检测脓毒症病原体的引物组合物、及其核酸检测试剂盒、检测方法

技术领域

本发明涉及病原体的检测和诊断技术领域，具体涉及检测脓毒症病原体的引物组合物、及其核酸检测试剂盒、检测方法。

背景技术

脓毒症可以由任何部位的感染引起，临床上常见于肺炎、腹膜炎、胆管炎、泌尿系统感染、蜂窝织炎、脑膜炎、脓肿等，指各种细菌或真菌进入血液循环，大量繁殖并产生毒素，诱发机体产生的全身炎症反应综合症。脓毒症是急危重症医学面临的重要临床问题，全球每年脓毒症患病人数超过1900万，其中有600万患者死亡，病死率超过1/4，存活的患者中约有300万人存在认知功能障碍。早期识别与恰当处理对改善脓毒症患者的预后很关键。其病原微生物包括细菌、真菌、病毒及寄生虫等，又以肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、曲霉菌、肺炎链球菌、粪肠球菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、脑膜炎奈瑟菌、B族链球菌最为常见。

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是成人及儿童血流感染的重要细菌之一，其感染也是脓毒症患儿入住重症监护室的主要原因，2012年中国15所医院送检的血标本培养监测结果显示，在共分离得到的8490菌株中，金黄色葡萄球菌占7.2％，居第5位，其发病率及病死率极高，快速确诊及精准治疗能够显著改善金黄色葡萄球菌脓毒症患儿预后。

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，也称为大肠杆菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染。大肠埃希氏菌是动物肠道中的正常寄居菌，其中很小一部分在一定条件下引起疾病。大肠埃希氏菌的血清型能够引起人体或动物胃肠道感染，主要是由特定的菌毛抗原、致病性毒素等感染引起的，除胃肠道感染以外，还会引起尿道感染、关节炎、脑膜炎以及败血型感染等。

肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)常见的肺部感染后导致呼吸困难，甚至呼吸衰竭一系列病理反应，最后多脏器衰竭死亡的病例也不难见到。肺炎克雷伯杆菌肺炎时细菌生长繁殖快渗出液枯稠，引起肺泡壁和肺组织坏死、液化及胸膜受累。临床表现为：突然起病、寒战、高热、咳喉、咯痰、胸痛、甚至出现肺性脑病。若不及时治疗，病变可很快扩展，最后致脓毒症，多脏器衰竭等，肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近期逐年增高，且多耐药性菌株的不断增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。

粪肠球菌(Enterococcus faecalis)可引起医源感染，最常见为尿道感染(大部分与尿道器械操作、导尿等有关)。其次为腹部和盆腔等部位的创伤和外科术后感染。

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，该菌是医院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引发脓毒血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。鲍曼不动杆菌已经成为医院感染的主要来源，尤其是重症监护室。该病菌因为抗生素的滥用，导致鲍曼不动杆菌产生抗药性，目前对抗多重抗药性鲍曼不动杆菌的方法只有用后线抗生素如老虎霉素。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是引起医院内感染常见的条件致病菌之一，具有检出率高、耐药性强、致死率高等特点，是呼吸系统常见的耐药菌之一，更易导致全身炎症反应综合征、脓毒症和多脏器功能衰竭。

嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一种严格需氧革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界。该菌为条件致病菌，过往由于其发病率低，未引起重视，由于近年来广谱抗生素、免疫抑制剂的使用及各种侵入性治疗等，其分离率呈上升趋势，并已成为院内感染的重要致病菌之一，其临床分离率在非发酵菌中仅次于铜绿假单胞菌和不动杆菌。

肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是儿童社区获得性感染最常见的病原，可引起脓毒症，严重感染时导致脓毒性休克、死亡等不良预后的发生，给社会带来了沉重的医疗及经济负担。早期识别、及时治疗可能发展为脓毒性休克、死亡的高危患儿，可有效地改善肺炎链球菌脓毒症患儿的预后。因此探究儿童肺炎链球菌脓毒症不良预后的早期预测指标、合理治疗时机有重要临床意义。

脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)又名脑膜炎奈瑟菌或脑脊髓膜炎双球菌，简称为脑膜炎球菌，是一种革兰氏阴性菌，因其所导致的脑膜炎而闻名，亦会造成脑膜炎球菌血症(一种致命性的败血症)。它只感染人类，并无寄生的动物，是唯一令细菌性感染脑膜炎成为流行病的病菌。约10％成人的鼻咽中有它的踪迹。

曲霉菌(Aspergillus)分为致病性真菌和条件致病性真菌。致病性真菌本身具有致病性，条件致病性真菌致病性低，通常不感染正常人，但正常人大量接触后或免疫功能低下者易感染，由致病曲霉菌所引起的疾病。致病菌主要经呼吸道心如侵犯肺部，也可侵犯皮肤、黏膜。严重者可发生败血症，使其他组织和系统受累。

阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)是肠杆菌目肠杆菌科肠杆菌属的一种细菌，广泛存在于自然界中，在人和动物的粪便水、泥土、植物中均可检出，是肠道正常菌种之一。阴沟肠杆菌已成为医院感染越来越重要的病原菌，其引起的细菌感染性疾病，常累及多个器官系统，包括皮肤软组织感染、泌尿道感染呼吸道感染以及败血症等，给临床治疗带来了新的挑战。

