATV的GP。所得到的嵌合VSV-G(x)-DANDV、-MOPV、-OLIVV和LATV载体中的GP替代了LCMV的GP，剩余的VSV载体主链中没有任何改变。尽管VSV-G(x)-DANDV和-MOPV的复制动力学存在显著差异(VSV-G(x)-LATV和-OLIVV没有测试)，但两种病毒都在30hpi后复制到高于1×10

为了复制动力学的比较，用0.05或0.0005MOI的VSV-GP、VSV-G(x)-DANDV或VSV-G(x)-MOPV感染T75细胞培养烧瓶中的Vero细胞单层。在所示的时间点收集500μl感染细胞的上清液。将上清液在台式离心机中在大约2000rpm下离心5min以除去细胞碎片并储存在-80℃直至进一步处理。按照别处所述的进行了通过TCID50测定[27]的病毒滴度分析和通过qPCR[28]的病毒基因组分析。

实施例4-VSV-G(x)变体的肿瘤细胞杀灭(图7)

细胞系。人Calu6肺癌细胞获自Dr.Edith Lorenz,OncoTyrol(Department ofInternal Medicine，Hematology and Oncology，AG Zwierzina，Innsbruck)。将细胞生长于含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素(Pen/Strep.)的DMEM培养基中。它们达到80％汇合时，每2-3天使用EDTA-胰蛋白酶0.05％将细胞亚培养。源自人前列腺癌的22Rv1细胞由Prof.Z.Culig(Department of Urology,Medical University ofInnsbruck)友情提供。将细胞在含有10％FCS，2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，1mM丙酮酸钠和1％Pen/Strep的RPMI1640中一周亚培养两次。附着性鼠鳞状细胞癌细胞(SCCVII)获自Dr.Lukas Mach(Department of Applied Genetics and Cell Biology，University ofNatural Resources and Life Sciences，维也纳)。将细胞生长于含有10％FCS，2mM谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸(NEAA)，1mM丙酮酸钠和1％Pen/Strep的DMEM中。使用EDTA-胰蛋白酶0.05％，将SCCVII细胞以1:10的比例一周亚培养三次。源自用破坏IFN-I抗病毒反应的LacZ盒稳定转导的Balb/c的CT26Cl.25鼠结肠癌细胞获自ATCC(#CRL-2639)。在含有10％FCS，2％谷氨酰胺，10mM HEPES，0.1mM NEAA，1mM丙酮酸钠，1％P/S和400μg/ml G418的RPMI1640中，将细胞以1:10的比例一周亚培养两次。LLC1细胞从植入原发性Lewis肺癌后带有肺肿瘤的C57BL/6小鼠建立。细胞获自ATCC(#CRL-1642)并在含有10％FCS，4mM谷氨酰胺和1％P/S的DMEM中培养。通过将松散附着的细胞重悬，每3-4天，以1:6至1:10将汇合的细胞培养物亚培养。

VSV杀灭测定。将细胞接种于96-孔平板中并以100μl/孔的体积用10、100、500和1000单位的通用型-1IFN(PBL，Piscataway，NJ，USA)预孵育过夜。第二天早晨，在120μl/孔的终体积中以0.1、1或10MOI用VSV-GP、VSV-G(x)DANDV、VSV-G(x)MOPV或VSV-G(x)OLIVV感染细胞。对于每个条件，进行一式四份的样品。作为阳性杀灭对照，用6.67mM终浓度的H

实施例5：NZW兔子i.v.治疗后的中和抗体

该研究试图评估在健康无肿瘤的新西兰白(NZW)兔中3次静脉内(i.v.)给药后VSVG(x)变体与VSV-GP相比是否不诱导中和抗体(nAb)或诱导较低水平的nAb。NZW兔子用1×10

安全性参数，如动物的健康状况，包括体重(BW)和体温(BT)、全血细胞(WBC)计数、血液化学(任选)和病毒血症(血浆/血液中的TCID50和N-特异性qPCR)是次要目的。

兔子处理和圈养：Crl:KBL(NZW)兔子购自Charles River实验室(法国)。到达动物设施时，兔子大约7周大。将动物以两只一组圈养在兔笼(R-Suite Enriched RabbitHousing，Techniplast)中。通过耳朵上的图案识别个体。每天控制兔子圈养，并监测整体健康状况。在实验期间，保证了食物的随意供应和饮用水的每日更换。在兔子适于处理之前，使它们适应至少4天。兔子适应并处理至少一周后，开始病毒治疗。

