用于实现LP基因启动子区甲基化程度检测的特异性引物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是指一种用于实现LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度检测的特异性引物在制备预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物中的应用。

背景技术

精神分裂症(SCZ)是最常见的精神障碍，而睡眠障碍是精神分裂症的重要诊断标准之一，也是精神疾病发生的预测信号。睡眠障碍是难治性精神分裂症复发的危险因素，与患者的低生命质量、社会功能缺陷、心血管疾病和高自杀率相关，其发生率为72.4％。

失眠是精神分裂症常见睡眠障碍，包括入睡潜伏期(SOL)延长、夜间觉醒增多、多梦、睡眠感缺乏与早醒等，其中入睡潜伏期延长是精神分裂症特异性的睡眠障碍。多导睡眠图是目前临床上检测各种睡眠障碍的标准方法，包括失眠和入睡潜伏期延长，但临床上尚缺乏预测精神分裂症患者出现入睡潜伏期延长的方法。因此，建立预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的技术方法，对精神分裂症的诊疗有重大意义。

瘦素(Leptin，简称LP)是一种由脂肪组织分泌的激素，它在血清中的含量与动物脂肪组织大小成正比。瘦素作用于位于中枢神经系统的受体(Leptin Receptor)，从而调控生物的行为以及新陈代谢。

目前，对LP的相关研究已广泛存在，并关联到多个方面，例如，文献《In VivoMethylation Patterns of the Leptin Promoter in Human and Mouse》(2006年)指出：LP基因启动子的甲基化通常被强加在合子发育后，这种表现基因型标记可能在调节一种重要的代谢基因的表达上有作用。文献《瘦素基因启动子区-2548G/A多态性与非酒精性脂肪肝的相关分析》(2006 年)指出：血清瘦素水平可作为评价肝功能的临床指标之一，瘦素基因-2548G/A等位基因变异情况可应用于对非酒精性脂肪肝病的预测性分析中。文献《瘦素基因甲基化水平与妊娠期糖尿病的相关性》(2017年)指出：瘦素基因启动子区甲基化动态变化过程与妊娠期糖尿病的发病有一定相关性。文献《饮食诱导肥胖小鼠瘦素及瘦素受体基因启动子甲基化探讨》(2010 年)指出：瘦素基因及瘦素受体基因启动子区CpG位点甲基化可能与饮食诱导肥胖小鼠瘦素抵抗无关。文献《瘦素启动子甲基化在骨关节炎发病中的作用》(2011年)指出：瘦素启动子区域部分位点的去甲基化可能是骨关节炎(OA)发生的始动因素之一，为研究OA的致病机制及治疗提供了新的研究方向。

DNA甲基化的检测通常采用甲基化DNA免疫共沉淀测序技术、甲基化芯片技术、全基因组甲基化测序技术、焦磷酸测序法或质谱法等手段实现，并且在检测过程中，需要对DNA 进行PCR扩增。PCR扩增引物多种多样，而对于LP基因启动子的PCR扩增来说，不同的启动子区域、扩增区域和转录起始位点选择会影响引物的设计、引物扩增性能、扩增结果以及检测目的，例如，文献《瘦素基因启动子区-2548G/A多态性与非酒精性脂肪肝的相关分析》中采用的PCR扩增引物，上游引物为5'-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3'，下游引物为 5'-TTTGCTGTAATTTTCCCGTGAG-3'；文献《瘦素基因甲基化水平与妊娠期糖尿病的相关性》中采用的PCR扩增引物，正向引物为5-TGCGGATTCTTGTGGCTTTGG-3'，反向引物为 5'-GACTGACTGCGTGTGTGAAATGT-3'，β-actin正向引物为 5-TGAAGATCAAGATCATTGCTC-CTC-3'，β-actin反向引物为 5-AACTAAGTCATAGTCCGC-CTAGAAG-3'。文献《瘦素启动子甲基化在骨关节炎发病中的作用》中采用的PCR扩增引物，上游引物为5'-CCAAAACCCTCATCAAGACAATT-3'，下游引物为5'-ACCGCTGACTTTCTGTTTGGA-3'，GAPDH上游引物为 5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'，GAPDH下游引物为 5'-TAAAAGCAGCCCTGGTGACCG-3'。