B族链球菌(group B streptococcus)侵入血液循环后繁殖、播散，释放毒素与代谢产物，诱导细胞因子诱发全身感染，GBS脓毒症患儿缺乏特殊的临床表现，在诊断中存在较大困难，病情变化的观察也缺乏客观、定量的指标，快速精准治疗可为新生儿脓毒症的预防与治疗提供可靠的参考依据。

长期以来，病原体感染导致的脓毒症的常规检测方法是培养法，一直被视为病原体检测的“金标准”，但是该方法对样本采集，保存的要求较高，同时培养条件要求严格，具有耗时，易污染等不足之处，无法满足快速精准检测的要求。近年来宏基因组测序技术也在此领域加以应用，但是也同样会带来一些问题，检测时间久、数据量巨大分析困难、检测费用高患者难以承受等缺陷。

环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)技术除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，在应用阶段对仪器的要求低，一个简单的恒温装置就能实现反应，结果检测也非常简单，直接肉眼观察白色沉淀(从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色)或者荧光即可，解决了核酸诊断中设备昂贵、程序复杂等难题。LAMP反应仅需一种具有链置换活性的DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶)及针对靶基因6-8个区域设计的4-6条引物(其中F3/B3和FIP/BIP为必需引物，LF/LB为可选引物)便可在60℃～66℃的恒定温度下实现几十分钟内大于10

然而，近年来LAMP技术在实验室中的实际应用相对局限，进展相对缓慢，其原因在于：(1)当前的LAMP体系难以实现真正意义上的高通量检测，有待于进一步完善；(2)虽然LAMP体系在检测过程中无需升降温，可以大大加快反应速度，实现快速、高效检测，然而LAMP体系的稳定性较差，且LAMP扩增中由于引物数目众多，加剧了引物来源的非特异扩增问题，包括引物内部的非特异性扩增(空白对照体系中出现假阳性)和引物与模板的非特异性结合扩增，所述非特异性扩增的问题严重限制了该技术的实际应用。

针对单一病原体的检测存在上述问题，而针对同时检测多种病原体而言，上述问题更难以解决，无论是不同病原体的引物组的设计，还是不同引物组在相同条件下同时反应达到理想灵敏度、特异性均具有挑战性。这是由于不同的引物组恒温扩增成环效率差别较大，能够让脓毒症的多种、尤其是10种以上(例如12种)病原体的引物组在相同系统条件下的扩增效率相近十分困难。

本发明提出针对脓毒症病原体核酸一体化恒温扩增技术，其通过优化的环引物等手段来实现10种以上病原体的同时检测，弥补针对脓毒症多种病原体检测技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。具有检测快速、灵敏度高、特异性强、操作方便等优点。同时，结合微流控芯片技术，可以实现病原体检测的高通量、防污染等特点。能够实现对复杂样本的多靶标的同时检测，极大的提高检测效率。

发明内容

本发明的目的是将临床脓毒症感染的样本进行病原体核酸检测，通过微流控技术，在芯片中完成样本核酸提取纯化以及多靶点恒温扩增检测一体化过程，大大提高微流控芯片的检测通量，缩短检测时间，简化操作流程，可同时检测十余种病原体，均具有高灵敏度及特异性。

在本发明的第一方面中，提供了一种检测脓毒症病原体的引物组合物，所述引物组合物包括金黄色葡萄球菌引物组、肺炎克雷伯菌引物组、大肠埃希氏菌引物组、粪肠球菌引物组、鲍曼不动杆菌引物组、铜绿假单胞菌引物组、嗜麦芽窄食单胞菌引物组、肺炎链球菌引物组、脑膜炎奈瑟菌引物组、曲霉菌引物组、阴沟肠杆菌引物组和B族链球菌引物组中的至少一组；其中，

所述金黄色葡萄球菌引物组包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5所示的引物；所述肺炎克雷伯菌引物组包括SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10所示的引物；所述大肠埃希氏菌引物组包括SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:15所示的引物；所述粪肠球菌引物组包括SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:20所示的引物；所述鲍曼不动杆菌引物组包括SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:25所示的引物；所述铜绿假单胞菌引物组包括SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:30所示的引物；所述嗜麦芽窄食单胞菌引物组包括SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:34所示的引物；所述肺炎链球菌引物组包括SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:39所示的引物；所述脑膜炎奈瑟菌引物组包括SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:45所示的引物；所述曲霉菌引物组包括SEQ ID NO:46至SEQ IDNO:51所示的引物；所述阴沟肠杆菌引物组包括SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:57所示的引物；所述B族链球菌引物组包括SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:62所示的引物。

在一些实施方案中，所述的检测脓毒症病原体的引物组合物进一步包括用于扩增内标片段的对照引物组，所述对照引物组包括SEQ ID NO:63～SEQ ID NO:66所示的引物。

