一种7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)，化学名称为3a,7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸，为有机化合物，无臭，味苦。医学上用于增加胆汁酸分泌，并使胆汁成分改变，降低胆汁中胆固醇及胆固醇脂，增加胆汁中胆汁酸的含量，能抑制肝脏胆固醇的合成，显著降低胆汁中胆固醇及胆固醇酯的量和胆固醇的饱和指数，从而有利于结石中胆固醇逐渐溶解。此外，UDCA还能促进液态胆固醇晶体复合物形成，加速胆固醇从胆囊向肠道排泄清除。国外研究亦表明熊去氧胆酸在慢性肝脏疾病中具有免疫调节作用，能明显降低肝下沉物HLAI类抗原的表达，降低活化T下沉物的数目。熊去氧胆酸在体内溶解胆固醇结石的效果优于鹅去氧胆酸(CDCA)。

目前生物法参与的熊去氧胆酸的合成中，主要研究重点在于如何以胆酸为底物区域选择性的氧化12α-OH以及7α-OH，酶法表现出优异的结果。工业生产中尝试利用较为廉价易得的鹅去氧胆酸通过7-OH的区域选择性氧化及随后还原的方法制备熊去氧胆酸，但是反应中涉及到多酶的兼容性问题，剂辅酶再生，使得在第一步的7-OH氧化为羰基化对反应体系进行加热处理促使酶失活。反应如果一锅法进行，会包含反应中间体，由于反应中间体与底物产物的结构类似，导致如果反应产物的纯度不高，对后期获得产物纯品的收率会明显降低。

专利CN1097222442A公开了一种7β-羟基胆酸脱氢酶及其编码基因，并利用该酶作为生物催化剂催化底物7-酮石胆酸合成熊去氧胆酸。7β-羟基胆酸脱氢酶在催化7-酮石胆酸转化为熊去氧胆酸时，反应条件温和，反应时间短，催化专一，环境友好。

在经过发酵后，若能将此酶固定化，可对此酶重复利用。但在现有文献中未见其对7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化的研究。因此，寻找一种效果优良的7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法。

本发明提供了一种7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法，它包括如下步骤：

(1)对7β-羟基胆酸脱氢酶发酵，得发酵液；

(2)取步骤(1)所得发酵液，离心，得下沉物；

(3)取步骤(2)所得下沉物，加水均质，得均质液；

(4)将步骤(3)所得的均质液离心，得7β-羟基胆酸脱氢酶液酶；

(5)将7β-羟基胆酸脱氢酶液酶加入载体中，进行固定化，得固化酶；

(6)将得到的固化酶纯化，即得7β-羟基胆酸脱氢固化酶。

进一步地，步骤(1)中，所述7β-羟基胆酸脱氢酶发酵的方法为将7β-羟基胆酸脱氢酶基因构建到载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒，将重组质粒转入宿主菌细胞，获得菌株，将菌株接种至培养基中培养，即得发酵液；所述7β-羟基胆酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列如下：

MKLKEKYGEWGIILGATEGVGKAFCEKIASEGMNVVMVGRREEMLKALGEDISSKYGVKHLVIKADFSDPNSTDEIFEKTKDLDMGFMSYVACFHTFGKLEDTPWEKHEQMLNVNVITFLKCFYHYMKIFSKQDRGAIINVSSLTGISASPYNAQYGAGKSYILKLTEAVAYEASKTNVDVEVITLGTTITPSLLKNLPGGPAGGAVMKAALTPEACVGGAFGNLGKKFSIIAGEHNKASIHDWKANHTEDEFISYMGSFYER。

进一步地，步骤(1)中，所述载体为pET21a表达载体；和/或，所述宿主菌为大肠杆菌；和/或，所述培养为30～40℃培养10～20小时；

优选地，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步地，步骤(2)中，所述离心条件为25～30℃下1000～6000r/min，离心10～30min。