而在精神分裂症方面，Atmaca等的研究发现，精神分裂症患者血清LP水平比正常对照组明显降低(Serum Leptin and Cholesterol Values in Suicide Attempters，2002年)。Kraus比较了更年期抑郁症、精神分裂症患者、健康对照组BMI及血清LP水平，研究表明各组间BMI 无明显差异，但两患者组血浆LP水平显著低于对照组，而精神分裂症患者血浆LP水平又显著低于更年期抑郁患者(Body Weight,the Tumor Necrosis Factor System,and Leptin Production during Treatment with Mirtazapine or Venlafaxine，2002年)。这说明，LP与精神分裂症本身发生也有关，可以认为LP在精神分裂症的病理机制中起重要作用。但Jow等却研究发现与健康对照组比较，重症抑郁症患者血浆瘦素明显降低，而精神分裂症患者血浆瘦素水平却明显升高(Leptin and cholesterol levels are low inmajor depressive disorder,but high in schizophrenia，2006年)。矛盾的结果说明瘦素在精神障碍中的作用机制十分复杂，尚需进一步的研究证实。

根据已有文献的研究，LP基因启动子区甲基化水平变化与多种疾病的发病均有一定程度上的关联，而上述提到目前临床上尚缺乏预测精神分裂症患者出现入睡潜伏期延长的方法，那么是否可以通过设计恰当的PCR扩增引物并检测LP基因启动子甲基化程度的方式来填补空白，从而为预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的方案提供参考和技术支持，以便完善相关的精神分裂症诊疗方案，则需要本领域技术人员为此开展相应的体系工程研究工作，付出创造性的劳动并进行验证后才能进一步的证实。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于实现LP基因启动子PCR扩增的特异性引物，以便检测 LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度，然后根据LP基因启动子甲基化水平变化，可以为设计预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物、试剂和方法提供参考，进而为完善精神分裂症诊疗方案提供技术支持。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

用于实现LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度检测的特异性引物在制备预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物中的应用，所述的特异性引物包括用于实现LP基因启动子PCR扩增的上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列为： SEQ ID NO.1，所述下游引物的核苷酸序列为：SEQ ID NO.2；特异性引物实现LP基因启动子PCR扩增后，检测LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度。

本发明检测LP基因启动子甲基化程度的方法包括以下步骤：

步骤1，采集精神分裂症患者的静脉血和药物治疗后的静脉血，分别提取基因组DNA，每种静脉血至少提取两个样本；

步骤2，用亚硫酸盐处理DNA样品，低速短暂离心备用；

步骤3，以步骤2中的DNA为模板，使用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物扩增LP基因启动子，获得PCR扩增产物；PCR反应组分还包括双蒸水、10×PCR缓冲液、脱氧核苷、PCR扩增酶，且各组分的含量为双蒸水6.4μL、10×PCR缓冲液1μL、脱氧核苷1μL、5 U/μLPCR扩增酶0.2μL、10pmol/μL上游引物0.2μL、10pmol/μL下游引物0.2μL、DNA模板 1μL；PCR反应程序为A-94℃处理4min、B-94℃处理20sec、C-59℃处理30sec、D-72℃处理1min、E-72℃处理3min、F-4℃处理不小于30min，其中B、C、D循环45次；

步骤4，琼脂糖凝胶电泳检测扩增成功的样品；

步骤5，将扩增成功的样品进行SAP反应，反应组分为去RNA酶双蒸水、SAP酶以及PCR产物，且各组分的含量为去RNA酶双蒸水1.70μL、SAP酶0.30μL以及PCR产物5.00 μL，SAP反应程序为37℃处理20min、85℃处理5min、4℃处理不小于30min；

步骤6，T切/RNase A消化反应，反应组分为去RNA酶双蒸水、5×T7聚合酶缓冲液、T裂解混合液、二硫苏糖醇、T7 RNA&DNA聚合酶、核糖核酸酶以及PCR/SAP混合物，且各组分的含量为去RNA酶双蒸水3.21μL、5×T7聚合酶缓冲液0.89μL、T裂解混合液0.22μL、 100mM二硫苏糖醇0.22μL、T7 RNA&DNA聚合酶0.40μL、核糖核酸酶0.06μL以及PCR/SAP 混合物2.00μL；