在本发明的第二方面中，提供了一种环介导等温扩增试剂，其包括上述的引物组合物中的任一引物组，以及dNTP、牛血清白蛋白、MgSO

在一些实施方案中，所述链置换型DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。

在本发明的第三方面中，提供了一种脓毒症病原体核酸检测试剂盒，其包括微流控芯片和核酸提取试剂，其中所述微流控芯片的反应孔中包埋有上述的环介导等温扩增试剂。

在一些实施方案中，所述环介导等温扩增试剂通过以下方式包埋在所述微流控芯片的反应孔中：

采用针式芯片点样仪，将针对不同病原体的环介导等温扩增试剂分别点样在微流控芯片的不同的反应孔中；

将点样后的微流控芯片放入真空干燥箱中，在室温下，在50～100Pa的真空条件下，干燥10～30分钟，环境湿度在40～60％。

在一些实施方案中，所述微流控芯片包含多个反应孔，分别包埋有含金黄色葡萄球菌引物组、肺炎克雷伯菌引物组、大肠埃希氏菌引物组、粪肠球菌引物组、鲍曼不动杆菌引物组、铜绿假单胞菌引物组、嗜麦芽窄食单胞菌引物组、肺炎链球菌引物组、脑膜炎奈瑟菌引物组、曲霉菌引物组、阴沟肠杆菌引物组或B族链球菌引物组的环介导等温扩增试剂。

在一些可选的实施方案中，所述微流控芯片还包括包埋有含对照引物组的环介导等温扩增试剂的反应孔；和/或，所述微流控芯片还包括包埋有不含引物组的环介导等温扩增试剂的反应孔。

在本发明的第四方面中，提供了一种非治疗和诊断目的的脓毒症病原体检测方法，其采用本发明第三方面所述的脓毒症病原体核酸检测试剂盒，包括以下步骤：

样本中核酸提取及纯化：将样本在8000～15000rpm，离心2～8min，弃上清后，每200μL原始样本，添加50～150μL核酸提取试剂，混匀后添加至微流控芯片的加样孔中；

环介导等温扩增：将添加样本的微流控芯片转移至全自动恒温核酸扩增分析仪中，在90～98℃加热2～7min后，在1000～5000rpm下离心，使得样本由加样孔流入各反应孔中，在60～65℃下扩增30～45min；

结果判定：根据全自动核酸恒温分析仪的检测结果判断样本中是否含有脓毒症病原体。

在一些实施方案中，在所述样本中核酸提取及纯化前，还包括样本的预处理的步骤，其包括将样本中加入样本体积2～4倍体积的1～2M的氢氧化钠溶液，涡旋震荡1～5min后静置2～30min，在8000～15000rpm条件下，离心3～8min，去上清，加入生理盐水震荡清洗，在8000～15000rpm条件下，离心3～8min，去上清，待用。

在本发明的第五方面中，提供了本发明第一方面所述的引物组合物、本发明第二方面所述的环介导等温扩增试剂在制备用于诊断脓毒症的试剂或试剂盒中的用途。

在一些实施方案中，所述脓毒症是由金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和/或B族链球菌引起的脓毒症。

本发明提供的检测脓毒症病原体的引物组合物、及其核酸试剂盒、检测方法具有以下优势：

1)可快速检测脓毒症病原体；

2)针对各病原体均具有较高的检测灵敏度，均达到100拷贝/mL。

3)可以针对例如肺泡灌洗液及痰液样本，两类样本经常有块状物质和抑制物质，常规检测失败率高，本方法通过优化反应体系及样本液化提高检测灵敏性。

本发明提供的检测脓毒症病原体的引物组、包含所述引物组的核酸检测试剂盒及检测方法，可快速、准确地检测各种脓毒症病原体，以弥补针对脓毒症病原体检测技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。对于临床而言，能够在1小时内获得检测结果，对于快速辅助指导治疗和用药也具有重要意义。

附图说明

图1为本发明实施例中使用的微流控芯片的示意图。其中，

图2为本发明实施例中的临床样本扩增图。

图3，其包括A～L，为本发明实施例中的各病原体的特异性扩增图；其中A为金黄色葡萄球菌，B为肺炎克雷伯菌，C为大肠埃希氏菌(大肠杆菌)，D为粪肠球菌，E为鲍曼不动杆菌，F为铜绿假单胞菌，G为嗜麦芽窄食单胞菌，H为肺炎链球菌，I为脑膜炎奈瑟菌，J为曲霉菌，K为阴沟肠杆菌，L为B族链球菌特异性扩增图。

图4，其包括A～L，为本发明实施例中的各病原体的灵敏度扩增图；其中A为金黄色葡萄球菌，B为肺炎克雷伯菌，C为大肠埃希氏菌(大肠杆菌)，D为粪肠球菌，E为鲍曼不动杆菌，F为铜绿假单胞菌，G为嗜麦芽窄食单胞菌，H为肺炎链球菌，I为脑膜炎奈瑟菌，J为曲霉菌，K为阴沟肠杆菌，L为B族链球菌灵敏度扩增图。

具体实施方式

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本说明书中，使用“数值A～数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

