一种低温淀粉酶及其在纺织中的应用

技术领域

本发明属于纺织应用领域，涉及一种低温淀粉酶酶的开发及其在印染前处理中的应用。

背景技术

σ-淀粉酶是从淀粉内部任意水解σ-1,4葡萄糖苷键，导致淀粉部分解聚，根据σ-淀粉酶的热稳定性和最适反应温度，通常把σ-淀粉酶分为高温σ-淀粉酶、中温σ-淀粉酶、低温σ-淀粉酶，高温淀粉酶通常是指最适反应温度为90-95℃、热稳定性90℃以上的淀粉酶，中温淀粉酶是指最适反应温度为60℃左右的酶；而低温淀粉酶的最适反应温度一般在40℃以下。低温淀粉酶广泛应用于造纸、食品、医药工业、纺织等领域。其中印染前处理中应用低温淀粉酶冷堆工艺中具有广阔的市场，主要原因在于冷堆工艺节约成本，能耗少。但其制约其发展的关键技术在于低温淀粉应用于冷堆退浆工艺中效率低的问题。因此急需开发一种性质优良的低温淀粉酶。

迄今，低温淀粉酶生产菌多存在酶活性不高且产量低的问题，导致生产成本高昂；其在印染前冷堆工艺中，由于气候和成本考虑，工厂中的冷堆工艺通常在室温进行。因此开发一种温度稳定性高，在10-20℃仍有较高活性的低温淀粉酶更有利于推动行业的规模化发展。

为解决此类问题，可通过诱变、基因工程改造或进一步优化培养条件的方法获得高产且性质优良的菌株。

已有报道淀粉酶成功构建融合酶的例子：将来自Cryptococcus sp. S-2、Thermobifida fusxa strain NTU 22 、Clostridium Butyricum T-7的α-淀粉酶的CBM融合，成功构建了融合酶AmyP-Cr 、AmyP-Th、AmyP-Cl，并在大肠杆菌BL21 （DE3）中成功诱导表达出可溶性的融合酶，融合酶对淀粉的比活和降解率都得到了提高，且融合酶A-S2的热稳定性也提高到野生型的5.1倍。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种低温淀粉酶，其能在低温条件下仍有较高的酶活力和酶活稳定性。

本发明首先提供一种淀粉酶重组的低温淀粉酶，通过生物信息学数据挖掘筛选获得中温淀粉酶BAA序列GeneBank号：WP_013352208.1)，低温淀粉酶CPA序列（GeneBank：AAZ27074.1），低温淀粉酶PPA（GeneBank：AHM24948.1）。

因此，本发明提供一种重组改造的淀粉酶，其特征在于，其是通过截取低温淀粉酶CPA靠近C端的第35-220位氨基酸的序列和低温淀粉酶PPA靠近N端的第346-451位氨基酸的序列与中温淀粉酶BAA进行重组获得，优选地是连接顺序是中温淀粉酶BAA的第1-58个氨基酸序列、低温淀粉酶CPA靠近C端的第35-220位氨基酸的序列、低温淀粉酶PPA靠近N端的第346-451位氨基酸的序列和中温淀粉酶BAA的第346-451个氨基酸序列依次连接。

其中，中温淀粉酶BAA序列GeneBank号：WP_013352208.1，低温淀粉酶CPA序列GeneBank号：AAZ27074.1，低温淀粉酶PPA序列GeneBank号：AHM24948.1。

本发明因而也提供编码所述的重组改造的淀粉酶的多核苷酸。

也提供含所述的多核苷酸的重组载体，及其重组菌。

本发明进一步提供一种制备所述的核苷酸的方法，其特征在于，扩增获得中温淀粉酶BAA核苷酸序列得到片段1；以低温淀粉酶CPA核苷酸序列为模板，以引物CPA339-F：CGATTGCAGAATGATGCGGACTATATTGCTAGTTTAGGGG，CPA339-R：tacgacgctatTGTTCTTAACTCTTTAGCTTTCGC扩增得到片段2；以低温淀粉酶PPA为模板，以引物PPA339-F：AGTTAAGAACAatagcgtcgtattggcaac，引物PPA339-R：TTTTGTCCCGTACATATCtccgtaatacatttgagcaatgc扩增得到片段3；使用无缝克隆酶将以上扩增完成的三片段混合，水浴中连接反应得到。

