一种基因工程细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明是涉及一种基因工程细胞及其制备方法和应用，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

NK细胞是机体固有免疫系统的重要成员之一，担负着机体免疫监视的重要作用。NK细胞免疫治疗的主要优势在于NK细胞识别靶细胞不需要预先致敏，可直接攻击病毒感染的细胞和肿瘤细胞，且NK细胞识别和杀伤肿瘤细胞不受MHC-I限制，并且NK细胞过继免疫治疗不引起移植物抗宿主疾病(GVHD)。因此，基于NK细胞的肿瘤免疫治疗具有其独特的优势和良好的应用前景。

尽管NK细胞过继免疫治疗具有良好的抗肿瘤效应和应用前景，但NK细胞免疫治疗仍然难以常规临床应用，一个重要障碍在于人类NK细胞仅占外周血单核细胞的10～15％，NK细胞在数目上难以满足巨大的临床需要。为解决这一难题，首先要建立高效的NK细胞体外扩增体系，以首先在数量上保证NK细胞的有效供给。

现有NK细胞扩增技术可归为两类：细胞因子组合物扩增技术和饲养细胞扩增技术。其中饲养细胞扩增技术在扩增倍数和扩增试剂的经济性上均优于细胞因子组合物扩增技术。应用基因工程细胞作为饲养细胞(feeder cell)进行NK细胞体外扩增是一种重要的NK细胞扩增新策略。在以往的研究中有研究者应用CD64、CD86修饰K562细胞构建人工抗原递呈细胞(Artificial antigen present cell,aAPC)，然后将4-1BBL(CD137L)和膜固定(IL15membrane-bound IL-15,mIL-15)等导入此细胞中，构建成CD64-CD86-4-1BBL-mIL15-aAPC，并利用此人工抗原递呈细胞进行NK细胞体外扩增，这种方法可以获得较强细胞毒性的NK细胞，但NK细胞增殖受到限制，5～6周后细胞不再扩增。另一些研究者将4-1BBL和膜固定IL-21(mbIL-21)直接修饰到K562细胞表面，构建成4-1BBL-mbIL-21-K562细胞，该细胞相对于CD64-CD86-4-1BBL-mIL15-aAPC更简单易操作，且能诱导产生大规模功能性的NK细胞，但CD64-CD86-4-1BBL-mIL15-aAPC和4-1BBL-mbIL-21-K562均采用IgG4作为膜固定分子的连接片段，扩增得到的NK细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediated cytotoxicity,ADCC)的效应较低。

而ADCC是NK细胞杀伤肿瘤细胞的重要武器，ADCC高反应性是提高NK细胞抗肿瘤免疫反应的重要手段。因此，抗体与过继NK细胞治疗相结合，是利用ADCC效应提高NK细胞抗肿瘤免疫反应的有效手段。但抗体与NK细胞表面CD16受体持续接触，可通过受体内化或ADAM17依赖的切割，导致CD16水平显著下降，从而影响NK细胞的ADCC效应【Blood 2013,121,3599–3608.】【J.Leukoc.Biol.2019,105,1297–1303.】。还有研究者发现，IgG1抗体与CD16持续接触可诱导NK细胞耗竭。如利妥昔单抗是IgG1类抗CD20抗体，理应通过与NK细胞表面CD16结合增强NK细胞对白血病细胞的杀伤作用，但实际上利妥昔单抗却降低了NK细胞对白血病细胞的杀伤作用，其原因在于利妥昔单抗通过CD16诱导了NK细胞耗竭【CancerResearch,75(19):4097-4108,2015】。

由于IgG1与CD16持续接触能够下调CD16表达，诱导NK细胞耗竭，所以现有技术在进行NK细胞体外扩增时均选用IgG4作为连接膜固定分子的胞外片段。IgG4作为连接片段，在NK细胞扩增时CD16表达并不下调，但当此类NK细胞接触到IgG1类抗体药物时，CD16却显著下降，导致ADCC作用大幅降低。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种基因工程细胞及其制备方法和其在扩增制备具有ADCC高反应性NK细胞中的应用。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供的基因工程细胞，为4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞，其细胞膜表面能稳定表达4-1BB配体4-1BBL且含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白mbIL-21-hIgG1片段。

本发明上述基因工程细胞的制备，包括如下过程：

a)构建4-1BBL表达的转座子；

b)先使4-1BBL转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，然后进行流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达的K562细胞，即：4-1BBL-K562细胞；

c)将mbIL-21蛋白与人源免疫球蛋白1：hIgG1的Fc片段连接成融合蛋白mbIL-21-hIgG1，该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

d)将步骤c)构建的融合蛋白mbIL-21-hIgG1导入步骤b)获得的4-1BBL-K562细胞中，建立4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞。