本说明书中，使用“基本上”或“实质上”表示与理论模型或理论数据的标准偏差在5％、优选为3％、更优选为1％范围以内。

本说明书中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

本说明书中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

本说明书中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

本说明书中，“室温”可以为不加热或降低的自然温度，可以指约10℃至30℃、约15℃至25℃，例如约25℃或约23℃的温度。

在本说明书中，术语“生物样本”或“样本”涵盖从生物来源获得的任何样品。作为非限制性实例，生物样本可以包括血液、羊水、血清、血浆、液体或组织活检、尿液、粪便、表皮样品、皮肤样品、面颊拭子、精子、羊水、培养的细胞、骨髓样品和/或绒膜绒毛。术语“样本”包括已经被处理以释放或以其他方式使核酸或蛋白质可用于本文所述的检测的样品。术语“样本”还包括可存在于样品(例如血浆或羊水)中的无细胞核酸。例如，“样本”可以包括通过从生物样品中的细胞逆转录RNA获得的cDNA。“样本”可以从生命阶段例如胎儿、年轻人、成年人等获得。也可以使用固定或冷冻的组织。

术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合形式，或脱氧核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性示例包括基因、基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、shRNA、单链短或长RNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、控制区，任何序列、核酸探针和引物的分离RNA。核酸分子可以是线性的或环状的。

如本文所用，术语“引物”及其派生词通常是指可与所关注靶序列杂交的任何核酸。通常，引物用作底物，核苷酸可通过聚合酶聚合到该底物上或核苷酸可连接到该底物；然而，在一些实施方案中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些实施方案中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。

如本文所用，术语“受试者”是指人或非人生物体，优选受试者是人类，最优选是“患者”。

如本文所用，术语“诊断”是指本领域技术人员通过其可估计和/或确定患者是否患有给定的疾病或病状的可能性的方法。这里的“诊断”是“确定”，但不意味着暗示诊断是100％准确。

如本文所用，术语“病原体”、“病原微生物”是指能够在受试者中诱导传染性疾病的任何病原体或病原体片段。在一些实施方案中，病原体是传染性微生物(其选自于细菌、真菌，病毒和寄生虫)或其片段。病原体可包括完整的传染性病原体细胞，或病原体细胞的一部分，例如传染性微生物的细胞壁组分。

<检测脓毒症病原体的引物组合物>

对于引起脓毒症的病原微生物，选择最为常见的金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和B族链球菌分别基于各自的保守基因设计基于LAMP技术的引物组。引物设计时参照特异性极高的片段设计引物，所获得的引物组可以满足在同一微流控芯片上，在相同反应条件下同时检测，并且均满足高灵敏度、特异性的要求。由于不同的引物组恒温扩增成环效率差别较大，为了能够让脓毒症12个病原体的引物组在相同系统条件下的扩增效率相近，本发明通过优化环引物来实现这一效果，弥补针对脓毒症病原体检测技术存在的费时耗力的缺陷，提高检测灵敏度和特异性，降低劳动强度，缩短检测周期。

为满足病原体检测的核酸检测目标，设计了相应的引物，具体如下表1所示：

表1：检测脓毒症病原体的引物组

在上表1中，在“引物名称”一列中，“-”前的部分代表对应的菌种的英文简写；“-”后的部分中：F3表示LAMP技术中所使用的上游外部引物F3；B3表示LAMP技术中所使用的下游外部引物B3；FIP表示LAMP技术中所使用的上游内部引物FIP；BIP表示LAMP技术中所使用的下游内部引物BIP；LF表示LAMP技术中所使用的上游环引物LF；LB表示LAMP技术中所使用的下游环引物LF。例如，“SA-F3”，为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的上游外部引物F3。

在一些实施方案中，检测脓毒症病原体的引物组合物包括金黄色葡萄球菌引物组、肺炎克雷伯菌引物组、大肠埃希氏菌引物组、粪肠球菌引物组、鲍曼不动杆菌引物组、铜绿假单胞菌引物组、嗜麦芽窄食单胞菌引物组、肺炎链球菌引物组、脑膜炎奈瑟菌引物组、曲霉菌引物组、阴沟肠杆菌引物组和B族链球菌引物组中的至少一组；其中，所述金黄色葡萄球菌引物组包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5所示的引物；所述肺炎克雷伯菌引物组包括SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10所示的引物；所述大肠埃希氏菌引物组包括SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:15所示的引物；所述粪肠球菌引物组包括SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:20所示的引物；所述鲍曼不动杆菌引物组包括SEQ ID NO:21至SEQ ID NO:25所示的引物；所述铜绿假单胞菌引物组包括SEQ ID NO:26至SEQ ID NO:30所示的引物；所述嗜麦芽窄食单胞菌引物组包括SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:34所示的引物；所述肺炎链球菌引物组包括SEQ IDNO:35至SEQ ID NO:39所示的引物；所述脑膜炎奈瑟菌引物组包括SEQ ID NO:40至SEQ IDNO:45所示的引物；所述曲霉菌引物组包括SEQ ID NO:46至SEQ ID NO:51所示的引物；所述阴沟肠杆菌引物组包括SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:57所示的引物；所述B族链球菌引物组包括SEQ ID NO:58至SEQ ID NO:62所示的引物。

在一些具体的实施方案中，检测脓毒症病原体的引物组合物包括金黄色葡萄球菌引物组、肺炎克雷伯菌引物组、大肠埃希氏菌引物组、粪肠球菌引物组、鲍曼不动杆菌引物组、铜绿假单胞菌引物组、嗜麦芽窄食单胞菌引物组、肺炎链球菌引物组、脑膜炎奈瑟菌引物组、曲霉菌引物组、阴沟肠杆菌引物组和B族链球菌引物组。