进一步通过转化至大肠杆菌，并进行测序验证。

本发明还提供制备所述的重组改造的淀粉酶的方法，其包括所述的重组菌，分离得到所述重组改造的淀粉酶的步骤。

本发明进一步提供所述的重组改造的淀粉酶在印染前处理的冷堆工艺中的应用，更具体地其用于退浆处理，优选地冷堆温度为20℃以下，进一步15℃以下浸轧。

发明有益效果：现有技术对淀粉酶的重组改造研究大多集中在淀粉酶的淀粉结合结构域的重组，本发明不同之处在于通过对低温淀粉酶C端、N端序列的截短后推测其嗜冷结构域的区域受N端或C端哪些区域的影响，具体找到低温淀粉酶CPA在C端截短50个氨基酸仍有酶活且最适温度不变，然而截短100个氨基酸后酶活消失；而低温淀粉酶PPA在N端截短100个氨基酸后仍有酶活且最适温度不变； 因此将低温淀粉酶CPA C端35-220氨基酸与低温淀粉酶PPA N端346-451 区域内的氨基酸融合后插入并替换中温淀粉酶59-394区域内氨基酸。即将CPA和PPA的催化区域融合后替换BAA中温淀粉酶的催化区域，但保留中温淀粉酶的N端和C端结构域。改造后成功将中温淀粉酶BAA的最适反应温度降低，但改造后的酶活力比原始低温淀粉酶高。本发明中改造后获得的低温淀粉酶RPA339，其最适温度为35℃，最适pH6.5，室温25℃、16h后酶活仍有82%。改造后的低温淀粉酶RPA339更适合应用于印染前处理的冷堆工艺中。

附图说明

图1 重组改造后的淀粉酶的最适温度。

图2重组改造后的淀粉酶的最适pH值。

图3重组改造后的淀粉酶的温度稳定性。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。

实施例1 低温淀粉酶序列的挖掘

对CAZy 数据库中收录的淀粉酶家族现有成员进行生物信息学归纳分析，明确该家族的序列及结构特征。其次，依据生物信息学分析结果构建基于隐马尔科夫模型HMMER（http://www.hmmer.org/）从公共数据库NCBI海量序列数据中挖掘低温淀粉酶家族潜在成员的技术路线。最后，通过结构域注释（Batch CD-Search: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）以及同源建模（SWISS-MODEL: https://swissmodel.expasy.org/interactive）从挖掘获得的相似序列中筛选低温淀粉酶多分布于GH13家族，CBM20结构域。选择N端和C端序列相似性较低的低温淀粉酶CPA序列（GeneBank：AAZ27074.1），低温淀粉酶PPA（GeneBank：AHM24948.1）。

实施例2 淀粉酶的表达与纯化

LB培养基组分为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；TB培养基的组分：2 %胰蛋白胨，2.4 % 酵母提取物，72 mM K2HPO4，17 mM KH2PO4， 0.4 % 甘油。

1、重组淀粉酶的发酵培养

将目标菌种1% 的接种量接种至 LB培养基中37℃培养14h，活化后的菌1% 接种量接种至含氨苄TB培养基中，置于37℃摇床，220 rpm培养2 h 左右，培养至 OD600nm=0.6-0.8之间，立即向菌液中添加终浓度0.2 mM 的IPTG 诱导剂，16℃，220 rpm，诱导表达24 h后收集菌液，12000 rpm离心弃上清，沉淀用不同pH的缓冲液重悬，超生破碎后12000 rpm离心取上清，即为粗酶液。

2、重组淀粉酶的纯化

将诱导表达的菌液全部分装进500 mL 离心杯中，4℃，5000 rpm，离心15 min，倒掉上清，收集菌体用缓冲液重新悬浮。利用AKTA purifier 10（GE）蛋白纯化仪进行蛋白质纯化，选择HisTrapTMHP（GE）亲和层析柱纯化方法完成蛋白质纯化后，得到了含少量咪唑的蛋白质溶液，对该蛋白质溶液进行透析以去除游离金属离子及其他杂质，将溶剂缓冲液换成透析液（20 mM 磷酸钠缓冲液，pH 6.0）。