NZW兔子的病毒和治疗：用PBS进行病毒稀释。VSV-GP或VSV-G(x)溶液的终浓度为1×10

兔子监测：根据图9呈现的时间表规律地测量体重和体温。用数字温度计通过直肠测量温度。体重使用Ultra MBSC天平记录。

采血和处理：使用23G微型针(Sarstedt，德国)从耳动脉采集血液。在穿刺动脉之前，将耳朵适当剃毛并用酒精垫消毒。在含有50μl肝素(5000IE/ml)的15ml试管中至少收集2ml血液。将100μl肝素血液储存在-80℃下，以通过qPCR分析病毒滴度，将剩余的血液处理为肝素血浆(200μl)，用于TCID50测定或临床化学(300μl)。在第一次治疗前的第-4天和每个治疗周期后的第10天，在15ml的Falcon中收集另外2-3ml血液用于血清制备。另外，在两个预先覆盖EDTA的微量采血管(

通过TCID

白血球计数：使用ScilVet ABC血液计数器测量了使用EDTA血液的白血球计数。该测定需要大约10-20μl的新鲜EDTA血液。根据制造商进行了测量。

处死：根据FELASA和GV SOLAS建议，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉兔子。麻醉后，在右耳静脉中插入导管，并通过心脏穿刺使兔子终末流血。收集没有抗凝剂的血液和肝素血液。根据FELASA和GV SOLAS建议，以致死剂量的戊巴比妥通过静脉导管从麻醉中释放兔子。处死兔子后，取出脾脏，并通过标准程序分离脾细胞用于可选的下游分析(例如，VSV-N特异性T细胞反应)。将血液处理成血清或血浆，将等分试样保存在-80℃直至使用。

中和抗体(nAb)测定：分析在D-4首次治疗之前收集的免疫前血清和每个治疗周期后10天采集的血清样品中是否存在针对VSV-ΔG SEAP GP病毒或用不同的糖蛋白变体假型化的病毒的nAb。通过将p-硝基-苯基磷酸酯(pNPP)酶转化成p-硝基苯基(其通过病毒编码的SEAP在溶液中具有黄色)，测量感染的BHK21Cl.13细胞上清液中的SEAP活性。在405nm下在常规微平板阅读器中读取显色反应，并作为SEAP表达病毒的感染率的间接测量。比较血清和无血清处理的对照样品，nAb测定表明了血清样品中是否含有中和抗体。在不存在nAb的情况下，病毒未被中和，且能够感染BHK21Cl.13细胞，导致SEAP的表达。相反，如果病毒被血清中的抗体中和，则该病毒不能感染细胞，且因此不会表达SEAP。

在病毒中和前一天，使用多通道分配移液管，以每孔100μl cGMEM中1×10

第二天，首先从1:5的最低稀释度开始制备连续的1:5血清稀释度。简而言之，使用多通道分配移液器将每孔200μl cGMEM加入96孔板中。将50μl浓度为100μg/ml的KL25单克隆ΔLCMV GP抗体(分析间对照)或热灭活的(1h，56℃)血清样品加入96孔平板C行的孔中的200μl GMEM，并上下吸移几次进行混合。使用多通道移液器从96孔平板的C行开始直至H行进行五倍系列稀释：将来自C行孔的50μl转移至下一行的孔中，并通过上下吸移几次进行混合。然后将来自D行孔的50μl加入下一行的孔中，诸如此类，直到在H行结束。使用多通道移液器将每孔的175μl血清稀释液转移到干净的96孔平板中。将血清稀释液保存在冰上。96孔平板的A行和B行用作无感染对照(A行)或无血清对照(B行)。

在一天前接种1×10

和

cGMEM的体积[μl]＝(175μl x孔的数量)-需要的病毒储液体积[μl]

随后将175μl病毒溶液加入含有175μl连续血清稀释的B-H行的每个孔中，以制备350μl血清/病毒样品。使用多通道移液器，通过上下吸移一次，将病毒/血清样品混合。将175μl cGMEM加入A行的孔中(无感染对照)。将血清/病毒在冰上孵育1h。