步骤7，树脂纯化；

步骤8，芯片点样；

步骤9，将点样后的芯片使用MALDI-TOF分析，计算出DNA样品甲基化程度。

本发明主要设计原理如下：

1、Leptin序列基本信息，数据来源：NCBI，染色体：7号，距转录起始位点TSS(g) 距离：-5000～+1000bp，染色体位置：128236278～128242277，c为转录起始位置，下划线标记为本发明方案的核酸扩增区域。

序列信息如下：

actgctgaataccagcagctgggtgtcctcagcaaccatgtccacatgaagcatcttagtctcacccactccttctgtgtctctaCGagca gcattgagctgtagatgggaaagtgtatggaaatatgatcactttttccctagggcaaagagggttggtgttcttttcttcaaaatttattttgaatctgt cttttctgtctccccactacccctcactcatgctcctgagtcactgctgagctccagggctgtacctttctcattttggaatctctaggatctagcatagtacccagtgcacagtatgccttcaatgtatgcctcttggttcaatgaatgaatgcatgaaaaaatgggcaaataagtaagttttaataatttgtcacctt gatttttatttcttgcaatccttcctgtatttcttgcaatccttgttttattccttgcaatccttcctatatgtctctgccagttgaatcttccaaagtggtgact CGaccaCGtgaatctcctctggtgactttaatggctcccactgtctgCGaaggcctttcaaaacccagctgcttgttacctttctttgcaaggattttctctctcactcctcaaagctccattctggctgacttggcctctctgtatcctttcctgcccttgttgagttgcccttttctctgtgtagccacttagctgc ctgtgctgatacttgctgctggctaagcttgtcataagttcagtgtgacaccctttccCGtgatgggctgattacagtaaggtcccaatctagtggt gcctccctctattgctgggttgggtaatctcccagttactctgggtttgaccatgtgacttgctttggtcaacaggaaacaggatgttagcagagact tgaaaagtgcttgctcattggggtttgccatcttttgctgctctagggaatccagcagctgtcaccatgtaaacaagcccaggctagaccagttacc ctcatcatcttagctgatagccagccagccaccacaggcatgagtcaggccatattgctggacccacagaattatgagctaaataaatagtcttgg gttaagccactaagttttaggcatagtgtgttatgtatctcacaaacatataagactgtgtgtttgttgactggaggaagagatgctataaagaccac cttttaaaacttcccaaatactgccactgatgtcctgatggaggtatgaaaacatccactaaaatttgtggtttattcatttttcattattttgtttaaggag gtctatagtggaagagggagatatttggggaaattttgtatagactagctttcaCGatgttagggaattattattgtgtgataatggtcttgcagttac acagaaattcttccttattttttgggaagcaccaaagtagggataaaatgtcatgatgtgtgcaatacactttaaaatgtttttgccaaaataattaatga agcaaatatggaaaataataattattaaatctaggtgatgggtatattgtagttcactatagtattgcacacttttctgtatgtttaaatttttcatttaaaaa actttgagctagacaccaggctatgagctaggagcatagcaatgaccaaatagactcctaccaactcaaagaatgcacattctctgggaaacatg tttccattaggaagcctCGaatgcaatgtgactgtggtctccaggacctgtgtgatcctggcttttcctgttccctcCGcatcatcactgcaggtgt gttttcccaagttttaaacatttaccttcccagtggccttgCGtctagaggaatccctgtatagtggtacatgaatataacacataacaaaaatcatct ctatggtgtgtgttgttcctggggttcaattcagcaaattttccctgggcacccatgtgttcttggcactggaaaagtacCGggactgaaacagttg atggcccaatccctgtcctcttaaaacctaagggaggagatggaaaggggcacccaacccagactgagagacaggaattagctgcaagggg aactaggaaaagcttctttaaggatggagaggccctagtggaatggggagattcttcCGggagaagCGatggatgcacagttgggcatccc