实施例3淀粉酶的酶学性质测定

淀粉酶酶活力定义及其计算方法：1ml液体酶，40℃、pH6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/ml表示。计算公式如下：X=C*N。式中，X表示样品的酶活力U/ml；C表示测试的酶液浓度U/ml；N表示样品的稀释倍数。

根据国标GB 1886.174-2016食品工业酶制剂上规定的方法，对测定体系等比例缩小，进行耐高温α-淀粉酶活力的测定，具体步骤如下：

1) 粗酶液应用pH6.0磷酸缓冲液梯度稀释，摸索最佳稀释倍数，确保待测酶液的酶活力在60 U/mL-65 U/mL范围内。

2) 取2 mL EP管，加入1 mL可溶性淀粉（solarbio）和250 μL pH6.0 磷酸缓冲液，70℃金属浴锅800 rpm预热5 min。

3) 向预热好的2 mL EP管内加入50 μL待测粗酶液，准确反应5 min。

4) 取100 μL 反应液加入含有500 μL稀碘液和50 μL 盐酸溶液的1.5 mL EP管内，混匀。

5) 取200 μL变色溶液加入96孔板，以未添加反应液的稀碘液和盐酸溶液为空白对照，测定660 nm波长下吸光值，吸光值在0.29-0.39范围内为最佳。

6) 根据国标给定的吸光度与α-淀粉酶酶浓度对照表计算酶活。

实施例4重组淀粉酶RPA的构建

1、淀粉酶 CPA和PPA的C端截短分析

根据序列实施例1多序列比对结果及结构分析结果，分别将CPA和PPA 淀粉酶序列的C端以50个氨基酸为单位进行截短及其测定在pH7.0条件下酶活力最适反应温度的变化。

具体载体构建方法：分别将CPA淀粉酶C端截短50个氨基酸、截短100 个氨基酸、截短150个氨基酸、200个氨基酸的基因序列插入到PET32a ECOR I和Not I酶切位点之间，并命名为CPA50-、CPA100-、CPA150-、CPA200-。

分别将PPA淀粉酶C端截短50个氨基酸、截短100 个氨基酸、截短150个氨基酸、200个氨基酸的基因序列插入到PET32a的EcoR I和Not I酶切位点之间，并命名为PPA50-、PPA100-、PPA150-、PPA200-。

将构建完成的CPA50-、CPA100-、CPA150-、CPA200-、PPA50-、PPA100-、PPA150-、PPA200-

转化入大肠杆菌BL21中表达，测定pH7.0条件下反应温度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下的酶活力。如表1 所示，通过构建不同的C端截短突变体，发现C端结构域与嗜冷特性无关，然而如果C端继续截短，就会导致酶失活。CPA淀粉酶 C端截短50个氨基酸酶活就开始降低。

表1

2、淀粉酶 CPA和PPA的N端截短分析

分别将CPA和PPA 淀粉酶序列的N端以50个氨基酸为单位进行截短及其测定在pH7.0条件下酶活力最适反应温度的变化。

具体载体构建方法： 分别将CPA淀粉酶N端截短50个氨基酸、截短100 个氨基酸、截短150个氨基酸、200个氨基酸的基因序列插入到PET32a ECOR I和Not I酶切位点之间，并命名为CPA50N-、CPA100N-、CPA150N-、CPA200N-。

分别将PPA淀粉酶C端截短50个氨基酸、截短100 个氨基酸、截短150个氨基酸、200个氨基酸的基因序列插入到PET32a EcoR I和Not I酶切位点之间，并命名为PPA50N-、PPA100N-、PPA150N-、PPA200N-。

将构建完成的CPA50N-、CPA100N-、CPA150 N -、CPA200 N -、PPA50 N -、PPA100 N-、PPA150 N -、PPA200 N -。

转化入大肠杆菌BL21中表达，测定pH7.0条件下反应温度为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下的酶活力。如表2 所示，发现通过构建不同的N端截短突变体，发现N端结构域与嗜冷特性无关，然而，如果N端继续截短，就会导致酶失活。