孵育后，将100μl血清/病毒样品一式三份加入前一天接种于96孔平板中的BHK21Cl.13中。细胞应为80-90％汇合。将BHK21Cl.13在37℃，6％CO2和95％湿度下再孵育24h。

第二天，作为SEAP活性的函数测量了nAb活性。简而言之，根据制造商的推荐制备了p-硝基-苯基磷酸酯(pNPP)底物溶液(SIGMA-FAST，Sigma Aldrich)。对于每个96-孔细胞培养物，通过在21ml无菌H

实施例6：Calu6肺肿瘤异种移植模型的治疗(图11)

接受小鼠：八周大的雌性NMRI-Nude小鼠购自Janvier(法国)。将动物以8只动物一组圈养在单独通风的笼子里。为了识别目的，将小鼠耳朵上夹上夹子。在肿瘤移植前，使小鼠适应至少一周。

肿瘤细胞：Calu6肺癌细胞系获自Dr.Edith Lorenz，OncoTyrol(Department ofInternal Medicine，Hematology and Oncology，AG Zwierzina，Innsbruck)。将细胞在含有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长。达到80％汇合时，每2-3天使用EDTA-胰蛋白酶0.05％将细胞亚培养。将细胞以低细胞数接种。移植至NRMI裸鼠中前24h，收集细胞，合并并随后在T175烧瓶中以1:2比例传代。

植入当天，使用EDTA-胰蛋白酶0.05％分离细胞，添加完全培养基，并在KOVAGlasstic载玻片(FisherScientific)中对细胞进行计数。为了确定细胞数，通过在96孔板中反复吸移，将10μl细胞悬液与90μl台盼蓝溶液混合。将20μl的计数混合物转移到KOVAGlasstic载玻片上，计数3个正方形(a、b、c)中的细胞(包括顶部和右侧网格线)，省去蓝色标记的死细胞。每毫升细胞数通过以下等式来确定：((计数(a)+计数(b)+计数(c))/3)×10

Calu6细胞移植至NMRI-Nude接受小鼠中：如上所述制备Calu6细胞，并通过轻轻轻弹试管将其重悬。通过吸入异氟烷麻醉小鼠，使用无菌酒精棉签清洁注射部位。使用带27G针的0.5ml注射器，在右侧皮下(s.c.)皮下给药50μl中的5×10

通过重组VSV载体治疗：当肿瘤的平均大小达到0.05至0.07cm

监测肿瘤生长：治疗后，一周检查动物并测量肿瘤大小至少两次，最多间隔4天。如上所述测量了肿瘤。如果出于伦理原因(例如，就在处死前)在两次之间测量了一只动物的肿瘤大小，则至少测量了该组中的所有动物。每周一次测定小鼠的体重。以下终点标准要求安乐死：(i)肿瘤体积超过0.8cm

实施例7：VSV-GP(x)-DANDV和-MOPV的神经毒性

病毒进入大脑时，野生型VSV感染会引起神经系统症状。这些神经系统并发症包括可能导致受感染者死亡的严重脑炎。使用嵌合VSV-GP的优势在于，已显示几乎不存在神经元感染，从而使VSV-主链成为安全的溶瘤剂。表型减弱的原因被认为是由于通过病毒包膜糖蛋白促进的病毒向性改变。GP糖蛋白的改变或修饰可能会影响VSV-GP的向性谱，因此进行了VSV-G(x)DANV和VSV-G(x)MOPV的神经毒性评估。如针对VSV-LCMV GP所示的，在SwissCD1小鼠直接颅内注射后，VSV-G(x)DANDV和VSV-G(x)MOPV均未显示任何神经毒性迹象(图13)。接受VSV-G DsRed的所有对照小鼠在感染后的第一周内死亡。

小鼠。8周大的雌性Swiss CD-1小鼠购自Janvier(法国)。将动物以5只动物一组圈养在单独通风的笼子中。为了识别目的，将小鼠的耳朵上夹好夹子。在实验开始前，使动物适应至少一周。

