一种重组微生物及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组微生物及其应用。

背景技术

L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。

随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3:149)等利用系统代谢工程策略，通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制，通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸，通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等，最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸82.4g/L，糖酸转化率39.3％。2020年梅花集团申请的中国专利201611250306.8中，通过强化pntAB基因和异源引入pyc基因获得MHZ-0215-2菌株，该菌株苏氨酸产量为12.4g/L、转化率约为16.2％且无质粒负担。

苏氨酸可在胞内降解生成甘氨酸和异亮氨酸，因此本领域的技术人员可以通过强化苏氨酸到异亮氨酸合成路径上的基因，以增强异亮氨酸的合成。因此，有利于苏氨酸产量提高的方法，有利于其下游产物异亮氨酸的生产。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组微生物及其应用。

第一方面，本发明提供一种trmH基因突变体在调控菌株生产氨基酸能力中的应用；所述trmH基因突变体为trmH基因的氨基酸序列第84位的丙氨酸突变为缬氨酸得到。

进一步地，所述trmH基因的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.3所示的序列。

进一步地，所述trmH基因突变体由SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ IDNO.5有至少60％的序列同一性的核苷酸序列编码得到。

相应地，trmH基因突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步地，所述菌株为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或沙雷氏菌；所述氨基酸为苏氨酸；所述调控菌株生产氨基酸能力为提高菌株生产苏氨酸的能力。

第二方面，本发明提供一种重组微生物，所述重组微生物包括所述应用中述及的trmH基因突变体。

进一步地，所述重组微生物中dbpA基因的表达受到抑制；优选地，所述dbpA基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列(其编码得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。

进一步地，所述重组微生物的出发菌株为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或沙雷氏菌。

更进一步，所述重组微生物为大肠杆菌，优选地，所述重组微生物的出发菌株为MHZ-0215-2，保藏编号为CGMCC No.13403。该菌株可市售购得。

本发明对W3110进行紫外诱变获得一株高产苏氨酸的诱变菌，并对其进行全基因组测序发现其trmH和dbpA基因存在突变，为了进一步验证该突变是否有利于苏氨酸的生产，将突变分别引入苏氨酸生产菌MHZ-0215-2中，发现其苏氨酸的产量有所提高，当两者叠加时其性能进一步提高，因此确定该位点的突变有利于苏氨酸常量的提高；并且当发酵过程中温度波动较大时菌株仍能维持较好的性能，菌株的稳定性有所提高。

本发明进一步提供包括所述重组微生物的微生物制剂。

本发明进一步提供所述重组微生物或所述微生物制剂在生产氨基酸中的应用，优选为在生产苏氨酸中的应用。

第三方面，本发明提供一种提高菌株生产氨基酸能力的方法，包括：

将所述菌株中trmH基因的氨基酸序列第84位的丙氨酸突变为缬氨酸，和/或抑制所述菌株中dbpA基因的表达。

进一步地，所述dbpA基因含有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，降低所述菌株中的dbpA基因的表达水平为：

使所述菌株中的dbpA基因失活。

进一步地，所所述菌株为大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或沙雷氏菌。本发明具备如下有益效果：

本发明提供一种trmH基因突变体，在菌株中trmH基因发生了相应的突变时，其生产氨基酸的能力显著提高。并且在同时敲除微生物中dbpA基因后得到一种重组微生物，该重组微生物生产L-苏氨酸的能力显著提高，且具备较高的温度稳定性，对于温度波动的适应性更强，在温度波动较大时仍具备较高的产酸能力。

由此说明，可以通过对trmH和dpbA等两个基因进行改造以提升菌株的产酸能力和温度适应性，这对于强化菌株产苏氨酸的能力有重要意义。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明分别以MHZ-0215-2(菌株保藏号为CGMCC No.13403，公开于中国专利201611250306.8中)为出发菌株，在其基因组上进行相关改造。主要方式为trmH点突变和/或dbpA缺失。