cacagaCGgactggaaagaaaaaaggcctggaggaatcaatgtgcaatgtatgtgtgttccctggttcaagggctgggaactttctctaaagg gccaggtagaaaacattttaggctttctaagccaaggcaaaattgaggatattacatgggtacttatacaacaagaataaacaatttacacaatttttt gttgacagaattcaaaactttatagacacagaaatgcaaatttcctgtaattttcccatgagaactattcttcttttgttttgttttgCGacagggttgC GctgatcctccCGcctcagtctccctaagtgctgagatgttgcaggaagtcagggacccCGaacagagagatCGgctggagcCGtggc agaggaacataaattttgaagatttcattttaatatggacacttatcagttcccaaataatacttttataattttttatgcctgtctttgctttaatctcttaatc ctgttatcttcataagctaaggatgtaCGtcacctcaggaccactgtgataattgtgttaactgtacagattgattgcaaaacatgtgtgtttgaaca atatgaaatcagtgcaccttgaaaaagagcagaataacagcaatttttagggaacaagggaagacaactataaggtctgactgcctgCGgggt CGggcaaagggagccatatttttcttcttgcagagagcctataaatagacctgcaagtaggagagatattgctaatttcttttgctagcatggaata ttaatattaacaccctgggaaaggaatgcattcctggggggaggtctataaatggcCGctctgggaatgtctatcctaCGcaatggagataag gactgagataCGccctggtctcctgcagtaccctcaggcttactagggtggtgaaaaactcCGccctggtaaatttgtggtcagaccagttttct gctctCGaacactgttttctgttgtttaagatgtttatcaagacaataCGtgcacCGctgaacacagacccttatcagtagttctcctttttgccctt tgaagcatgtgatctactccctgttttacaccccctcaccttttgaaacccttaataaaaaacttgctggtttgaggctcaggtgggcatcacagtact acCGatatgtgatgtcaccccCGgCGgcccagctgtaaaattcctctctttgtactctctctctttatttctcagccagctgacacttatggaaaat agaaagaacctaCGttgaaatattgggggcaggttcccccaatatctggtgcccaaCGtgggatactgagattacaagcatgagccactgca tctggcctcttcttttgatttttttttttcaaacttttacaaatgtagaaaccattcttagcttttgggcattaccaaaccCGgcagtggcaggctCGgtt caccaaCGtcatttgcagttcccCGctttatgttatgggttttgttttgttttgttttttttattgagacagagtttcactcttgttgcccaggctgtagtg caatggtctgatcttggctcactgcaacctccacttcccaggttcaagccattctcctgcctcagcctctcaagtagctgggattacagacactcac caccacacctggctaattttgtatttttagtagagatgaggtttcaccatgttggccaggctggtctCGaaatcctgacctcaggtgatccacccaccttggcctcccaaagtgctgggattacaggcttgagctaccaCGcctggctgggttggttctcaatggagtggtttgtttttggagctgctctgC GcagtggggaccagaataggcctgggttcctagcccattgctattccttaccagctgtggattctaaggaaagtcatttaacctCGctggacctt agattcctcatccctgaagcccaagggtaaaacaaaacaaaacaaaacaaaacaaaccaacccatcatgtaaagCGgggaactacaaaCG atacaggtgaaacatgcctaccacaccactcacaggctatgatgacaaaaaCGtggctacatctgggaccaccccccaacccccactttgtaC GtaggaaataCGgagttgaggatggagacccacagtatgtccagagtgtccccaaaggccacagtgccCGcctggagccctccagagag CGtgcactccctggggtgccagccag

2、用Agena EpiDesigner程序对该序列进行引物方案设计，结果如下：

引物信息：

5’端引物序列：

aggaagagag AGATAATTTGTTTTGAGGTTTGGAA(SEQ ID NO.1)