在一些实施方案中，检测脓毒症病原体的引物组合物还包括用于扩内标片段的对照引物组，其包括SEQ ID NO:63～SEQ ID NO:66所示的引物。

<环介导等温扩增试剂>

在一些实施方案中，环介导等温扩增试剂包括检测脓毒症病原体的引物组合物中的任一引物组，以及dNTP、牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)、MgSO

在一些具体的实施方案中，所述链置换型DNA聚合酶可为Bst DNA聚合酶；所述荧光染料为SYBR Green、Cyto9、LCGreen、Evagreen中的任意一种。

在一些具体的实施方案中，检测脓毒症病原体的引物组合物中的金黄色葡萄球菌引物组、肺炎克雷伯菌引物组、大肠埃希氏菌引物组、粪肠球菌引物组、鲍曼不动杆菌引物组、铜绿假单胞菌引物组、嗜麦芽窄食单胞菌引物组、肺炎链球菌引物组、脑膜炎奈瑟菌引物组、曲霉菌引物组、阴沟肠杆菌引物组或B族链球菌引物组分别与dNTP、牛血清白蛋白(Bovine albumin,BSA)、MgSO

<基于微流控芯片技术的脓毒症病原体核酸检测试剂盒>

本发明一些方面提供了基于微流控芯片技术的脓毒症病原体核酸检测试剂盒，其包括微流控芯片和核酸提取试剂，其中所述微流控芯片的反应孔中包埋有上述的环介导等温扩增试剂。

在一些具体的实施方案中，所述环介导等温扩增试剂通过以下方式包埋在所述微流控芯片的反应孔中：

采用针式芯片点样仪，将针对不同病原体的环介导等温扩增试剂分别点样在微流控芯片的不同的反应孔中；

将点样后的微流控芯片均匀平铺，并放入真空干燥箱中，在室温下，在≤100Pa的真空条件下(例如50～100Pa)，干燥10～30分钟，环境湿度在40～60％，若达不到此真空条件，干燥时间将大大延长，甚至到2小时以上，显著降低了生产效率。

在一些实施方案中，微流控芯片具体结构如中国实用新型专利CN206334683U(实用新型名称：一种CD盘状微流控芯片)所公开，简要地，其包括底片、反应检测部分、通孔及封膜，所述通孔位于微流控芯片的中心，并与配套的设备相连接；所述反应检测部分包括加样孔、储液区、预留区、反应孔、球阀、废液缸、排气孔、第一弧形通道和第二弧形通道，所述预留区为凹凸线纹通道，一端连接加样孔，另一端连接排气孔，所述第一弧形通道和第二弧形通道位于底片上，第一弧形通道连接预留区和排气孔，第二弧形通道连接加样孔、储液区和预留区，所述球阀位于预留区与反应孔之间。

在一些实施方案中，所述核酸提取试剂包含质量体积比5％的树脂材料和1×等温扩增(Isothermal Amplification)反应缓冲液。优选的，所述树脂材料为商品化的树脂，具体为一种微纳米介孔吸附树脂，所述树脂的直径为100μm-500μm，其表面介孔尺寸为10nm-100nm，且表面含有大量亚氨基二乙酸盐离子，可以聚集吸附大量非核酸性有机物；所述1×等温扩增反应缓冲液可以通过稀释(例如使用水稀释)10×等温扩增反应缓冲液获得，10×等温扩增反应缓冲液包含250mM Tris、300mM KCl和5％BSA溶液的缓冲母液。

在一些具体实施方案中，所述微流控芯片包含多个反应孔，分别包埋有含金黄色葡萄球菌引物组、肺炎克雷伯菌引物组、大肠埃希氏菌引物组、粪肠球菌引物组、鲍曼不动杆菌引物组、铜绿假单胞菌引物组、嗜麦芽窄食单胞菌引物组、肺炎链球菌引物组、脑膜炎奈瑟菌引物组、曲霉菌引物组、阴沟肠杆菌引物组或B族链球菌引物组的环介导等温扩增试剂。

在一些具体实施方案中，所述微流控芯片还包括包埋有含对照引物组的环介导等温扩增试剂的反应孔。在一些具体实施方案中，所述微流控芯片还包括包埋有不含引物组的环介导等温扩增试剂的反应孔，其作为阴性对照。不含引物组的环介导等温扩增试剂包含dNTP、BSA、MgSO

在一些具体实施方案中，微流控芯片设有4个反应检测部分，且各个反应检测部分之间互不连通，每个反应检测部分具有8个反应孔。每个反应检测部分的8个反应孔中的2个分别作为内标孔(包埋对照引物组的环介导等温扩增试剂)和阴性对照孔(包埋不含引物组的环介导等温扩增试剂)，其他6个孔作为检测孔，因此，微流控芯片的2个反应检测部分共12个检测孔，分别用于检测12种脓毒症病原体，同一微流控芯片可以检测两份样本。