大肠杆菌的基因组编辑，主要借鉴了Jiang Y等报道的CRISPR-Cas9基因编辑技术(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.Environ Microbiol,2015)。

以下实施例中，所述卡那霉素(Kanamycin)在培养基中的终浓度为50μg/mL，所述壮观霉素(spectinomycin)在培养基中的终浓度为50μg/ml。

以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本发明提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为MHZ-0215-2，属于W3110(埃希氏菌属(Escherichia))。

实施例中所使用引物序列见下表：

表1实施例中使用引物序列

实施例1：制备trmH 251位核苷酸有胞嘧啶替换为胸腺嘧啶的菌株MHZ-0221-15

1、pTargetF-N20(trmH C251T)质粒及Donor DNA构建

Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA-trmH-F/pTF-sgRNA-trmH-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(trmH C251T)，并进行PCR鉴定及测序验证；

Step2：以W3110基因组为模板，选用trmH-UF/trmH-UR引物对，扩增出上游同源臂①；

Step3：以W3110基因组为模板，选用trmH-DF/trmH-DR引物对扩增出下游同源臂②；

Step4：以①、②为模板，选用trmH-UF/trmH-DR引物对，扩增出trmH C251T全长片段，也称Donor DNA(trmH本身的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码得到的蛋白序列如SEQ ID NO.3，trmH C251T的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码得到的蛋白如SEQIDNO.6所示)。

2、感受态细胞制备及电转化

Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；

Step2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至OD

Step3：将pTargetF-N20(trmH C251T)质粒和步骤1中构建得到的Donor DNA同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

3、重组验证

Step1：使用引物对trmH-F/trmH-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

Step2：用引物对trmH-F/trmH-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

4、构建相关质粒丢失

Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(trmH C251T)质粒已丢失；

Step3：挑取pTargetF-N20(trmH C251T)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-6(trmHC521T)菌株。

实施例2：制备dbpA失活的菌株MHZ-0221-16

1、pTargetF-N20(dpbA失活)质粒及Donor DNA构建

Step1：以pTargetF质粒为模板(来源于文献Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,etal.Appl.Environ Microbiol,2015)，选用pTF-sgRNA-dbpA-F/pTF-sgRNA-dbpA-R引物对，扩增出带有N20的pTF线性质粒，使用无缝组装ClonExpress试剂盒将此线性质粒37℃进行组装，随后转化Trans1-T1感受态细胞，获得pTargetF-N20(dbpA)，并进行PCR鉴定及测序验证；

Step2：以W3110基因组为模板，选用dbpA-UF/dbpA-UR引物对，扩增出上游同源臂①；

Step3：以W3110基因组为模板，选用dbpA-DF/dbpA-DR引物对扩增出下游同源臂②；

Step4：以①、②为模板，选用dbpA-UF/dbpA-DR引物对，扩增出dbpA失活的全长片段，也称Donor DNA。

2、感受态细胞制备及电转化

Step1：将pCas质粒(来源于文献Multigene Editing in the Escherichia coliGenome via the CRISPR-Cas9 System,Jiang Y,Chen B,et al.Appl.EnvironMicrobiol,2015)电转入MHZ-0215-2感受态细胞中(转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆III》)；

Step2：挑取MHZ-0215-2(pCas)单菌落于5mL含卡那霉素和终浓度为10mM阿拉伯糖的LB试管中，30℃200r/min培养至

Step3：将pTargetF-N20(dbpA)质粒和步骤1中构建得到的Donor DNA同时电转入MHZ-0215-2(pCas)感受态细胞中(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃静置培养至单菌落可见。

3、重组验证

Step1：使用引物对dbpA-F/dbpA-R对上述单菌落进行菌落PCR验证；

Step2：用引物对dbpA-F/dbpA-R进行目的片段的扩增，扩增产物送测序，以验证序列的完整性。

4、构建相关质粒丢失

Step1：挑取测序验证正确的单菌落接种于5mL含卡那霉素及终浓度为0.5mM IPTG的LB试管中，30℃过夜培养后划线于含卡那霉素的LB平板上；

Step2：挑取单菌落对点于含卡那霉素、壮观霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃过夜培养，若在含卡那霉素、壮观霉素的LB平板上不能生长，在卡那霉素的LB平板上生长，表明pTargetF-N20(dbpA)质粒已丢失；