一种实施方案，步骤c)的具体操作如下：

c1)从4-1BBL/pCR4-TOPO质粒中PCR扩增并回收得到3’端包含人源免疫球蛋白1：hIgG1 5’端片段的mbIL-21扩增片段；

c2)根据pfuse-hIgG1质粒序列设计一对含有mbIL-21 3’端片段的引物，然后从pfuse-hIgG1质粒中PCR扩增并回收得到5’端包含mbIL-21 3’端片段的hIgG1扩增片段；

c3)根据巢式PCR，利用mbIL-21扩增片段的前引物与hIgG1扩增片段的后引物将mbIL-21与hIgG1相连接，扩增并回收得到核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白mbIL-21-hIgG1片段。

本发明所述基因工程细胞的一种应用，是作为具有ADCC高反应性NK细胞体外扩增的饲养细胞。

上述具有ADCC高反应性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：

A)采用致死性照射或丝裂霉素预处理本发明所述的基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞；

B)使预处理后的基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞与外周血单核细胞按1:1混合，然后在NK细胞体外扩增培养液中共培育；

C)每周重复刺激扩增后细胞1次，连续数周。

一种实施方案，步骤A)中所述的致死性照射是采用≥100Gy放射线照射。

一种实施方案，步骤A)中所述的丝裂霉素预处理是指采用10～20μg/mL丝裂霉素处理本发明所述的基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞3～5小时。

一种实施方案，步骤B)中所述的NK细胞体外扩增培养液是含有10％FBS、1％链霉素/青霉素双抗、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL IL-2的RPMI1640培养液。

与现有技术相比，本发明具有如下显著性有益效果：

本发明的研究结果显示，通过本发明所述的基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞可体外扩增获得具有ADCC高反应性NK细胞，而且所获得的具有ADCC高反应性NK细胞具有CD16更高表达水平，尤其是，所获得的具有ADCC高反应性NK细胞与肿瘤细胞和/或/IgG1类抗体接触后，仅使CD16轻微下降，与现有技术相比，本发明产生了出乎意料的技术效果，所获得的具有ADCC高反应性NK细胞具有明显的肿瘤细胞杀伤效应，对增强抗体药物靶向疗法和NK细胞免疫疗法的疗效具有重要价值和意义。

附图说明

图1体现了PCR扩增获得的编码人源免疫球蛋白1(hIgG1)和膜固定白介素21(mbIL-21)的hIgG1扩增片段和mbIL-21扩增片段。

图2体现了通过巢式PCR将hIgG1与膜固定IL-21相连接成的融合蛋白mbIL-21-hIgG1的DNA片段。

图3体现了编码融合蛋白mbIL-21-hIgG1的转座系统质粒图谱。

图4体现了通过转染转座系统质粒使4-1BBL-K562基因工程细胞表达融合蛋白mbIL-21-hIgG1。

图5体现了经过流式分选后建立稳定表达融合蛋白mbIL-21-hIgG1的基因工程细胞，即4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562。

图6体现了4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562两种基因工程细胞在不同时间点扩增NK细胞的扩增倍数。

图7体现了4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562两种基因工程细胞在不同时间点扩增获得的NK细胞的纯度。

图8体现了4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562两种基因工程细胞在不同时间点扩增获得的CD3-/CD56+/CD16+NK细胞的比例。

图9和图10体现了4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562两种基因工程细胞扩增14天所获得的NK细胞的ADCC活性。

图11体现了肿瘤靶向IgG1抗体对4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562两种基因工程细胞扩增14天所获得的NK细胞的表面CD16受体表达的影响。

图12体现了肿瘤细胞对4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562两种基因工程细胞扩增14天所获得的NK细胞的表面CD16受体表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：本发明所述基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562的制备

a)构建4-1BBL表达的转座子：从Open Biosysems(Thermo Fisher Scientific,CO,USA)购买4-1BBL/pCR4-TOPO质粒，PCR扩增，然后插入GlySer-EGFP(CoOp)-pSBSO睡美人表达载体的Nhe I-XhoI位点，构建4-1BBL/pSBSO转座子；

b)先使4-1BBL/pSBSO转座子与转座酶SB11共转染K562细胞，然后进行流式细胞分选，获得4-1BBL稳定表达的K562细胞，即：4-1BBL-K562细胞；

c)将mbIL-21蛋白与人源免疫球蛋白1：hIgG1的Fc片段连接成融合蛋白mbIL-21-hIgG1，该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体操作如下：

c1)从Open Biosysems(Thermo Fisher Scientific,CO,USA)购买4-1BBL/pCR4-TOPO质粒，从4-1BBL/pCR4-TOPO质粒中PCR扩增并回收得到3’端包含人源免疫球蛋白1：hIgG15’端片段的500bp的目的片段：mbIL-21扩增片段(如图1所示)；