<基于微流控芯片技术的脓毒症病原体核酸检测方法>

基于微流控芯片技术的脓毒症病原体核酸检测方法，其采用上述的脓毒症病原体核酸检测试剂盒，包括以下步骤：

样本中核酸提取及纯化：将样本在8000～15000rpm，离心2～8min，弃上清后添加50～150μL的核酸提取试剂，混匀后添加至微流控芯片的加样孔中；

环介导等温扩增：将添加样本的微流控芯片，转移至全自动恒温核酸扩增分析仪中，在90～98℃加热2～7min后，在1000～5000rpm下离心，使得样本由加样孔流入各反应孔中，在60～65℃下扩增20～40min；

结果判定：根据所述全自动核酸恒温分析仪的检测结果判断样本中是否含有脓毒症病原体。

在一些具体的实施方案中，在所述样本中核酸提取及纯化前，还包括样本的预处理的步骤，其包括将样本中加入样本体积2～4倍体积的1～2M(优选2M)浓度氢氧化钠溶液，涡旋震荡1～5min后静置2～30min，在8000～15000rpm条件下，离心3～8min，去上清，加入生理盐水震荡清洗，在8000～15000rpm条件下，离心3～8min，去上清，待用。氢氧化钠溶液的使用，使得脓毒症样本充分液化，达到清洗目的。

在一些具体的实施方案中，所述的脓毒症病原体核酸检测方法为非治疗和/或诊断目的的方法。

<用途>

本发明提供了上述的引物组合物、环介导等温扩增试剂在制备用于诊断脓毒症的试剂或试剂盒中的用途。

在一些具体的实施方案中，所述脓毒症是由金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和/或B族链球菌引起的脓毒症。

在一些具体的实施方案中，所述诊断为确认样本中是否存在金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和/或B族链球菌的核酸。

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例一靶标及引物设计合成

1.1序列获得：

通过对GeneBank中上述各个菌的保守基因序列查询，用Vector NTI软件对各种来源的基因序列进行比对后发现，其序列高度保守并具有很好的同源性。

1.2引物设计

(1)将各个菌和内标基因的保守区段导入primer设计软件中，选取F1c和B1c的Tm值相近、F3/B3/F2/B2的Tm值相近，且F1c和B1c的Tm值比F3/B3/F2/B2的Tm值大5℃，5’dG和3’dG的绝对值小于4的DNA序列作为候选引物。

(2)引物合成：将设计好的多套引物序列委托上海百力格公司合成，备用。

(3)引物确认：将合成好的引物溶解后进行引物筛选，最终得到用于制备本发明微流控芯片所需要的高特异、灵敏的引物组(具体参见表1)，后续将筛选好的引物连同反应液一起干燥在微流控芯片的反应孔中。

1.3内标引物组

本实施例采用的内标引物组为HBB(hemoglobin beta-chain，血红蛋白-β链)内标，具体序列参见表1。

实施例二脓毒症多靶标病原体试剂盒的生产

下列实施例中的金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和B族链球菌来标准菌株自于北纳生物。

2.1真空干燥预混液(扩增体系、环介导等温扩增试剂)

真空干燥预混液包含10mM dNTP(上海兆维)、质量体积比5％的BSA(sigma)、5MMgSO

具体地，在本实施例中，所述扩增体系含有10mM dNTP、5％BSA、5M MgSO

其中，各靶标引物组或内标引物组中的各引物(各引物浓度为100μM)加入体积比例为F3：B3：FIP：BIP：LF：LB为1：1：5～8：5～8：3：3。

在本实施例中，引物加入体积比例为F3：B3：FIP：BIP：LF：LB为1：1：6：6：3：3。

此外，对于不包含F3、B3、FIP、BIP、LF、LB中的一种或多种引物的引物组的情况，其他引物按上述体积比配比即可。

2.2核酸提取试剂

核酸提取试剂包含质量体积比5％的树脂材料和1×等温扩增反应缓冲液。其中所述的树脂材料为商品化的树脂，具体为一种微纳米介孔吸附树脂，所述树脂的直径为100μm-500μm，其表面介孔尺寸为10nm-100nm，且表面含有大量亚氨基二乙酸盐离子，可以聚集吸附大量非核酸性有机物，其中1×等温扩增反应缓冲液由10×等温扩增反应缓冲液稀释(例如在实施例中使用水稀释)获得，10×等温扩增反应缓冲液包含250mM Tris、300mM KCl和5％BSA溶液的缓冲母液。

2.3装载有恒温扩增反应液的一体化微流控芯片

所述一体化微流控芯片为上海速创诊断产品有限公司生产的，其具体结构如中国实用新型专利CN 206334683 U所公开，示意图如图1所示。

所述一体化微流控芯片的①～⑥、

表2：一体化微流控芯片靶标顺序

其中，一体化微流控芯片中的真空干燥预混液的包埋方法包括点样工艺和干燥工艺。

(1)点样工艺

使用微流控芯片进行点样，将2.1中配制好的真空干燥预混液，首先去除小气泡，然后通过针式芯片点样仪(百道公司)进行点样：每个针头先预喷以平衡点样针内外的压力差；然后将上述配制好的真空干燥预混液按照每个反应孔2μL的量点到芯片反应孔中。

(2)干燥工艺

将上述点好真空干燥预混液的一体化微流控芯片均匀平铺再放入真空干燥箱中，进行室温真空50～100Pa干燥10～30分钟(例如15分钟)，环境湿度要求40～60％。最后将芯片背面贴上背膜后放入封口袋密封。