3’端引物序列：

cagtaatacgactcactatagggagaaggct AAAATCCTTAATATCCCTCCAAAAA(SEQ IDNO.2)。

引物说明：小写部分为T7 RNA聚合酶启动子区的互补序列，大写部分是将样本DNA使用亚硫酸盐处理后的序列(5’端)或互补序列(3’端)(没有甲基化的C全部转化为U，U相当于DNA中的T)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明以LP基因启动子区甲基化作为药物靶点为目的导向，基于体系工程的研究结果，确定了启动子区域、扩增区域、转录起始位点以及位点甲基化检测，并设计了一对特殊的扩增引物，在实现LP基因启动子PCR扩增(扩增区域为上述序列信息下划线标记处) 后，得到带有T7 RNA聚合酶启动子序列的扩增产物，然后结合SAP反应、T切/RNase A消化反应、树脂纯化、芯片点样、MALDI-TOF分析等手段，最终计算出LP基因启动子在第 65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度。如此一来，根据LP基因启动子区甲基化水平变化，可以辅助预测精神分裂症患者(尤其是首发精神分裂症患者)入睡潜伏期延长的情况，进而为完善精神分裂症诊疗方案提供技术支持，并使得以LP基因启动子区甲基化作为靶点的药物有望成为干预精神分裂症患者入睡潜伏期延长的一种新手段。

(2)本发明设计的特异性引物，一次可检测100～700bp的目标序列，并可得到单个的 CpG unit或CpG site的甲基化程度定量信息，其定量数据的标准差(standarddeviation)为0.05；且该特异性引物特异性强，很好地避开了GC区域，具有灵敏度高、扩增迅速、扩增效率和成功率高、非特异性产物量少的特点，可以方便快捷地在分子水平上为实现预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长提供可靠保障。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，本发明的实施包括但不限于以下实施例。

实施例

一、样品制备收集包括筛选入组符合DSM-IV诊断标准的SCZ患者；年龄≥18岁，罹患精神分裂症不超过1年，未用过抗精神病药物治疗干预。排除标准(如果受试者不能符合其中任何一条)：1、其他严重的神经精神疾病(阿尔兹海默病、帕金森病、抑郁症、双向情感障碍等等)；2、物质依赖与滥用者，尼古丁与酒精使用除外；3、重度营养不良以及内分泌、严重心、肾功能疾病(肾病综合征、急慢性肾衰等)；4、服用相关药物过敏史；5、肿瘤和其他系统性疾病。

二、基线(用奥氮平治疗前5日内)：对入组的精神分裂症患者记录一般情况资料(住院病历摘录)，使用多导睡眠监测仪测量其睡眠，然后采集静脉血，提取基因组DNA。

三、用奥氮平治疗后8周(第二次)：以多导睡眠监测仪测量其睡眠，然后采集静脉血，提取基因组DNA。

四、提取的DNA放置于﹣80℃冰箱内保存。

重亚硫酸盐处理后利用实时荧光定量PCR扩增，然后检测LP基因启动子甲基化修饰程度。整个检测流程如下：

步骤1.使用亚硫酸盐将样本DNA中没有甲基化的C全部转化为U(相当于DNA中的T)；

步骤2.使用特殊设计的一对引物(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2)扩增样本，得到带有 T7 RNA聚合酶启动子序列的扩增产物；

步骤3.在体外转录体系中，利用T7 RNA聚合酶，将扩增产物转录为RNA片段；该聚合酶专门催化5'→3'方向的RNA形成过程；

步骤4.在步骤3的体系中，利用RNase A能够特异性识别并切割RNA中U 3’端的特性，将RNA片段切割成携带有CpG位点的小片段。

步骤5.使用Agena

1、PCR扩增反应

(1)样本进行NaHSO3处理后，低速短暂离心备用。

(2)按表1所示配制PCR反应溶液(反应体系配制过程在冰上完成，防止在高温中长时间暴露而失活)。

表1.Agena MassArray系统甲基化检测扩增PCR反应组分

(3)扩增PCR反应程序：

(4)取PCR产物3μl与1μl 6*loading buffer混匀，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，160V、 20min后观察结果，如结果良好可继续后续实验。

(5)样本扩电泳图用以验证PCR扩增成功与否：

1)C05、D05、C06、D06、C07、D07、C08、D08、D09、C04、C03、C02为用奥氮平治疗后8周后(治疗后)的样本，C09、D09、C10、D10、C11、D11、C12、D12、D13、 D14、D15、D16为同一主体(C05对应C09、D05对应D09……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，其中C05与D10无扩增条带，扩增失败，其余的全部扩增成功。

