一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和微生物制品领域领域，尤其涉及一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂、制备方法及其应用。

背景技术

疫苗是指用各类病原微生物制作的用于预防接种的生物制品,按病原微生物为细菌或病毒又将疫苗分类为细菌疫苗和病毒疫苗。在病毒类疫苗生产制造环节中，病毒增殖收获后冻干前称为疫苗半成品，在生产成品疫苗前，半成品通常在-20℃冻藏周转1-3周，该过程导致病毒活性损失严重、下降至少90％，后期难以达到配苗标准、造成半成品浪费；相反，在-70℃甚至更低温度下冻藏后，病毒活性损失较小甚至不损失。推测其原因与冰晶形成大小相关，一般冻结速度越快，形成冰晶的形状就越细小，冰晶分布越接近新鲜物料中原来水分的分布状态。冻结速度较慢的，容易在原地形成冰晶，水分在开始时即多向这些冰晶移动，形成了较大的冰体。但在疫苗实际生产时，由于-70℃冷库能耗过大，通常疫苗制造企业只建有-20℃冷库。所以，考虑在-20℃慢速冻结时调节冰晶大小、同时保护病毒是解决病毒类疫苗半成品冻存损伤的有效解决途径之一。

传统冻存保护剂有甘油、二甲亚砜等，但二甲亚砜存在细胞毒性，而甘油的添加在疫苗半成品中作用甚微，因此，在疫苗制造行业中，亟需开发有效新型疫苗半成品冻存保护剂。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂、制备方法及其应用，能够使病毒类疫苗半成品在-20℃冻藏周转时稳定保存1个月，以保证疫苗半成品有效活性，为后续疫苗生产制备作保障。

本发明采用的技术方案是：

一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂，其中，按质量百分比计，包括以下组分：2～15％蔗糖、5～25％海藻糖、0.5～2％普鲁兰糖、1～3％甘露醇、0.1～3％L-羟脯氨酸，0.15～3％ε-多聚赖氨酸，0.1～5％甘氨酸，余量为注射用水，以上总和为100％。

多羟基糖类是一类能对蛋白质冷冻变性起到抑制作用的物质，例如蔗糖、海藻糖、普鲁兰糖等，可有效抑制冰晶生长作用，从而减少冰晶对病毒的机械性损伤；海藻糖是由两分子葡萄糖通过半缩醛羟基结合而成的一种非还原性双糖，常见于低等植物、酵母、昆虫等多种生物体内，是常见的天然低温冻存保护剂之一，在低温等极端环境下，一定浓度的海藻糖可以抑制冰晶的生长及形貌，更重要的是，海藻糖可以通过增加脂膜流动性、维持脂膜液晶相和抗氧化作用等机制调节病毒对冷冻损伤耐受性；蔗糖可以通过改变蛋白质中结合水的状态，与蛋白质分子结合，抑制蛋白质的冷冻变性以提高稳定性；甘露醇可通过降低冰点调控冰晶形貌；L-羟脯氨酸是一种渗透性冷冻保护剂，可与水氢键结合抑制低温下冰晶形成；ε-多聚赖氨酸是一种阳离子聚合多肽，与海藻糖等物质协同可增强膜通透性，加速海藻糖渗入膜内从而起到稳定作用。

一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂的制备方法，其中，包括以下步骤：

S1.将质量配比称取蔗糖、海藻糖、普鲁兰糖、甘露醇溶于注射用水中，充分溶解并于121℃加热灭菌15～20min后备用；

S2.按质量配比称取L-羟脯氨酸、ε-多聚赖氨酸和甘氨酸溶于注射用水中，充分溶解，0.22μ过滤除菌后备用；

S3.将步骤S1和S2制得的溶液于无菌条件下混合，并通过调节液调节溶液pH至7.0～7.5，即得到病毒类疫苗半成品冻存保护剂。

优选的是，所述的病毒类疫苗半成品冻存保护剂的制备方法，其中，所述步骤S3的调节液为稀盐酸和氢氧化钠的一种或两种。

一种病毒类疫苗半成品冻存保护剂在病毒类疫苗半成品保存中的应用。

优选的是，所述的病毒类疫苗半成品冻存保护剂在病毒类疫苗半成品保存中的应用，其中，所述疫苗半成品和冻存保护剂按照8～5：1的体积比混合均匀。

优选的是，所述的病毒类疫苗半成品冻存保护剂在病毒类疫苗半成品保存中的应用，其中，所述病毒类疫苗半成品指动物用病毒疫苗，包括猪瘟疫苗、猪繁殖与呼吸综合征疫苗、鸡传染性支气管炎疫苗。

