一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法

技术领域

本发明涉及干细胞外泌体提取领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法。

背景技术

近年来，干细胞已经成为再生医学领域中具有广阔应用前景的一类细胞，且已经有一些干细胞新药获批上市。除了干细胞本身，源自于干细胞的外泌体也成为了医学界关注的热点，为疾病的治疗带来了新思路，但是目前来看，干细胞的外泌体的提取方法依然不容乐观，提取操作复杂且效率不高，难以制备纯净的干细胞外泌体。

为此，发明一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法很有必要。

发明内容

为此，本发明提供一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，以解决提取操作复杂且效率不高，难以制备纯净的干细胞外泌体的问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

S1，在操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；

S2，将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清液颜色为无色或者淡黄色，弃除上清，得到胎盘组织；

S3，将离心所得胎盘组织匀浆并且过滤，得到滤液a和沉淀物a；

S4，将滤液a进行冷冻和室温融化，反复冻融多次；

S5，将所得沉淀物a酶解，得酶解液A；

S6，将酶解液A离心，取得沉淀物b，并将沉淀物b加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解100min后，终止酶解，得酶解液B；

S7，将酶解液B滤液离心，得沉淀B；

S8，向沉淀B中添加注射用水，并且将混合溶液冷冻和室温融化，反复冻融多次，再将混合溶液离心，得到上清液A；

S9，将滤液a和上清液A混合，过滤，即得人胎盘间充质干细胞外泌体。

优选的，所述S4中冷冻温度为-80℃，冻融次数为3-4次。

优选的，所述S5中酶解所用酶为胶原酶。

优选的，所述S6中沉淀A与混合酶的比例为5：1。

优选的，所述S6中混合酶包括：胶原酶II0.3％+DNA酶50U/ml+透明质酸钠酶400U/ml。

优选的，所述S7中离心转速为2000rpm并且离心时间为5min。

优选的，所述S8中注射用水为50-500ml。

优选的，所述S8中冷冻温度为-80℃，冻融次数为3-4次。

优选的，所述S8中离心转速为5000rpm并且离心时间为5min。

优选的，所述S1中操作台为无菌操作台。

本发明的有益效果是：

本发明通过清洗、离心、过滤、冻融、沉淀、离心、酶解、离心、冻融、混合过滤得到人胎盘间充质干细胞外泌体，步骤简单清晰，操作方便，设备使用成本较低，制取周期较短，更加方便实际操作制备，取得的干细胞外泌体纯度较高，杂质极少，更加符合研究需要。

具体实施方式

以下结合各个实施例对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

本发明提供的一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

S1，在无菌操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；

S2，将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清液颜色为无色或者淡黄色，弃除上清，得到胎盘组织；

S3，将离心所得胎盘组织匀浆并且过滤，得到滤液a和沉淀物a；

S4，将滤液a进行冷冻和室温融化，反复冻融多次；

S5，将所得沉淀物a酶解，得酶解液A；

S6，将酶解液A离心，取得沉淀物b，并将沉淀物b加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解100min后，终止酶解，得酶解液B；

S7，将酶解液B滤液离心，得沉淀B；

S8，向沉淀B中添加注射用水，并且将混合溶液冷冻和室温融化，反复冻融多次，再将混合溶液离心，得到上清液A；

S9，将滤液a和上清液A混合，过滤，即得人胎盘间充质干细胞外泌体；

S4中冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次；

S5中酶解所用酶为胶原酶；

S6中沉淀A与混合酶的比例为5：1，混合酶包括：胶原酶II0.3％+DNA酶50U/ml+透明质酸钠酶400U/ml；

S7中离心转速为2000rpm并且离心时间为5min；

S8中注射用水为50ml，冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次，离心转速为5000rpm并且离心时间为5min。

实施例2：

本发明提供的一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

S1，在无菌操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；

S2，将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清液颜色为无色或者淡黄色，弃除上清，得到胎盘组织；

S3，将离心所得胎盘组织匀浆并且过滤，得到滤液a和沉淀物a；

S4，将滤液a进行冷冻和室温融化，反复冻融多次；

S5，将所得沉淀物a酶解，得酶解液A；

S6，将酶解液A离心，取得沉淀物b，并将沉淀物b加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解100min后，终止酶解，得酶解液B；

S7，将酶解液B滤液离心，得沉淀B；

S8，向沉淀B中添加注射用水，并且将混合溶液冷冻和室温融化，反复冻融多次，再将混合溶液离心，得到上清液A；

S9，将滤液a和上清液A混合，过滤，即得人胎盘间充质干细胞外泌体；

S4中冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次；

S5中酶解所用酶为胶原酶；

S6中沉淀A与混合酶的比例为5：1，混合酶包括：胶原酶II0.3％+DNA酶50U/ml+透明质酸钠酶400U/ml；

S7中离心转速为2000rpm并且离心时间为5min；

S8中注射用水为200ml，冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次，离心转速为5000rpm并且离心时间为5min。