在本实施例中，如图1所示，按上述的点样工艺和干燥工艺，取2μL的2.1中配制好的真空干燥预混液，点入相应的一体化微流控芯片反应孔中，相对湿度50％，抽真空干燥(80Pa)15分钟后，将微流控芯片的背面封膜备用。上述一体化微流控芯片可以同时检测2个样本，其中A1、A2为同一个样本的2个加样孔；B1、B2为同一个样本的2个加样孔。

在本实施例中制备的试剂盒，通过一体化微流控检测芯片把样本的核酸提取、纯化、扩增、检测等多个步骤整合在一起，通过设备分区加热系统、微通道系统、主动离心力等组合来实现样本检测的自动化，达到检测通量高、操作方便、检测时间短、污染少等优点。

实施例三利用临床样本进行检测的初步结果

本发明涉及的样本类型主要有肺泡灌洗液，痰液。样本使用前均需液化处理：将样本置于室温，取200μL样本加入3倍体积2M浓度的氢氧化钠溶液，涡旋震荡3min后静置15min，12000rpm离心5min后，去上清，加入1mL的生理盐水震荡清洗，12000rpm离心5min后，去上清，待用。

对于样本的检测，向含有已液化处理的样本的离心管中加入100μL实施例二中制备的核酸提取试剂，涡旋振荡15s，并瞬时离心后，转移至微流控芯片的加样孔中，贴紧封口膜，放置于仪器内，于60-65℃反应30～45min。

在本实施例中，如图1所示，对2例临床样本(痰液样本)通过该芯片进行检测，将400μL待测的经液化处理的样本P1与核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔A1、A2；待测的经液化处理的样本P2与核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片加样孔B1、B2。然后用膜封住加样孔后，将微流控芯片放入全自动恒温核酸扩增分析仪(上海速创诊断产品有限公司)中：95℃加热5min后，通过1000-5000rpm离心，然后63℃扩增40min。结果见图2，固定有内标的引物组的反应孔

实施例四生产芯片的检测特异性。

本实施例利用实施例二中制备的一体化微流控芯片进行特异性实验。

4.1将实施例一中用于检测病原菌的引物组配制成恒温扩增反应混合溶液，按照表2顺序点样到一体化芯片反应孔中，干燥，贴膜后备用。

4.2分别将400μL金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌或B族链球菌与200μL核酸提取试剂制成混合液后加入微流控芯片的加样孔，每组菌液样本加入到对应的2个样品加样孔内，总共耗用6片芯片；用膜封住加样孔后，将一体化微流控芯片放入全自动恒温核酸扩增分析仪中95℃加热5min后，离心，然后63℃扩增40min。

4.3结果见图3以及下表3，每一片芯片固定有内标引物组的恒温扩增反应孔均呈现“S”型扩增曲线，说明内质控扩增正常；每一片芯片对应菌液的靶标呈现“S”型扩增曲线，其余靶标不扩增说明金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和B族链球菌互相之间没有交叉反应，特异性好。

表3：各病原体引物特异性扩增结果表

其中，“+”表示扩增，“-”表示不扩增。

实施例五生产芯片的检测灵敏度。

本实施例利用实施例二中制备的一体化微流控芯片进行灵敏度实验。

5.1将实施例一中用于检测金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和B族链球菌的引物组配制成恒温扩增反应混合溶液，按照表2顺序点样到一体化芯片反应孔中，干燥，贴膜后备用。

5.2首先将金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、粪肠球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、曲霉菌、阴沟肠杆菌和B族链球菌按菌液浓度分别稀释到10

5.3结果见图4以及下表4，每一片芯片对应的反应孔⑦、

表4：各病原体引物灵敏度扩增Ct值表

其中，“-”表示未扩增。

序列表

<110> 上海速创诊断产品有限公司

上海速芯生物科技有限公司

<120> 检测脓毒症病原体的引物组合物、及其核酸检测试剂盒、检测方法

<130> 2233125IP

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SA-F3

<400> 1

cgattgatgg tgatacggtt a 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SA-B3

<400> 2

cagttctttg acctttgtca 20

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SA-FIP

<400> 3

gctttgtttc aggtgtatca accaaattaa tgtacaaagg tcaaccaatg 50

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SA-BIP

<400> 4

aaggtgtaga gaaatatggt cctgatcgac ttcaattttc tttgca 46

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SA-LB

<400> 5

gcaagtgcat ttacgaaaaa aatgg 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KP-F3

<400> 6

tcttaaatac aaaaacacca gtg 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KP-B3

<400> 7

acctgcttat tatgcgtttg 20

<210> 8

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KP-FIP

<400> 8

ccacatttgc agcatatttg attcttaggg cagttaactt taccg 45

<210> 9

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KP-BIP

<400> 9

ggcatggtac ttcgcaaatc tctttatgcg acgataccgt c 41

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> KP-LB

<400> 10

caacgcaaat gaacatcaaa gcgaa 25

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-F3

<400> 11

ggatccatcg cagcgtaat 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-B3

<400> 12

ccttgtccag ttgcaacca 19

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-FIP

<400> 13

gtcttgcgcg acatgcgtca ctctacacca cgccgaac 38

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-BIP

<400> 14

tgtaaccacg cgtctgttga ctcctgttga tccgcatcac g 41

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Eco-LF

<400> 15

gtgatatcgt ccacccaggt 20

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ef-F3

<400> 16

cgctttctat gattatgatg ca 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ef-B3