表2

综上，推测CPA、PPA淀粉酶影响嗜冷的结构域不在C和N端。

3、构建重组淀粉酶RPA339

根据上述第2点的实验结果，截取CPA靠近C端35-220个氨基酸的序列和PPA 靠近N端346-451个氨基酸的序列进行如下重组质粒的构建。

所述重组质粒是以本实验室质粒PET32a-BAA（BAA序列GeneBank号：WP_013352208.1)为骨架模板，引物BAA339-F：CGCATCATTCTGCAATCG， Baa339-R：GATATGTACGGGACAAAAGGG扩增质粒骨架得到片段1；

以CPA序列（GeneBank：AAZ27074.1）为模板，引物CPA339-F：CGATTGCAGAATGATGCGGACTATATTGCTAGTTTAGGGG，CPA339-R：tacgacgctatTGTTCTTAACTCTTTAGCTTTCGC扩增得到片段2 ；

以PPA（GeneBank：AHM24948.1）为模板，引物PPA339-F：AGTTAAGAACAatagcgtcgtattggcaac，引物PPA339-R：TTTTGTCCCGTACATATCtccgtaatacatttgagcaatgc扩增得到片段3 ，使用无缝克隆酶将以上扩增完成的三片段混合，50℃ 水浴中连接30 min后转化至大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜挑取单克隆验证。将验证并测序成功的质粒转化至表达菌株BL21，将该菌株命名为RPA 339 BL21。根据实施例3中方法测定中温淀粉酶BAA、低温淀粉酶CPA、低温淀粉酶PPA、重组改造后的低温淀粉酶RPA339。其各自的酶活力如下表3所示。

表3重组淀粉酶的酶活

1）最适温度测定

根据实施例3中描述的酶活测定方法将淀粉与缓冲液混合后分别加入BAA、RPA339粗酶液，测定温度为15℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃。计算其相对酶活力，见图1。结果显示：重组改造后的淀粉酶比对照组BAA淀粉酶最适温度降低，RPA339最适温度为35℃，在15℃条件下，RPA339仍有50%的酶活。

2）最适pH测定

根据实施例3中描述的酶活测定方法将BAA、RPA339 粗酶液分别与不同pH的缓冲液和底物混合，测定pH4、pH4.5、pH5、pH5.5、pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8、pH9条件下的酶活。计算其相对酶活力（见图2），结果显示：RPA339最适pH变为pH6.5。

3）温度稳定性测定

根据实施例3中的酶活测定方法将淀粉与缓冲液混合后分别加入BAA、RPA339 粗酶液，25℃、pH6.5放置16h，每隔2-4h取一次样测定其酶活力。

计算其相对残留酶活力（见图3）。结果显示：重组改造后的淀粉酶比对照组BAA淀粉酶温度稳定性提高，其中RPA339 室温条件下放置16h仍有82%的酶活力。

3.5 km和Kcat值测定

用pH 6.0磷酸缓冲液配制的不同浓度的淀粉溶液(反应缓冲液中淀粉的终浓度为1.0，1.25，1.5，2.0，2.5，3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)，在25

表4 各种重组淀粉酶的

实施例5 重组淀粉酶在印染前处理纺织工艺中的应用

实施例2 中纯化制备的酶1：20 添加至水中混匀后，配置成800U/ml的淀粉酶溶液，再加入900U/mL纤维素酶、10000U/mL木聚糖酶、800U/mL果胶酶、2g/L氯化钙、80g/LJFC表面活性剂。将全棉坯布(规格20×16)于15℃下浸轧于生物复合酶液中，一浸一轧，带液率为100％。在10℃、15℃、20℃、25℃条件下冷堆放置16h。用温度为70℃的热水清洗2道，冷水(即常温水)洗1道，而后利用氧漂液氧漂，所述氧漂液包括如下成分：10g/L氧漂助剂、15g/L双氧水、8g/L螯合剂和2g/L渗透剂，带液率为100％，在100℃饱和蒸汽下蒸30min，再次用温度为70℃的热水清洗2道后，烘干。经以上前处理后的棉布，用碘液测定其退浆率，采用德国的TEGEWA标准色卡，该比色卡共分9级，1级最差，9级最好，一般达到7级以上就认为退浆率良好。结果如表5所示。

表5

从表5的结果可知，低温条件下，该重组改造后的淀粉酶在低温条件下能达到良好的退浆效果。