病毒。对于每个实验组，将指定的病毒储液在冰上融化。将病毒在PBS中稀释至1×10

立体定向注射。将小鼠称重，并i.p.注射适当剂量的氯胺酮和赛拉嗪(每10g体重100μl)。麻醉开始后，将眼线和枕骨之间的头骨适当剃光，并用软膏(眼霜)保护眼睛。通过将耳棒固定在双侧外耳道中并用下颌棒将上颚围住，将小鼠置于立体定向框架上。在沿中后轴进行中线线性皮肤切口之前，用乙醇中的苯丁二胺消毒清洁皮肤。用离心力从中线刮下盖骨膜骨膜，并用棉签以相同的方式干燥骨头。识别出Bregma后，将固定在立体定向框架中的Hamilton注射器的针尖直接在Bregma上方进行调整。然后，将针向延髓0.4mm和Bregma右侧2mm的目标位置移动，并用手术刀尖端标记该位置，然后再次取出针。使用电钻在目标位置形成毛刺孔，并用PBS湿棉签从损伤处清除骨屑和灰尘。

使用自动注射器的快速反向模式，将注射器中充满制备好的病毒溶液。快速推进注射器柱塞直到针尖形成小液滴，用湿棉签清洁。将针尖定位到毛刺孔延髓0.4mm和Bregma右侧2mm后，将针降低至3mm深的所需坐标。然后开始自动注射程序。注射完成后，将针留在原处1分钟，以防止通过针头轨迹倒流。然后，将针慢慢从大脑和头骨中抽出。使用Vetbond3M闭合伤口前，用PBS清洗损伤。然后，用倍他丁定擦拭伤口以防止感染，并将动物转移到装有加热垫的回收笼中以防止体温过低。

根据FELASA对啮齿类动物术后镇痛的要求提供了术后镇痛。简而言之，在饮用水中经口给予布洛芬30mg/kg/天，持续72小时。从手术结束直到躺卧和完全活动为止，对动物进行监测。在第一天，对动物进行几次监测，然后每天监测伤口部位的打开、排出、发红或其他可能的感染迹象。

神经毒性的评估。治疗后，一天检查动物两次，持续一周或直至所有VSV-G动物已被处死。此后，每天监测动物，直至治疗后40天。评分参数包括体重、动力、外观和身体状况以及神经毒性的临床和诱发行为迹象(图12)。通过累加特定分数来计算累积毒性分数。根据定义的终点标准实施安乐死。

序列表

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

>Danedong NC_010248.1

MGQLITMFEALPHIIDEVINIVIIVLVIITSIKAVYNFATCGIIALISFCLLAGRSCGLYGVTGPDIYKGLYQFKSVEFNMSQLNLTMPNACSANNSHHYISMGKSGLELTFTNDSIISHNFCNLTDGFKKKTFDHTLMSIVASLHLSIRGNTNYKAVSCDFNNGITIQYNLSFSDAQSAINQCRTFRGRVLDMFRTAFGGKYMRSGYGWKGSDGKTTWCSQTSYQYLIIQNRTWENHCEYAGPFGLSRVLFAQEKTKFLTRRLAGTFTWTLSDSSGTENPGGYCLTKWMLIAAELKCFGNTAVAKCNINHDEEFCDMLRLIDYNKAALKKFKEDVESALHLFKTTVNSLISDQLLMRNHLRDLMGVPYCNYSKFWYLEHVKTGDTSVPKCWLVSNGSYLNETHFSDQIEQEADNMITEMLRKDYIKRQGSTPLALMDLLMFSTSAYLISVFLHLMKIPTHRHIKGGTCPKPHRLTSKGICSCGAFKVPGVKTVWKRR

SEQ ID NO:3

SEQ ID NO:4

>Mopeia JN_561684.1

MGQIVTFFQEVPHILEEVMNIVLMTLSILAILKGIYNVMTCGIIGLITFLFLCGRSCSSIYKDNYEFFSLDLDMSSLNATMPLSCSKNNSHHYIQVGNETGLELTLTNTSIIDHKFCNLSDAHRRNLYDKALMSILTTFHLSIPDFNQYEAMSCDFNGGKISIQYNLSHSNYVDAGNHCGTIANGIMDVFRRMYWSTSLSVASDISGTQCIQTDYKYLIIQNTSWEDHCMFSRPSPMGFLSLLSQRTRNFYISRRLLGLFTWTLSDSEGNDMPGGYCLTRSMLIGLDLKCFGNTAIAKCNQAHDEEFCDMLRLFDFNKQAISKLRSEVQQSINLINKAVNALINDQLVMRNHLRDLMGIPYCNYSKFWYLNDTRTGRTSLPKCWLVTNGSYLNETQFSTEIEQEANNMFTDMLRKEYEKRQSTTPLGLVDLFVFSTSFYLISVFLHLIKIPTHRHIKGKPCPKPHRLNHMAICSCGFYKQPGLPTQWKR