2)A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21、A22为用奥氮平治疗后8周后(治疗后)的样本，A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、 A11为同一主体(A12对应A01、A13对应A02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，全部扩增成功。

3)B13、B14、B15、B16、B17、B18、B19、B20、B21、B22、B23、B24为用奥氮平治疗后8周后(治疗后)的样本，B01、B02、B03、B04、B05、B06、B07、B08、B09、B10、 B11、B12为同一主体(B13对应B01、B14对应B02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，全部扩增成功。

4)E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20、E21、E22为用奥氮平治疗后8 周后(治疗后)的样本，E01、E02、E03、E04、E05、E06、E07、E08、E09、E10、E11为同一主体(E12对应E01、E13对应E02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前) 的样本，全部扩增成功。

5)F13、F14、F15、F16、F17、F18、F19、F20、F21、F22、F23、F24为用奥氮平治疗后8周后(治疗后)的样本，F01、F02、F03、F04、F05、F06、F07、F08、F09、F10、F11、 F12为同一主体(F13对应F01、F14对应F02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，全部扩增成功。

6)G13、G14、G15、G16、G17、G18、G19、G20、G21、G22、G23、G24为用奥氮平治疗后8周后(治疗后)的样本，G01、G02、G03、G04、G05、G06、G07、G08、G09、 G10、G11、G12为同一主体(G13对应G01、G14对应G02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，全部扩增成功。

7)H13、H14、H15、H16、H17、H18、H19、H20、H21、H22、H23、H24为用奥氮平治疗后8周后(治疗后)的样本，H01、H02、H03、H04、H05、H06、H07、H08、H09、 H10、H11、H12为同一主体(H13对应H01、H14对应H02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，全部扩增成功。

8)J13、J14、J15、J16、J17、J18、J19、J20、J21、J22、J23、J24为用奥氮平治疗后8 周后(治疗后)的样本，J01、J02、J03、J04、J05、J06、J07、J08、J09、J10、J11、J12为同一主体(J13对应J01、J14对应J02……，以此类推)用奥氮平治疗前5日内(治疗前)的样本，全部扩增成功。

结果：在188例PCR扩增验证中，仅有2例扩增失败，扩增成功率约为98.9％。

2、SAP反应

1)SAP反应体系如下(表2)：

表2.MassArray系统甲基化检测SAP反应组分

2)384反应板的每个孔中加入7μl SAP反应液，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序。

3)SAP反应程序：

3、T切/RNase A消化反应，利用RNase A能够特异性识别并切割RNA中U 3’端的特性，将RNA片段切割成携带有CpG位点的小片段。由于RNaseA特异性切割U3’端，因此如果两个CpG位点之间的序列没有U(对应DNA的T)，那么这两个位点在检测时将作为一个整体进行检测，得到的甲基化程度数值为二者的平均值。

1)T切/RNase A消化反应体系如下(表3)：

表3.T切反应/RNase A消化反应组分

2)T切/RNase A消化反应条件：37℃孵育3h。

4、树脂纯化

在384/6MG Dimple板里均匀填充树脂并放置10分钟使其晾干。

向384样本板的每个孔中加16μl水。

将384样本板轻扣在Dimple板上，翻转后轻敲使树脂使之落入样本板的每个孔中。

将384样本板用封口膜密封后置于翻板离心机中室温旋转混匀30分钟。

5、芯片点样：启动MassARRAY NanodispenserRS1000点样仪，将树脂纯化后的产物移至384-well

6、Massarray分析及数据输出。将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析。检测结果使用EpiTYPER