进一步地，步骤(3)中，所述下沉物与水的质量体积比为10～100：1(g/L)；

和/或，步骤(3)中，所述均质为高压均质，压力为70～100MPa；均质次数为2～5次。

进一步地，步骤(4)中，所述离心的条件为25～30℃下1000～6000r/min，离心10～30min。

进一步地，

步骤(5)中，所述载体为共价键结合的氨基聚合物类型载体；

和/或，步骤(5)中，所述载体与7β-羟基胆酸脱氢酶液酶的质量体积比为1:5(g/mL)；

和/或，步骤(5)中，所述固定化前加入磷酸盐；

和/或，步骤(5)中，所述固定化温度为20～30℃，pH为8.0-8.5；

和/或，步骤(5)中，所述固定化时间为40～50h；

优选地，

步骤(5)中，所述磷酸盐为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或磷酸钾。

进一步地，步骤(5)中，所述载体为EVC型载体或HDZ-23-2型载体。

更进一步地，步骤(5)中，所述载体为西安蓝晓科技有限公司EVC型载体或上海华震科技有限公司HDZ-23-2型载体。

更进一步地，步骤(5)中，所述载体为西安蓝晓科技有限公司EVC型载体。

进一步地，步骤(5)中，所述载体为活化后的载体；所述载体用戊二醛活化；

优选地，

步骤(5)中，所述戊二醛为2％戊二醛；和/或，所述活化温度为23-30℃，活化时间为1～5h；活化pH为8.0-8.5。

进一步地，

步骤(6)中，所述纯化为用水清洗后，并将含生物酶杀菌剂的缓冲液打入固化酶中，压干水分，即可；

优选地，

步骤(6)中，所述生物酶杀菌剂为硫酸钠；和/或，所述生物酶杀菌剂的浓度为12‰；和/或，所述缓冲液为pH7.50磷酸钾溶液。

本发明还提供了一种7β-羟基胆酸脱氢固化酶，它是由前述的固定化方法制备得到的7β-羟基胆酸脱氢固化酶。

本发明7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法操作简单，无需使用石油醚、乙醇、丙酮等有机溶剂溶媒。采用本发明固定化方法制备得到的7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力高且稳定，催化性能良好，转化专一，转化熊去氧胆酸的转化率可达到95％；并且使用操作方便，可回收利用，降低生产成本，工业应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

具体实施方式

本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。

实施例1、本发明7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法

(1)7β-羟基胆酸脱氢酶发酵液的制备

按照专利CN1097222442A所述方法构建7β-羟基胆酸脱氢酶基因，该基因编码的氨基酸序列如下：

MKLKEKYGEWGIILGATEGVGKAFCEKIASEGMNVVMVGRREEMLKALGEDISSKYGVKHLVIKADFSDPNSTDEIFEKTKDLDMGFMSYVACFHTFGKLEDTPWEKHEQMLNVNVITFLKCFYHYMKIFSKQDRGAIINVSSLTGISASPYNAQYGAGKSYILKLTEAVAYEASKTNVDVEVITLGTTITPSLLKNLPGGPAGGAVMKAALTPEACVGGAFGNLGKKFSIIAGEHNKASIHDWKANHTEDEFISYMGSFYER(SEQ ID NO.1)。

将7β-羟基胆酸脱氢酶基因构建到pET21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。将重组质粒转入宿主菌细胞(大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。将工程菌株接种至工业培养基中，32℃培养19.5小时得发酵液。

7β-羟基胆酸脱氢酶酶活力是发酵液7β-羟基胆酸脱氢底物溶液反应过程中，发酵液中酶的催化作用下，NAD(氧化型辅酶Ⅰ)逐渐转化为NADH(还原型辅酶Ⅰ)的活性。在紫外光波长340nm时，NAD因为得到(-H)基团而使吸光度增大，用酶标仪检测NADH的生产量来判定酶活的高低。取培养19.5小时的发酵液，通过酶标仪检测7β-羟基胆酸脱氢酶酶活力为90u/ml，紫外分光光度计检测OD值为19，pH：7.20。

(2)发酵液离心

取发酵液1L，在落地离心机中，室温，6000r/min，离心10min，得下沉物，上清使用酶标仪检测酶活力：1.5u/ml。

(3)均质

将收集的下沉物称重30g，加入1L生活饮用水，将下沉物稀释成混悬液。将此混悬液于高压均质机中70MPa～80MPa，均质2遍，得均质液，使用紫外分光光度计测均质液OD值为3.2。

(4)液酶

将均质液室温，6000r/min，离心10min，取上清液(液酶)1200ml，检测7β-羟基胆酸脱氢酶酶活力为70u/ml。

(5)固定化

①分别选择西安蓝晓科技有限公司EVC型载体和上海华震科技有限公司HDZ-23-2型载体。按照载体重量：液酶体积比1:5(g/mL)进行称取。称取载体60g，用纯化水清洗载体3遍，每次搅拌15min。载体清洗好后浸泡在2％戊二醛中在23-30℃条件下活化，活化初期用12％KOH水溶液调节pH至8.0-8.5，在pH稳定15min开始计时活化1h。

②活化完毕，取液酶300ml加入活化后的载体中，缓慢搅拌，升温至20～30℃，用12％KOH水溶液调节pH至8.0-8.5，计时1h后投入固体磷酸钾40g，固定化40h，静置30min，得下沉物(固化酶)。取其上清用酶标仪检测酶活力。

③用10倍体积纯化水清洗固化酶两遍，废水通过溢流口排掉，清洗至废水浊度2.0以下，压干水分。然后将0.1mol pH7.50磷酸钾水溶液，12‰的生物酶杀菌剂(硫酸钠)加入7β-羟基胆酸脱氢固化酶，搅拌30min，压干水分，得7β-羟基胆酸脱氢固化酶。