实施例3：

本发明提供的一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

S1，在无菌操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；

S2，将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清液颜色为无色或者淡黄色，弃除上清，得到胎盘组织；

S3，将离心所得胎盘组织匀浆并且过滤，得到滤液a和沉淀物a；

S4，将滤液a进行冷冻和室温融化，反复冻融多次；

S5，将所得沉淀物a酶解，得酶解液A；

S6，将酶解液A离心，取得沉淀物b，并将沉淀物b加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解100min后，终止酶解，得酶解液B；

S7，将酶解液B滤液离心，得沉淀B；

S8，向沉淀B中添加注射用水，并且将混合溶液冷冻和室温融化，反复冻融多次，再将混合溶液离心，得到上清液A；

S9，将滤液a和上清液A混合，过滤，即得人胎盘间充质干细胞外泌体；

S4中冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次；

S5中酶解所用酶为胶原酶；

S6中沉淀A与混合酶的比例为5：1，混合酶包括：胶原酶II0.3％+DNA酶50U/ml+透明质酸钠酶400U/ml；

S7中离心转速为2000rpm并且离心时间为5min；

S8中注射用水为350ml，冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次，离心转速为5000rpm并且离心时间为5min。

实施例4：

本发明提供的一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

S1，在无菌操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；

S2，将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清液颜色为无色或者淡黄色，弃除上清，得到胎盘组织；

S3，将离心所得胎盘组织匀浆并且过滤，得到滤液a和沉淀物a；

S4，将滤液a进行冷冻和室温融化，反复冻融多次；

S5，将所得沉淀物a酶解，得酶解液A；

S6，将酶解液A离心，取得沉淀物b，并将沉淀物b加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解100min后，终止酶解，得酶解液B；

S7，将酶解液B滤液离心，得沉淀B；

S8，向沉淀B中添加注射用水，并且将混合溶液冷冻和室温融化，反复冻融多次，再将混合溶液离心，得到上清液A；

S9，将滤液a和上清液A混合，过滤，即得人胎盘间充质干细胞外泌体；

S4中冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次；

S5中酶解所用酶为胶原酶；

S6中沉淀A与混合酶的比例为5：1，混合酶包括：胶原酶II0.3％+DNA酶50U/ml+透明质酸钠酶400U/ml；

S7中离心转速为2000rpm并且离心时间为5min；

S8中注射用水为500ml，冷冻温度为-80℃，冻融次数为3次，离心转速为5000rpm并且离心时间为5min。

实施例5：

本发明提供的一种脐带间充质干细胞外泌体提取方法，包括以下步骤：

S1，在无菌操作台内用生理盐水清洗胎盘并去除胎盘膜组织；

S2，将胎盘剪碎，加生理盐水，反复离心至上清液颜色为无色或者淡黄色，弃除上清，得到胎盘组织；

S3，将离心所得胎盘组织匀浆并且过滤，得到滤液a和沉淀物a；

S4，将滤液a进行冷冻和室温融化，反复冻融多次；

S5，将所得沉淀物a酶解，得酶解液A；

S6，将酶解液A离心，取得沉淀物b，并将沉淀物b加生理盐水后再离心，得沉淀A，向沉淀A中添加由胶原酶II、DNase和透明质酸酶组成的混合酶溶液，37℃酶解100min后，终止酶解，得酶解液B；

S7，将酶解液B滤液离心，得沉淀B；

S8，向沉淀B中添加注射用水，并且将混合溶液冷冻和室温融化，反复冻融多次，再将混合溶液离心，得到上清液A；

S9，将滤液a和上清液A混合，过滤，即得人胎盘间充质干细胞外泌体；

S4中冷冻温度为-80℃，冻融次数为4次；

S5中酶解所用酶为胶原酶；

S6中沉淀A与混合酶的比例为5：1，混合酶包括：胶原酶II0.3％+DNA酶50U/ml+透明质酸钠酶400U/ml；

S7中离心转速为2000rpm并且离心时间为5min；

S8中注射用水为500ml，冷冻温度为-80℃，冻融次数为4次，离心转速为5000rpm并且离心时间为5min。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，任何熟悉本领域的技术人员均可能利用上述阐述的技术方案对本发明加以修改或将其修改为等同的技术方案。因此，依据本发明的技术方案所进行的任何简单修改或等同置换，尽属于本发明要求保护的范围。