五、处理数据：对治疗前后首发精神分裂症患者入睡潜伏期延长时长和减少程度与LP基因启动子甲基化水平变化进行配对t检验、相关和回归分析。

六、验证

甲基化程度是根据MALDI-TOF分析含G峰和含A峰的面积比较，计算出待检样品甲基化及非甲基化程度，属于两者相对定量比值。

(1)用药前D09、C10、C11、D11、C12、D12、D13、D14、D15、D16在第65bp处的 CpG2位点的甲基化程度为：0.17、0.1、0.12、0.13、0.1、0.11、0.12、0.12、0.17、0.18；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.14、0.09、0.11、0.12、0.09、0.13、0.13、0.09、0.15、0.14；用药后D05、C06、C07、D07、C08、D08、D09、C04、C03、C02的CpG2位点的甲基化程度为：0.08、0.07、0.04、0.08、0.08、0.1、0.03、0.07、0、0；CpG6位点的甲基化程度为：0.08、0.04、0.09、0、0.1、0.09、0.02、0.09、0.09、0.08。用药前CpG2、6位点的甲基化程度均高于用药后。

(2)用药前A01、A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、A09、A10、A11在第65bp 的CpG2位点的甲基化程度为：0.14、0.18、0.19、0.12、0.12、0.12、0.08、0.09、0.1、0.1、 0.1；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.14、0.18、0.19、0.12、0.12、0.12、0.08、 0.09、0.1、0.1、0.1；用药后A12、A13、A14、A15、A16、A17、A18、A19、A20、A21、 A22的CpG2、6位点的甲基化程度均为：0.1、0.16、0.13、0.06、0.04、0.07、0.05、0.09、 0.07、0.09、0.07。用药前CpG2、6位点的甲基化程度均高于用药后。

(3)用药前B01、B02、B03、B04、B05、B06、B07、B08、B09、B10、B11、B12在第65bp的CpG2位点的甲基化程度为：0.12、0.08、0.3、0.14、0.17、0.08、0.19、0.12、0.11、 0.1、0.09、0.75；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.12、0.08、0.3、0.14、0.17、 0.08、0.19、0.12、0.11、0.1、0.09、0.75；用药后B13、B14、B15、B16、B17、B18、B19、 B20、B21、B22、B23、B24的CpG2、6位点的甲基化程度均为：0.08、0.06、0.06、0.07、 0.11、0.06、0.08、0.1、0.07、0.03、0.06、0.07。用药前CpG2、6位点的甲基化程度均高于用药后。

(4)用药前E01、E02、E03、E04、E05、E06、E07、E08、E09、E10、E11在第65bp 的CpG2位点的甲基化程度为：0.14、0.17、0.15、0.11、0.12、0.12、0.09、0.09、0.19、0.14、 0.08；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.14、0.17、0.15、0.11、0.12、0.12、0.09、 0.09、0.19、0.14、0.08；用药后E12、E13、E14、E15、E16、E17、E18、E19、E20、E21、 E22的CpG2、6位点的甲基化程度均为：0.1、0.08、0.13、0.08、0.06、0.09、0.04、0.04、 0.06、0.05、0.06。用药前CpG2、6位点的甲基化程度均高于用药后。

(5)用药前F01、F02、F03、F04、F05、F06、F07、F08、F09、F10、F11、F12在第 65bp的CpG2位点的甲基化程度为：0.11、0.13、0.1、0.06、0.05、0.08、0.14、0.11、0.11、 0.12、0.1、0.14；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.15、0.12、0.09、0.05、0.1、 0.08、0.16、0.1、0.07、0.13、0.07、0.06；用药后F13、F14、F15、F16、F17、F18、F19、 F20、F21、F22、F23、F24的CpG2位点的甲基化程度为：0.1、0.08、0.05、0.03、0、0.05、 0.13、0.03、0.07、0.09、0.09、0.12；CpG6位点的甲基化程度为：0.11、0.08、0.09、0.03、 0.04、0.09、0.15、0.09、0.09、0.02、0.06、0.05。用药前CpG2、6位点的甲基化程度均高于用药后。

(6)用药前G01、G02、G03、G04、G05、G06、G07、G08、G09、G10、G11、G12 在第65bp的CpG2位点的甲基化程度为：0.1、0.1、0.09、0.08、0.08、0.09、0.08、0.12、0.08、 0.09、0.15、0.19；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.13、0.14、0.13、0.13、0.12、 0.18、0.15、0.12、0.05、0.08、0.1、0.15；用药后G13、G14、G15、G16、G17、G18、G19、 G20、G21、G22、G23、G24的CpG2位点的甲基化程度为：0.08、0.07、0.06、0.06、0.06、 0.07、0.07、0.1、0.07、0.02、0.1、0.11；CpG6位点的甲基化程度为：0.07、0.13、0.1、0.07、 0.11、0.1、0.11、0.08、0.04、0.05、0.08、0.08。用药前CpG2、6位点的甲基化程度均高于用药后。