<400> 17

ctaaagtcag taaaaccagg c 21

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ef-FIP

<400> 18

gggcttgatg agctacttct tctcatcaat aacacgattg aaatgc 46

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ef-BIP

<400> 19

atgttagatg gaagtggctt aagtcaggaa taattcgttt ttgcttgt 48

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ef-LB

<400> 20

agcgcatgtt ccagaagaag 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB-F3

<400> 21

cttatatagt gactgctaat ccaa 24

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB-B3

<400> 22

attaagcatt ttgaaggtcg a 21

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB-FIP

<400> 23

acccgtagtg tgtacttcgt taaatacagc gcttcaaaat ctga 44

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB-BIP

<400> 24

ttagttatcc aacaaggcca aactagcagg tacatactcg gtc 43

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AB-LB

<400> 25

aaagctatgg taatgatctt gctcg 25

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA-F3

<400> 26

ggcaaggtgg ccaagct 17

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA-B3

<400> 27

gccaggaagt cgtcgatgg 19

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA-FIP

<400> 28

atctcggtgc cggcgaacag tgcccctacc accagtg 37

<210> 29

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA-BIP

<400> 29

gcgccgactt cgacatgaag gagccaggct gatgaagatg t 41

<210> 30

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PA-LB

<400> 30

acggcctgaa gccgatcca 19

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pma-F3

<400> 31

gtggggagca aacaggatt 19

<210> 32

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pma-B3

<400> 32

acatactcca ccgcttgtg 19

<210> 33

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pma-FIP

<400> 33

cgatactgcg tgccaaattg cactggtagt ccacgcccta 40

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Pma-BIP

<400> 34

agctaacgcg ttaagttcgc cgccccgtca attcctttga gt 42

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sp-F3

<400> 35

agtctttcaa tatctatgtt agtgg 25

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sp-B3

<400> 36

agattttcta aggtgtgaat gg 22

<210> 37

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sp-FIP

<400> 37

ctcgattgac agtcatcagg atattcacct atggtcctat tagttcg 47

<210> 38

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sp-BIP

<400> 38

gtgatgccta tgtaccaatc gcacgaatca actccataaa tgcc 44

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Sp-LB

<400> 39

acccatgcag gcatttatgg 20

<210> 40

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nm-F3

<400> 40

gaattgccgg cagaacgt 18

<210> 41

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nm-B3

<400> 41

atactgttcg cgccactg 18

<210> 42

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nm-FIP

<400> 42

gcgaatgcgc atcagccata tttgctcaag gttatggcag tg 42

<210> 43

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nm-BIP

<400> 43

ttgtatgtgt cgaatgcgcc gtcggcgaga acacaaacga 40

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nm-LF

<400> 44

cacgatatac cgttggaatc tctg 24

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Nm-LB

<400> 45

tggctgaagt gcagaaattc tt 22

<210> 46

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> As-F3

<400> 46

tttttgggtt ctgggggga 19

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> As-B3

<400> 47

caccaactaa gaacggccat 20

<210> 48

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> As-FIP

<400> 48

caaattaagc cgcaggctcc actatggtcg caaggctgaa ac 42

<210> 49

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> As-BIP

<400> 49

caacacgggg aaactcacca ggcaccacca tccaaaagat ca 42

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> As-LF

<400> 50

ggtgcccttc cgtcaattt 19

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> As-LB

<400> 51

gattgacaga ttgagagctc tttct 25

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ec-F3

<400> 52

agtcttgtag aggggggtag 20

<210> 53

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ec-B3

<400> 53

cgttagctcc ggaagcca 18

<210> 54

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ec-FIP

<400> 54

gtcagtcttt gtccaggggg caattccagg tgtagcggtg a 41

<210> 55

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ec-BIP

<400> 55

gctcaggtgc gaaagcgtgg acctccaagt cgacatcgtt 40

<210> 56

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ec-LF

<400> 56

ttcctccaga tctctacgca tt 22

<210> 57

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Ec-LB

<400> 57

taccctggta gtccacgcc 19

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GBS-F3

<400> 58

agaagcctta acagatgtga 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GBS-B3

<400> 59

caggataagt taaaaccttt tgttc 25

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GBS-FIP

<400> 60

ctagcttagt tatcccaaat cccatgaagc aatcactttt tcaactca 48

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<212> DNA

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<220>

<223> GBS-BIP

<400> 61

attcgcattt tagatccatt tgcttgcctt tacatcgtta acttgag 47

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GBS-LF

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ttgcttgact aaccttattt gc 22

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<212> DNA

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBB-B3

<400> 64

acgtgcagct tgtcacag 18

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<212> DNA

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<220>

<223> HBB-FIP

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agccttcacc ttagggttgc ctgagtcctt tggggatctg t 41

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<212> DNA

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<220>

<223> HBB-BIP

<400> 66

aagtgctcgg tgcctttagt gacagctcac tcagtgtggc 40