本发明的优点在于：

(1)本发明病毒类疫苗半成品冻存保护剂，应用在现有病毒类疫苗半成品的保存环节，可以更好调控冷冻时冰晶的形貌、减少病毒冻存损伤，解决了行业内疫苗半成品高效稳定冻藏的问题，为后续高品质疫苗的生产提供更有力保障，并且半成品冻存保护剂配制简单、操作简便，具有极高的应用前景。

(2)本发明病毒类疫苗半成品冻存保护剂，将海藻糖、蔗糖、普鲁兰糖、甘露醇、脯氨酸、多聚赖氨酸、甘氨酸成分配伍制成冻存保护剂，冻存保护剂可有效调节冰晶形貌，将冻存保护剂与病毒类疫苗的半成品按一定比例进行混合后，可有效保证病毒类疫苗半成品在-20℃冻藏1个月内活性损失不超过0.5个滴度，为后续高品质疫苗的生产提供有力技术保障。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明实施例1添加半成品冻存保护剂前后猪瘟病毒溶液冷冻时形成的冰晶尺寸形貌。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种猪瘟疫苗半成品冻存保护剂，其中，按质量百分比计，包括以下组分：15％蔗糖、5％海藻糖、2％普鲁兰糖、1％甘露醇、1.5％L-羟脯氨酸，1.5％ε-多聚赖氨酸，3％甘氨酸，余量为注射用水。

一种猪瘟疫苗半成品冻存保护剂的制备方法，其中，包括以下步骤：

S1.将质量配比称取蔗糖、海藻糖、普鲁兰糖、甘露醇溶于注射用水中，充分溶解并于121℃加热灭菌15min后备用；

S2.按质量配比称取L-羟脯氨酸、ε-多聚赖氨酸和甘氨酸溶于注射用水中，充分溶解，0.22μ过滤除菌后备用；

S3.将步骤S1和S2制得的溶液于无菌条件下混合，并通过稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH至7.0～7.5，即得到病毒类疫苗半成品冻存保护剂。

将猪瘟疫苗半成品分别与上述猪瘟疫苗半成品冻存保护剂按照8：1的体积比混合均匀，即得到具有-20℃冻藏保护效果的猪瘟疫苗半成品溶液，将其放入-20℃冻存1个月、2个月和3个月后检测猪瘟病毒活性，同时将不添加任何成分的猪瘟疫苗半成品也放入-20℃作为对照。具体结果见表1。

表1添加疫苗半成品前后猪瘟病毒冻存于-20℃后病毒效价情况

通过表1可以看出，采用本发明疫苗半成品冻存保护剂配制的猪瘟疫苗半成品在-20℃冻存保护效果显著好于未添加冻存保护剂组，表现在-20℃冻存1个月病毒效价损失0.5个滴度，而未添加冻存保护剂组损失1.75个滴度，差异明显；而且，-20℃冻存2个月，添加冻存保护剂的猪瘟疫苗半成品组病毒效价降低1.0个滴度，而未添加冻存保护剂组损失2.25个滴度；-20℃冻存3个月，添加冻存保护剂的猪瘟疫苗半成品组病毒效价降低1.75个滴度，而未添加冻存保护剂组损失3个滴度，说明本发明的冻存保护剂在猪瘟疫苗半成品-20℃冻存时可以增强病毒稳定性。

图1为添加半成品冻存保护剂前后猪瘟病毒溶液冷冻时形成的冰晶尺寸形貌，从图1可以看出，添加了冻存保护剂后的猪瘟病毒溶液，与未添加的相比，冷冻后冰晶尺寸明显减小，粒径也更加均一，这与猪瘟病毒效价检测结果也基本一致。