SEQ ID NO:5

SEQ ID NO:6

>Ippy NC_007905.1

MGQIITFFQEVPHIIEEVMNIVLITLSLLAILKGVYNVMTCGLIGLISFLLLCGKSCSLIYKDTYNFSSIELDLSHLNMTLPMSCSRNNSHHYVFFNGSGLEMTFTNDSLLNHKFCNLSDAHKKNLYDHALMGIVTTFHLSIPNFNQYEAMACDFNGGNISIQYNLSHNDRTDAMNHCGTVANGVLDAFYRFHWGRNITYIAQLPNGDGTGRWTFCYATSYKYLVIQNISWADHCQMSRPTPIGFASILSQRIRSIYISRRLMSTFTWSLSDSSGTENPGGYCLTRWMLFAADLKCFGNTAIAKCNLNHDEEFCDMLRLIDFNKQALKTFKSEVNHGLQLITKAINALINDQLIMKNHLRDLMGIPYCNYSKFWYLNDTRTGRVSLPKCWMISNGTYLNETHFSDEIEQEADNMITEMLRKEYQERQGKTPLGLVDLFIFSTSFYSITVFLHLIKIPTHRHIVGQGCPKPHRLNSRAICSCGAYKQPGLPTKWKR

SEQ ID NO:7

SEQ ID NO:8

>Latino NC_010758.1

MGQVIGFFQSLPEIINEALNIALICVALLATIKGMVNIWKSGLIQLLFFLTLAGRSCSHSFTIGRFHEFQSVTVNFTQFMSYAPSSCSVNNTHHYFKGPQNTTWGLELTLTNESMINITNSMRVFTNIHHNVTNCVQNISEHEGVLKWLLETMHLSISKPGKHIAPVMCERQKGLLIEYNLTMTKDHHPNYWNQVLYGLAKLLGSSKRLWFGACNKADCQMQSDHQHIKCNYSNCKGYTSFKYLIIQNTTWENHCEYNHLNTIHLLMSSIGQSFITRRLQAFLTWTLSDALGNDLPGGYCLEQWAVVWFGIKCFDNTAMAKCNQNHDSEFCDMLRLFDYNRNAIQSLNDQSQARLNLLTNTINSLVSDNLLMKNKLRELMNVPYCNYTRFWFINDTKNGRHTLPQCWLVSDGSYLNETRFRTQWLSESNSLYTEMLTEEYEKRQGRTPLSLVDLCFWSTLFYISTLFAHLVGFPTHRHLIGEGCPKPHRLTGSGICSCGHYGIPGKPVRWTKMSR

SEQ ID NO:9

SEQ ID NO:10

>Oliveros NC_010248.1

MGQVIGFFQSLPNIINEALNIALICVALIAILKGIVNIWKSGLIQLFIFLILAGRSCSHTFQIGRNHEFQSITLNFTQFLGYAPSSCSVNNTHHYFRGPGNVSWGIELTLTNNSVINASNSLKVFTNIHHNITNCVQNIDEQDHLMKWLIETMHLQIMKPGKRLPPILCEKDKGLLIEYNLTNIASREEKHSEYWSQLLYGLSKLLGSSKSLWFDYCQRADCMMQEHSSHLKCNYSECSGHTTFKYLILQNTTWENHCEFNHLNTIHLLMSSTGQSFITRRLQAFLTWTLSDATGNDLPGGYCLEQWAIVWAGIKCFGNTAVAKCNQNHDSEFCDMLRLFDYNRNAIKSLNDQSQSRLNLLTNTINSLISDNLLMKNKLAEIMNIPYCNYTKFWYINDTRTGRHTLPQCWLISNGSYLNETKFRTQWLSESNALYTEMLTEDYDKRQGSTPLSLVDLCFWSTLFYVTTLFAHLVGFPTHRHILDGPCPKPHRLTKKGICSCGHFGIPGKPVRWVKRSR

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