c2)从Open Biosysems(Thermo Fisher Scientific,CO,USA)购买pfuse-hIgG1质粒，根据pfuse-hIgG1质粒序列设计一对含有mbIL-21 3’端片段的引物，然后从pfuse-hIgG1质粒中PCR扩增并回收得到5’端包含mbIL-21 3’端片段的780bp的目的片段：hIgG1扩增片段(如图1所示)；

c3)根据巢式PCR，利用mbIL-21扩增片段的前引物与hIgG1扩增片段的后引物将mbIL-21与hIgG1相连接，扩增并回收得到1280bp的目的片段：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的融合蛋白mbIL-21-hIgG1片段；

d)将步骤c)构建的融合蛋白mbIL-21-hIgG1导入步骤b)获得的4-1BBL-K562细胞中，建立4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞，具体操作如下：

1)通过限制性内切酶Nhel和XhoI，对Fluc-pSBSO转座子质粒和mbIL-21-hIgG1片段进行酶切，然后进行DNA胶回收，获得双酶切后的线性片段；

2)利用T4连接酶，将转座子质粒的酶切回收产物与mbIL-21-hIgG1酶切回收产物连接，获得重组的pSB-mbIL-21-hIgG1转座子质粒(如图3所示)；

3)将重组的pSB-mbIL-21-hIgG1转座子质粒进行Top10感受态细菌转化，然后依据其卡那霉素抗性进行铺板挑斑，获得成功转化的感受态细菌；

4)利用质粒提取试剂盒提取菌液中包含的质粒，并对质粒进行酶切、测序比对，挑选获得构建正确的pSB-mbIL-21-hIgG1转座子质粒；

5)利用lipo3000转染试剂，按脂质体与总DNA质量比例为3:1对4-1BBL-K562细胞进行转染，转座酶质粒SB11与转座子质粒pSB-mbIL-21-hIgG1比例为1:4，总DNA量为2.5μg；

6)转染前一天铺六孔板，转染当天按转染试剂说明书，获得脂质体与DNA混合物，将其滴加至细胞培养液中，继续培养；

7)第二天补加2mL新鲜培养基；第三天收集部分细胞，流式检测IL-21表达情况(结果如图4所示)，以确定转染成功；

8)将转染成功细胞转至培养瓶中扩大培养，然后收集细胞，计数，按1*10

9)进行流式分选，获得的阳性细胞收集于含3μL/mL庆大霉素的新鲜培养基中，然后转至96孔板中培养，待细胞群落扩增至合适数量，再转至24孔板、6孔板、25cm

10)收集部分分选细胞，mbIL-21-PE荧光标记抗体染色，再次进行流式验证(结果如图5所示)。

实施例2：体外扩增NK细胞

1、用淋巴细胞分离液分离人外周血单核细胞；

2、采用100Gy放射线照射本发明获得的基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞，或采用15μg/mL丝裂霉素处理本发明获得的基因工程细胞：4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562细胞4小时；之后，用PBS洗细胞3次；

3、先使预处理过的基因工程细胞与淋巴细胞按1:1混合，然后在含有10％FBS、1％链霉素/青霉素双抗、2mM L-谷氨酰胺、50U/mL IL-2的RPMI1640培养液中于5％CO

4、按步骤3每周重复刺激扩增后细胞1次，连续数周。

在不同时间点，检测NK细胞扩增倍数(检测结果如图6所示)、检测CD3-/CD56+NK细胞纯度(检测结果如图7所示)和检测CD3-/CD56+/CD16+NK细胞比例(检测结果如图8所示)。

由图6至图8显示的结果可见：在长期的体外扩增过程中，以IgG1作为mbIL-21连接片段的基因工程细胞4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562与以IgG4作为mbIL-21连接片段的基因工程细胞4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562相比，虽然两者具有同样高效的扩增倍数(见图6所示)，且均能获得高纯度的CD3-/CD56+NK细胞(见图7所示)，但以IgG1作为mbIL-21连接片段的基因工程细胞4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562相对于以IgG4作为mbIL-21连接片段的基因工程细胞4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562，本发明扩增得到的NK细胞表达CD16分子的比例更高(见图8所示)。

实施例3：考察体外扩增NK细胞的ADCC反应活性

1、分别收集H1299和A549肺癌细胞进行计数，将细胞悬液浓度调整至2×10

2、分别收集由4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562(对比例)和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562(本发明)基因工程细胞扩增14天的NK细胞进行计数，将细胞悬液浓度调整至2×10