(6)结果

步骤②上清酶活力和终产物7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力的检测结果见表1。

表1.检测结果

由表1所示结果可知：采用上述方法可以得到7β-羟基胆酸脱氢固化酶。从7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力以及上清酶活力可看出利用西安蓝晓科技有限公司EVC型载体制备得到的固化酶效果更好，酶活力更高，达到65.35u/g。

(7)转化

分别取上述利用西安蓝晓科技有限公司EVC型载体和上海华震科技有限公司HDZ-23-2型载体制备的固化酶，进行酶法转化熊去氧胆酸反应。取制备的固化酶50g，加入1L生活饮用水以及1mol磷酸氢二钾和1mol磷酸二氢钾，加入固体葡萄糖6g，使用30％NaOH水溶液调节pH至6.50，在2-3h内加入25g/L的7-酮石胆酸溶液，反应使用30％NaOH水溶液pH控制在7.5-8.0之间，2-3h底物反应结束后，取上清液使用高效液相色谱仪检测熊去氧胆酸转化率。抽滤，将滤液用20％硫酸水溶液调pH值至4.0-5.0，析出固体为熊去氧胆酸粗品。抽滤后的固体为使用后7β-羟基胆酸脱氢酶固化酶，将其用纯水洗5-10遍，以此重复使用。

(8)结果

利用各固化酶制备熊去氧胆酸的转化率，以及7β-羟基胆酸脱氢酶固化酶酶活力的检测结果见表2。

表2.检测结果

由表2可知：本发明制备的7β-羟基胆酸脱氢固化酶能够有效将7-酮石胆酸转化成熊去氧胆酸，转化率高达80％以上。而利用西安蓝晓科技有限公司EVC型载体制备得到的固化酶效果更优，转化率高达95％。

实施例2、本发明7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法

(1)7β-羟基胆酸脱氢酶发酵液的制备

采用实施例1所述方法制备工程菌株，将工程菌株接种至工业培养基中，32℃培养18小时，得发酵液。

7β-羟基胆酸脱氢酶酶活力是发酵液7β-羟基胆酸脱氢底物溶液反应过程中，发酵液中酶的催化作用下，NAD(氧化型辅酶Ⅰ)逐渐转化为NADH(还原型辅酶Ⅰ)的活性。在紫外光波长340nm时，NAD因为得到(-H)基团而使吸光度增大，用酶标仪检测NADH的生产量来判定酶活的高低。取培养18小时的发酵液，通过酶标仪检测7β-羟基胆酸脱氢酶酶活力为100u/ml，紫外分光光度计检测OD值为20，pH：7.23。

(2)发酵液离心

取发酵液1L，在落地离心机中，室温，6000rpm/min，离心10min，得下沉物，上清使用酶标仪检测酶活力：1.05u/ml。

(3)均质

将收集的下沉物称重的33g，加入1L生活饮用水，将下沉物稀释成混悬液。将此混悬液于高压均质机中70MPa～80MPa，均质2遍，得均质液，使用紫外分光光度计测均质液OD值为3.6。

(4)液酶

将均质液室温，6000r/min，离心10min，取上清液，得液酶1180ml，检测7β-羟基胆酸脱氢酶酶活力为83u/ml。

(5)固定化

①选择西安蓝晓科技有限公司EVC型载体，按照载体重量：液酶体积比1:5(g/mL)进行称取。称取载体60g，用纯化水清洗载体3遍，每次搅拌15min。载体清洗好后浸泡在2％戊二醛中在23-30℃条件下活化，活化初期用12％KOH水溶液调节pH至8.0-8.5，在pH稳定15min开始计时活化1h。

②活化完毕，取液酶300ml加入活化后的载体中，缓慢搅拌，升温至20～30℃，用12％KOH水溶液调节pH至8.0-8.5，计时1h后投入40g固体磷酸钾，固定化40h，静置30min，得下沉物(固化酶)。取其上清用酶标仪检测酶活力。

③用10倍体积纯化水清洗固化酶两遍，废水通过溢流口排掉，清洗至废水浊度2.0以下，压干水分。然后将0.1mol pH7.50磷酸钾水溶液，12‰的生物酶杀菌剂(硫酸钠)加入7β-羟基胆酸脱氢固化酶，搅拌30min，压干水分，得7β-羟基胆酸脱氢固化酶。

(6)结果

步骤②上清酶活力和终产物7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力的检测结果见表3。

表3.检测结果

实施例2重复西安蓝晓科技有限公司EVC型载体固定化工艺，从数据可看出采用本发明方法制备得到的7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力稳定。