(7)用药前H01、H02、H03、H04、H05、H06、H07、H08、H09、H10、H11、H12 在第65bp的CpG2位点的甲基化程度为：0.17、0.16、0.08、0.07、0.06、0.17、0.14、0.13、 0.07、0.06、0.13、0.18；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.18、0.1、0.15、0.12、 0.17、0.11、0.07、0.15、0.09、0.08、0.09、0.1；用药后H13、H14、H15、H16、H17、H18、 H19、H20、H21、H22、H23、H24的CpG2位点的甲基化程度为：0.1、0.13、0.06、0.18、 0.06、0.08、0.1、0.06、0.04、0.08、0.07、0.08；CpG6位点的甲基化程度为：0.1、0.1、0.08、 0.16、0.09、0.08、0.1、0.16、0.07、0.06、0.07、0.1。除个别的甲基化程度是用药前低于等于用药后的情况外(可能是检测仪器被污染、患者体质差异等原因造成)，其余绝大部分均是用药前CpG2、6位点的甲基化程度高于用药后。

(8)用药前J01、J02、J03、J04、J05、J06、J07、J08、J09、J10、J11、J12在第65bp 的CpG2位点的甲基化程度为：0.2、0.11、0.12、0.12、0.08、0.07、0.15、0.14、0.1、0.06、 0.15、0.13；在第105bp处的CpG6位点的甲基化程度为：0.15、0.09、0.11、0.11、0.07、0.13、 0.09、0.06、0.15、0.14、0.09、0.11；用药后J13、J14、J15、J16、J17、J18、J19、J20、J21、 J22、J23、J24的CpG2位点的甲基化程度为：0.12、0.14、0.08、0.08、0.08、0.1、0.12、0.1、 0.05、0.07、0.05、0.12；CpG6位点的甲基化程度为：0.09、0.12、0.06、0.06、0.09、0.11、 0.1、0.14、0.08、0.11、0.08、0.05。除个别的甲基化程度是用药前低于等于用药后的情况外 (可能是检测仪器被污染、患者体质差异等原因造成)，其余绝大部分均是用药前CpG2、6 位点的甲基化程度高于用药后。

同时，患者用药后入睡潜伏期普遍缩短，给药前入睡潜伏期时长在39.60±20.17min，给药后入睡潜伏期时长在32.45±11.23min，给药前后入睡潜伏期(min)具有统计学意义的差异 p＝0.039(<0.05)。

综上可知：

1、基于选择的启动子区域、扩增区域和转录起始位点，本发明设计的特异性引物，在用于实现LP基因启动子PCR扩增时，成功率高达98％以上，且灵敏度高、扩增迅速，充分满足了LP基因启动子区甲基化程度检测的前置基础和条件。

2、根据用药前后LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度和给药前后入睡潜伏期的差异比较可知，两者为正相关的关系。并且采用本发明设计的特异性引物和检测方法检测LP基因启动子甲基化程度，结合用药干预的情况(例如奥氮平)和相关性分析，确定了LP基因启动子在第65bp与105bp处的CpG2、6位点的甲基化程度可以在精神分裂症患者入睡潜伏期方面，为制备预测精神分裂症患者入睡潜伏期延长的药物、试剂和方法提供参考，从而为完善精神分裂症诊疗方案提供技术支持，并使得以LP基因启动子区甲基化作为靶点的药物有望成为干预精神分裂症患者入睡潜伏期延长的一种新手段，其意义非常重大。

上述仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 内蒙古医科大学

<120>用于实现LP基因启动子区甲基化程度检测的特异性引物及其应用

<130> 20200201

<150> 2020101102830

<151> 2020-02-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggaagagag agataatttg ttttgaggtt tggaa 35

<210> 2

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagtaatacg actcactata gggagaaggc taaaatcctt aatatccctc caaaaa 56