3、将NK细胞与肿瘤细胞按1:1的比例混合；

4、向96孔板中加入单独NK细胞50μL，单独肺癌细胞50μL，或上述细胞悬液100μL；

5、向单独NK细胞或单独肺癌细胞的孔中加入50μL细胞培养液，补足体积至100μL；

6、向ADCC组中加入肿瘤靶向抗体，终浓度为10μg/mL，对照组加入相同体积的PBS缓冲液；

7、培养24h后，每孔加入100μL CellTiter-Glo(购自Promega公司，货号G7571)生物发光检测试剂；

8、室温震荡1min后，静置10min，随后与酶标仪检测生物发光强度；

9、按以下公式计算NK细胞杀伤活力：

Mean

Mean

Mean

根据图9和图10所示结果可见：以IgG4作为mbIL-21连接片段的基因工程细胞扩增得到的NK细胞在肿瘤靶向抗体的作用下对癌细胞的杀伤活性相对于无抗体时显著下降，而通过本发明提供的4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562基因工程细胞扩增得到的NK细胞在肿瘤靶向抗体的作用下对癌细胞的杀伤活性相对于无抗体时显著增加，表明通过本发明提供的4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562基因工程细胞扩增得到的NK细胞具有更高的ADCC反应性和更好的抗肿瘤活性，相对于现有技术，产生了出乎意料的技术效果。

实施例4：考察IgG1肿瘤靶向抗体对体外扩增NK细胞CD16受体表达的影响

1、分别收集H1299和A549肺癌细胞进行计数，将细胞悬液浓度调整至2×10

2、分别收集由4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562(对比例)和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562(本发明)基因工程细胞扩增14天的NK细胞进行计数，将细胞悬液浓度调整至2×10

3、将NK细胞与肿瘤细胞按1:1的比例混合；

4、向6孔板各孔中加入上述细胞悬液2mL；

5、向ADCC组中加入肿瘤靶向抗体，终浓度为10μg/mL，对照组加入相同体积的PBS缓冲液；

6、培养24h后，收集6孔板各孔中的混合细胞悬液至离心管中，离心5分钟；

7、弃上清，向离心管中加入1mL含1％胎牛血清的PBS缓冲液洗涤一次，离心5分钟；

8、弃上清，向离心管中加入50μL含1％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞，随后加入抗CD3、抗CD56和抗CD16荧光标记抗体进行染色，4℃染色20分钟；

9、向离心管中加入1mL含1％胎牛血清的PBS缓冲液洗涤一次，离心5分钟；

10、向离心管中加入200μL含1％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞，于流式细胞仪检测荧光信号强度。

由图11所示结果可知：通过本发明提供的4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562基因工程细胞扩增得到的NK细胞具有更高ADCC反应性的原因在于本发明采用了hIgG1作为连接mbIL-21的片段，在NK细胞扩增时给予NK细胞持续的IgG1信号刺激，从而选择性地扩增出CD16高表达且CD16分子不易丢失的NK细胞，该结果根据现有技术和公知常识，具有不可预见性，产生了出乎意料的技术效果。

实施例5：考察癌细胞对体外扩增NK细胞CD16受体表达的影响

1、分别收集H1299和A549肺癌细胞进行计数，将细胞悬液浓度调整至2×10

2、分别收集由4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562(对比例)和4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562(本发明)基因工程细胞扩增14天的NK细胞进行计数，将细胞悬液浓度调整至2×10

3、将NK细胞与肿瘤细胞按1:1的比例混合；

4、向6孔板各孔中加入上述细胞悬液2mL。；

5、培养24h后，收集6孔板各孔中的混合细胞悬液至离心管中，离心5分钟；

6、弃上清，向离心管中加入1mL含1％胎牛血清的PBS缓冲液洗涤一次，离心5分钟；

7、弃上清，向离心管中加入50μL含1％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞，随后加入抗CD3、抗CD56和抗CD16荧光标记抗体进行染色，4℃染色20分钟；

8、向离心管中加入1mL含1％胎牛血清的PBS缓冲液洗涤一次，离心5分钟；

9、向离心管中加入200μL含1％胎牛血清的PBS缓冲液重悬细胞，于流式细胞仪检测荧光信号强度。

由图12所示结果可知，通过本发明提供的4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562基因工程细胞扩增得到的NK细胞相对于现有技术(如：4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562)扩增得到的NK细胞，本发明扩增获得的NK细胞与癌细胞持续接触后，CD16分子不会丢失，而现有技术(如：4-1BBL-mbIL-21-hIgG4-K562)扩增得到的NK细胞与癌细胞持续接触后CD16分子大幅丢失，导致其ADCC反应性下降，进一步说明本发明提供的4-1BBL-mbIL-21-hIgG1-K562基因工程细胞产生了出乎意料的技术效果。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。