实施例2

一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品冻存保护剂，其中，按质量百分比计，包括以下组分：2％蔗糖、25％海藻糖、0.5％普鲁兰糖、2％甘露醇、0.1％L-羟脯氨酸，0.15％ε-多聚赖氨酸，3％甘氨酸，余量为注射用水；

一种猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品的制备方法，其中，包括以下步骤：

S1.将质量配比称取蔗糖、海藻糖、普鲁兰糖、甘露醇溶于注射用水中，充分溶解并于121℃加热灭菌15min后备用；

S2.按质量配比称取L-羟脯氨酸、ε-多聚赖氨酸和甘氨酸溶于注射用水中，充分溶解，0.22μ过滤除菌后备用；

S3.将步骤S1和S2制得的溶液于无菌条件下混合，并通过稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH至7.0～7.5，即得到病毒类疫苗半成品冻存保护剂。

将猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品分别与上述配制好的疫苗冻存保护剂按照5：1的体积比混合均匀，即得到具有-20℃冻藏保护效果的猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品溶液。将其放入-20℃冻存1个月、2个月和3个月后检测猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品中的病毒活性，同时将不添加任何成分的猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品也放入-20℃作为对照。具体结果见表2。

表2添加疫苗半成品前后猪繁殖与呼吸综合征病毒冻存于-20℃后病毒效价情况

通过表2可以看出，采用本发明疫苗半成品冻存保护剂配制的猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品在-20℃冻存保护效果显著好于未添加冻存保护剂组，表现在-20℃冻存1个月病毒效价损失0.42个滴度，而未添加冻存保护剂组损失1.25个滴度，差异明显；而且，-20℃冻存2个月，添加冻存保护剂的猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品组病毒效价降低1.0个滴度，而未添加冻存保护剂组损失1.75个滴度，说明本发明的冻存保护剂在猪繁殖与呼吸综合征疫苗半成品-20℃冻存时可以增强病毒稳定性。

实施例3

一种鸡传染性支气管炎疫苗半成品半成品冻存保护剂，其中，按质量百分比计，包括以下组分：7％蔗糖、15％海藻糖、1.0％普鲁兰糖、3％甘露醇、3％L-羟脯氨酸，3％ε-多聚赖氨酸，0.1％甘氨酸，余量为注射用水；

一种鸡传染性支气管炎疫苗半成品冻存保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将质量配比称取蔗糖、海藻糖、普鲁兰糖、甘露醇溶于注射用水中，充分溶解并于121℃加热灭菌15min后备用；

S2.按质量配比称取L-羟脯氨酸、ε-多聚赖氨酸和甘氨酸溶于注射用水中，充分溶解，0.22μ过滤除菌后备用；

S3.将步骤S1和S2制得的溶液于无菌条件下混合，并通过稀盐酸和/或氢氧化钠调节溶液pH至7.0～7.5，即得到病毒类疫苗半成品冻存保护剂。

将鸡传染性支气管炎疫苗半成品分别与上述疫苗半成品冻存保护剂按照6.5：1的体积比混合均匀，即得到具有-20℃冻藏保护效果的鸡传染性支气管炎疫苗半成品溶液。将其放入-20℃冻存1个月、2个月和3个月后检测鸡传染性支气管炎疫苗半成品中的病毒活性，同时将不添加任何成分的鸡传染性支气管炎疫苗半成品也放入-20℃作为对照。具体结果见表3。

表3添加疫苗半成品前后鸡传染性支气管炎病毒冻存于-20℃后病毒效价情况

通过表3可以看出，采用本发明疫苗半成品冻存保护剂配制的鸡传染性支气管炎疫苗半成品在-20℃冻存保护效果显著好于未添加冻存保护剂组，表现在-20℃冻存1个月病毒效价损失0.55个滴度，而未添加冻存保护剂组损失1.0个滴度，差异明显；而且，-20℃冻存2个月，添加冻存保护剂的鸡传染性支气管炎疫苗半成品组病毒效价降低1.0个滴度，而未添加冻存保护剂组损失1.58个滴度，说明本发明的冻存保护剂在鸡传染性支气管炎疫苗半成品-20℃冻存时可以增强病毒稳定性。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。