(7)转化

取上述利用西安蓝晓科技有限公司EVC型载体制备的固化酶进行酶法转化熊去氧胆酸反应。取制备的固化酶50g，加入1L生活饮用水以及1mol磷酸氢二钾和1mol磷酸二氢钾，加入固体葡萄糖6g，使用30％NaOH水溶液调节pH至6.50，在2-3h内加入25g/L的7-酮石胆酸溶液，反应使用30％NaOH水溶液pH控制在7.5-8.0之间，2-3h底物反应结束后，取上清液使用高效液相色谱仪检测熊去氧胆酸转化率。抽滤，将滤液用20％硫酸水溶液调pH值至4.0-5.0，析出固体为熊去氧胆酸粗品。抽滤后的固体为使用后7β-羟基胆酸脱氢酶固化酶，将其用纯水洗5-10遍，以此重复使用。

(8)结果

利用上述固化酶制备熊去氧胆酸的转化率，以及7β-羟基胆酸脱氢酶固化酶酶活力的检测结果见表4。

表4.检测结果

与实施例1一样，本发明制备的7β-羟基胆酸脱氢固化酶能够有效将7-酮石胆酸转化成熊去氧胆酸，利用西安蓝晓科技有限公司EVC型载体制备的7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力高，转化熊去氧胆酸的转化率可达到99％以上。

(9)对利用西安蓝晓科技有限公司EVC型载体制备的7β-羟基胆酸脱氢固化酶重复转化使用。共计转化48批，平均转化率为：95％。

本发明针对7β-羟基胆酸脱氢酶固定化，选择西安蓝晓科技有限公司EVC型载体固定化酶酶活力可以达到60u/ml～70u/ml之间。

由上述实施例可知：本发明制备得到的7β-羟基胆酸脱氢固化酶稳定，酶活力高，在催化7-酮石胆酸时，转化专一，转化率高、操作方便，可回收利用，降低生产成本，工业应用前景良好。

对比例1、其他7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法

采用实施例2所述的固定化方法制备7β-羟基胆酸脱氢固化酶，仅改变“步骤(5)固定化”中②的pH和温度。pH和温度的选择如表5所示。制备后检查固化酶的酶活力，结果如表5所示。

表5.pH和温度的选择

由表5可知：通过改变固定化过程中pH值以及温度可显著影响7β-羟基胆酸脱氢固化酶活力。而20-30℃和pH值8.0-8.5条件下酶活最佳。其他pH值和温度下得到的7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力差。

综上，本发明7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法操作简单，无需使用石油醚、乙醇、丙酮等有机溶剂溶媒。采用本发明固定化方法制备得到的7β-羟基胆酸脱氢固化酶酶活力高且稳定，催化性能良好，转化专一，转化熊去氧胆酸的转化率可达到95％；并且使用操作方便，可回收利用，降低生产成本，工业应用前景良好。

SEQUENCE LISTING

<110> 伊犁川宁生物技术股份有限公司

<120> 一种7β-羟基胆酸脱氢酶的固定化方法

<130> GY218-2021P0112909CCR3

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 263

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala

1 5 10 15

Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Lys Ile Ala Ser Glu Gly

20 25 30

Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Met Leu Lys Ala Leu

35 40 45

Gly Glu Asp Ile Ser Ser Lys Tyr Gly Val Lys His Leu Val Ile Lys

50 55 60

Ala Asp Phe Ser Asp Pro Asn Ser Thr Asp Glu Ile Phe Glu Lys Thr

65 70 75 80

Lys Asp Leu Asp Met Gly Phe Met Ser Tyr Val Ala Cys Phe His Thr

85 90 95

Phe Gly Lys Leu Glu Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Gln Met Leu

100 105 110

Asn Val Asn Val Ile Thr Phe Leu Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Lys

115 120 125

Ile Phe Ser Lys Gln Asp Arg Gly Ala Ile Ile Asn Val Ser Ser Leu

130 135 140

Thr Gly Ile Ser Ala Ser Pro Tyr Asn Ala Gln Tyr Gly Ala Gly Lys

145 150 155 160

Ser Tyr Ile Leu Lys Leu Thr Glu Ala Val Ala Tyr Glu Ala Ser Lys

165 170 175

Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Ile Thr Pro

180 185 190

Ser Leu Leu Lys Asn Leu Pro Gly Gly Pro Ala Gly Gly Ala Val Met

195 200 205

Lys Ala Ala Leu Thr Pro Glu Ala Cys Val Gly Gly Ala Phe Gly Asn

210 215 220

Leu Gly Lys Lys Phe Ser Ile Ile Ala Gly Glu His Asn Lys Ala Ser

225 230 235 240

Ile His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Phe Ile Ser Tyr

245 250 255

Met Gly Ser Phe Tyr Glu Arg

260