一种幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及于一种幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01及其应用。

背景技术

幽门螺杆菌(Hp)是一种革兰氏阴性细菌，可引起胃粘膜持续感染，可导致炎症、胃和十二指肠溃疡、MALT淋巴瘤和胃癌。幽门螺杆菌产生许多参与疾病发病机制的毒力因子。其中，空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin，VacA)是一种约90kDa的外毒素，已被证明与动物疾病模型中的胃炎症和溃疡有关。VacA有两个功能结构域(p33-37和p55-58)。p33-37结构域有助于细胞毒性，p55-58结构域可介导幽门螺杆菌与靶细胞受体结合，例如鞘磷脂、纤连蛋白、受体蛋白-酪氨酸磷酸酶α(RPTPα)、RPTPβ、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)。大量研究表明，VacA会破坏细胞功能(例如自噬、离子通道形成、细胞内囊泡交通抗原呈递)，最终导致细胞死亡。最新的研究发现，VacA的毒性作用不仅局限于感染部位，还可导致多种全身性症状和并发症，甚至精神症状，例如焦虑和厌食症。

由于VacA在幽门螺杆菌致病机制中的重要作用，目前以VacA为靶标的精准治疗已受到更多关注。有研究报告，从VacA蛋白结构特点或者其与宿主细胞作用的信号通路出发，可研制VacA毒素的拮抗剂，用于VacA相关疾病的治疗。但遗憾的是，目前相关研究均处于初步探索阶段。其中，抗体类药物的成功希望较大，但是抗体固有的制备成本高，保存和运输不便等缺点已经成为其进一步研发的主要障碍。

在幽门螺杆菌病原学检测领域包括无创和有创两大类技术。无创幽门螺杆菌检测技术因操作方便，更适合床旁，甚至由家庭或个人开展。目前主流无创幽门螺杆菌检测技术包括

适配体又被称为“合成抗体”、“化学抗体”，其化学本质是一条单链寡核酸分子(ssDNA或RNA)折叠成特定三维结构与靶物质高亲和力和高特异性结合。适配体的获得通过指数富集配体的系统进化技术(Systematic evolution of ligands byexponentialenrichment,SELEX)的体外筛选过程。核酸适配体具有高亲和力、高特异性、可体外合成、可通过修饰改变其功能及药代动力学特性、无免疫原性、经济等特点。基于上述优势，将核酸适配体作为识别元件，还可开发简便、精准的检测新技术以及高效、经济的亲和纯化系统，开发的核酸适配体药物可特异性阻断靶标功能。因此，筛选出高特异性、高亲和力结合幽门螺杆菌VacA蛋白的核酸适配体具有重要的科研、临床和市场价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高特异性和高亲和力的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01；本发明的另一目的在于提供所述核酸适配体VACA01在制备幽门螺杆菌VacA蛋白检试剂或试剂盒中、在制备样品中幽门螺杆菌VacA蛋白分离纯化试剂中以及在制备VacA蛋白拮抗剂中等多方面的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01，它的序列如下所示：

5’-CATTCGTATGGACTGCGGCTATGACTGATCATGGGCTTCTTGTTCTTAGATATCCTGGCAGCAAGTTCAAAGTACG-3’(SEQ ID NO:1)

优选地，所述核酸适配体VACA01的5’端或3’端进行FITC、氨基、生物素、地高辛基团修饰。

优选地，对所述核酸适配体VACA01可通过PCR扩增或者体外合成的方式制备。

优选地，所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01的应用，在制备幽门螺杆菌VacA蛋白检测试剂中的应用。

优选地，所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01的应用，在分离、纯化幽门螺杆菌VacA蛋白中的应用。

优选地，所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01的应用，在以幽门螺杆菌VacA蛋白为靶标的拮抗剂中的应用。

所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01是基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以羧基磁珠为固相介质，以幽门螺杆菌VacA为靶标，通过幽门螺杆菌VacA磁珠从ssDNA文库中筛选得到与幽门螺杆菌VacA特异性结合的核酸适配体。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：

1.本发明的核酸适配体VACA01无毒性，分子量小，渗透性好，易于合成与标记。

2.本发明的核酸适配体VACA01的合成成本较抗体制备的成本低，且周期短，重现性好。

3.本发明的核酸适配体VACA01能以高亲和力与幽门螺杆菌VacA结合，亲和力达到pM水平，解离常数为23.91pM。

4.本发明的核酸适配体VACA01能够在N-乙酰半胱氨酸环境中，与幽门螺杆菌VacA特异性结合，与其它幽门螺杆菌毒素和结构蛋白不结合。

5.本发明的核酸适配体VACA01在幽门螺杆菌VacA的分离、纯化，幽门螺杆菌感染的诊断和治疗等领域方面具有广阔的应用前景和重要的科学、社会、经济价值。

附图说明

图1为核酸适配体VACA01二级结构的生物学信息学模拟图。

图2为荧光结合率实验分析核酸适配体VACA01的特异性图。在图2中，横坐标为分析的蛋白，纵坐标为荧光结合率。

图3为荧光结合率实验分析核酸适配体VACA01结合幽门螺杆菌VacA的解离常数绘制曲线，解离常数(Kd)为23.91pM。在图3中，横坐标为DNA浓度(pM)，纵坐标为荧光结合率。

图4为中性红法测定核酸适配体VACA01抑制幽门螺杆菌VacA空泡毒性作用的剂量-效果结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

一种幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01，它的序列如下：

5’-CATTCGTATGGACTGCGGCTATGACTGATCATGGGCTTCTTGTTCTTAGATATCCTGGCAGCAAGTTCAAAGTACG-3’(SEQ ID NO:1)。

所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01，在25℃，100mM Na

所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01，对所述核酸适配体VACA01做截短或延长或部分碱基替换的结构改造所得到的产物进行FITC、氨基、生物素、地高辛化学修饰。

所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01是基于核酸适配体的体外SELEX筛选技术，以羧基磁珠为固相介质，以幽门螺杆菌VacA蛋白为靶标，通过幽门螺杆菌VacA磁珠从随机ssDNA文库中筛选得到的。

所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01的筛选方法，它包括以下步骤：

(1)筛选文库的准备：准备以下序列所示的随机ssDNA文库：5’-CATTCGTATGGACTGCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNCAGCAAGTTCAAAGTACG-3’；

(2)将幽门螺杆菌VacA蛋白与羧基磁珠偶联制备幽门螺杆菌VacA磁珠；

(3)将随机ssDNA文库进行热激活处理；

(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的幽门螺杆菌VacA磁珠进行孵育；

(5)磁性分离经步骤(4)后的幽门螺杆菌VacA磁珠，洗去幽门螺杆菌VacA磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；加热幽门螺杆菌VacA磁珠，收集特异性结合的ssDNA，即ssDNA富集文库；

(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库进行PCR扩增，其中PCR扩增所用的引物为：

引物P1：5’-FAM-CATTCGTATGGACTGCGG-3’(SEQ ID NO:2)

引物P2：5’-Biotin-CGTACTTTGAACTTGCTG-3’(SEQ ID NO:3)；

(7)PCR产物的纯化：利用小片段纯化试剂盒对PCR产物进行纯化；将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠进行孵育，结合dsDNA的链霉亲和素磁珠经洗涤、dsDNA解链后，用磁力架分离，收集上清；上清经乙醇沉淀后获得用于下一轮筛选的次级ssDNA文库；

(8)循环筛选：将步骤(7)所得的FAM标记的次级ssDNA文库，作为下一轮筛选的次级文库，并重复步骤(3)～(7)的筛选过程。

实施例一：核酸适配体VACA01的筛选

所述的幽门螺杆菌VacA的核酸适配体VACA01的筛选方法，它包括以下步骤：

(1)筛选初始ssDNA文库的准备：设计两端分别为引物结合区(18个固定核苷酸序列)和中间为随机区域(40个随机核苷酸序列)的ssDNA文库，并委托生工生物工程股份有限公司合成，其序列如下

5’-CATTCGTATGGACTGCGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAGCAAGTTCAAAGTACG-3’。

(2)幽门螺杆菌VacA蛋白与羧基磁珠偶联：所述幽门螺杆菌VacA蛋白(His Tag)购自英国ABCAM公司，采用大肠杆菌表达系统制备，纯度＞90％，所述羧基磁珠及偶联试剂购自美国Bangs Laboratories公司，操作参照制造商提供的说明书；通过BCA法蛋白浓度测定耦联前后幽门螺杆菌VacA溶液中蛋白浓度的变化，经计算磁珠的耦联效率为81.6％；将幽门螺杆菌VacA磁珠分散于1×PBS缓冲液中，4℃保存。

(3)取2nM初始ssDNA文库溶于500μL选择缓冲液(60mM Tris-HCl，100mM NaCl，1.5mM MgCl

(4)将经步骤(3)后的ssDNA文库与步骤(2)所得的幽门螺杆菌VacA磁珠(幽门螺杆菌VacA载量为80ng)以及酵母tRNA(摩尔量为ssDNA文库的5倍)混合并于室温孵育1h。

(5)磁性分离经步骤(4)后的幽门螺杆菌VacA磁珠，用含0.2％ BSA的选择缓冲液洗去幽门螺杆菌VacA磁珠表面未结合、弱结合及非特异性结合的ssDNA；然后将幽门螺杆菌VacA磁珠用200μL ddH

(6)PCR扩增：将步骤(5)所得的ssDNA富集文库加入到1mL PCRmix试剂中；漩涡振荡混匀后，按每管50μL分装进行PCR扩增，扩增条件为：95℃预变性5min后；95℃变性30S，62℃退火30S，72℃延伸30S，13-25个循环。

其中1mL PCRmix中含有：10×PCR缓冲液100μL；pfu酶和Taq酶各1μL；dNTP 20μL；引物P1：5’-FAM-CATTCGTATGGACTGCGG-3’和引物P2：5’-Biotin-CGTACTTTGAACTTGCTG-3’各3μL；所述引物P1和引物P2均委托生工生物工程股份有限公司合成。

(7)PCR产物的纯化：两端分别标有生物素和荧光基团FAM的PCR产物，使用小片段纯化试剂盒纯化(所述的小片段纯化试剂盒购买自生工生物工程股份有限公司)，将纯化后的dsDNA与链霉亲和素磁珠(购自Invitrogen-Dynal公司)在37℃孵育20min，用洗涤缓冲液(5mM Tris-HCl，pH 7.4，1.2M NaCl，500μM EDTA)洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠3次后，用50μL NaOH溶液(0.2M)在37℃孵育30min使dsDNA解链；用磁力架分离，收集上清，上清经乙醇沉淀获得FAM标记的次级ssDNA文库，并溶解于选择缓冲液中，作为下一轮筛选的次级文库。

(8)筛选过程共进行11轮。从第二轮开始，次级文库的用量均为40pM。

实施例二：核酸适配体VACA01序列的分析

(1)经过11轮筛选后，收集富集的ssDNA文库，并用高通量测序技术对文库序列进行分析，分析过程为：PCR扩增富集文库，并加上测序接头和Index部分；通过凝胶电泳选择纯化文库；利用Qbit对纯化文库进行定量分析；利用Agilent 2100Bioanalyzer通过Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库质控；利用Quant-iT PicogGreen dsDNAAssay Kit对文库进行定量；利用Illumina Novaseq6000平台，以单链文库为模板进行桥式PCR扩增、测序引物退火、边合成边测序；并对测序结果进行比对和富集分析。

(2)根据核酸适配体在文库中的富集程度，选取富集程度高的ssDNA作为候选核酸适配体，其中核酸适配体VACA01在富集文库中占比18.2％，它的序列如SEQ ID NO:1所示。

(3)利用UNAFold网络平台分析在25℃，100mM Na

实施例三：核酸适配体VACA01的特异性分析

(1)将体外化学合成FAM标记的核酸适配体VACA01，并溶于选择缓冲液，所述选择缓冲液溶解了终浓度为0.1％的N-乙酰半胱氨酸(NAC)，N-乙酰半胱氨酸纯品购买自上海翊圣生物科技有限公司。

(2)参照实施例一中步骤(2)，将BSA、幽门螺杆菌CagA、HpaA、BabA、GroEL蛋白别与羧基磁珠耦联制备BSA磁珠、幽门螺杆菌VacA磁珠、HpaA磁珠、BabA磁珠、GroEL磁珠。其中，所述BSA购自Sigma公司，所述幽门螺杆菌CagA、HpaA、BabA、GroEL蛋白均购自英国ABCAM公司。

(3)取200μL步骤(1)所得的核酸适配体VACA01溶液分别与步骤(2)制得的BSA磁珠、幽门螺杆菌CagA磁珠、HpaA磁珠、BabA磁珠、GroEL磁珠和以及幽门螺杆菌VacA磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h，设空白磁珠为对照。

(4)用0.1％PBST洗涤经步骤(3)的上述磁珠3遍，与上述磁珠结合的核酸适配体，用200μL选择缓冲液100℃煮沸5min洗脱。

(5)利用荧光定量仪分别测定初始溶液和洗脱液的荧光强度，计算荧光结合率＝(初始荧光强度-洗脱荧光强度)/初始荧光强度×100％，用计算值初步代表核酸适配体VACA01与靶分子的结合率。

如图2所示，核酸适配体VACA01与幽门螺杆菌VacA的结合率均显著高于其与BSA、幽门螺杆菌CagA、HpaA、BabA、GroEL蛋白的结合率，表明核酸适配体VACA01在0.1％的N-乙酰半胱氨酸环境中，与幽门螺杆菌VacA的结合具有较好的特异性。进一步说明，核酸适配体VACA01在建立粪便VacA抗原检测试剂盒方面具有潜力。

实施例四：核酸适配体VACA01的亲和力分析

(1)取不同浓度的FAM标记核酸适配体溶液分别与幽门螺杆菌VacA磁珠混合，在暗盒中室温孵育1h。

(2)参照实施例三中的步骤(4)和步骤(5)，实验获得并计算不同浓度核酸适配体溶液与幽门螺杆菌VacA磁珠的荧光结合率。

(3)利用荧光结合率的计算值，绘制核酸适配体结合幽门螺杆菌VacA的饱和结合曲线，通过非线性回归分析计算核酸适配体结合幽门螺杆菌VacA的解离常数。

如图3所示，我们获得了核酸适配体VACA01的饱和结合曲线，经计算核酸适配体VACA01的解离常数为23.91pM，表明核酸适配体VACA01与幽门螺杆菌VacA结合的结合能力强，解离常数在皮摩尔级别。

实施例五：核酸适配体VACA01抑制VacA的毒力作用

(1)人胃癌细胞系AZ-521细胞购买自南京科佰生物科技有限公司，在含有10％胎牛血清(FBS，购自Sigma公司)的MEME培养基(购自Sigma公司)中培养。

(2)使用AZ-521细胞评估VacA的毒性作用。AZ-521细胞按照浓度1×10

(3)各组加入核酸适配体VACA01的浓度分别依次为0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM，每孔加入终浓度为120nM的VacA蛋白，设置不加VacA蛋白和核酸适配体VACA01的空白对照组。继续培养5h。

(4)将细胞与50μL新鲜制备的0.05％中性红(购自碧云天公司)在含有0.3％ BSA的1×PBS中孵育，然后用0.1mL含有0.3％ BSA的1×PBS洗涤3次。在0.4％盐酸溶液中加入0.1mL的70％乙醇后，分光光度计检测540nm的吸光度(OD)。

如图4所示，横坐标为核酸适配体VACA01的浓度，纵坐标为540nm处的OD值。随着核酸适配体VACA01浓度的增加，VacA蛋白导致空泡的作用明显降低(P＜0.05)，上述结果表明核酸适配体VACA01在体外实验中能够以剂量依赖的方式对VacA蛋白的毒性作具有明显地抑制作用，是一种潜在的VacA蛋白抑制剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以进行若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。