Step3：挑取pTargetF-N20(dbpA)质粒丢失的阳性菌落，接种于无抗LB试管中，42℃培养8h后划线于LB平板上，37℃过夜培养；

Step4：挑取单菌落对点于含卡那霉素LB平板和无抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生长，在无抗LB平板上生长，表明pCas质粒丢失，得到MHZ-0221-16(dbpA失活)菌株。

实施例3：构建trmH、dbpA双突变菌株MHZ-0221-17

在实施例1制备得到的MHZ-0221-16的基础上，按照实施例2的操作步骤对MHZ-0221-16进行改造，获得的改造菌即为trmH、dbpA双突变菌MHZ-0221-17。

实施例1-3中所获得的产苏氨酸基因改造菌株如表2所示：

表2本发明构建的基因工程菌

实施例4：产L-苏氨酸基因工程菌摇瓶发酵验证

Step 1:从冻存管中取MHZ-0215-2、MHZ-0221-15、MHZ-0221-16、MHZ0221-9共4株菌，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；

Step 2:将菌体从平板上刮下一环，接种到装有50mL种子培养基(见表3)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD

Step 3:将2mL种子液转接到含20mL发酵培养基(见表4)的摇瓶中，往复摇床37℃，100rpm发酵培养直至残糖耗尽，发酵结束后测定样品OD

表3种子培养基(g/L)

表4发酵培养基(g/L)

表5产苏氨酸基因工程菌生产力比较

由表5可知，在温度低于或高于发酵最适温度37℃时，对照菌MHZ-0215-2的性能出现明显下降，由正常水平的14.10g/L下降到10g/L左右，下降约29％；糖酸转化率由16.60％下降到12％左右，下降约27.71％。MHZ-0221-15、MHZ-0221-16、MHZ-0221-17这三株菌在37℃时，其苏氨酸的产量及转化率较MHZ-0215-2有所提高，且在35℃和39℃时产酸和转化率与37℃时相比没有明显下降，均在其37摄氏度时性能±1g/L的水平。这充分说明trmH和dpbA两个位点的改造提高了菌株生产苏氨酸的能力，并且进一步提高了菌株的稳定性。

实施例5：产L-苏氨酸基因工程菌在温度波动较大的5L罐中验证其稳定性。

Step 1:从冻存管中取MHZ-0215-2、MHZ-0221-15、MHZ-0221-16、MHZ0221-9共4株菌，在LB平板上划线活化，37℃培养18-24h；

Step 2:将菌体从平板上刮下一环，接种到装有30mL种子培养基(见表6)的摇瓶中，37℃，转速90rpm，培养约5小时，使OD

Step 3:将30mL种子液转接到含3L发酵培养基(见表7)的5L罐中，温度37±2℃，溶氧30％，pH 7，测定样品OD

表6种子培养基(g/L)

表7发酵培养基(g/L)

表8产苏氨酸基因工程菌生产力比较

由表8可知，在发酵温度人为控制在37±2℃这个波动的情况下，MHZ-0221-15、MHZ-0221-16、MHZ-0221-17仍然能保持较优的性能，且产酸能力明显高于对照MHZ-0215-5，这充分说明trmH和dpbA两个位点的改造提高了菌株的稳定性，使其在温度波动较大的情况下，仍具备较好的产酸能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 梅花（上海）生物科技有限公司

<120> 一种重组微生物及其应用

<130> KHP211117777.4

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaacccaa cacgttatgc acgcatctgc gaaatgctcg ccaggcggca gcctgatctg 60

accgtctgca tggagcaggt ccacaaacct cataacgttt ctgcgattat tcgtaccgca 120

gatgccgttg gcgtacatga agttcacgcc gtctggcctg gtagccgcat gcgcaccatg 180

gcttcggcag cggcgggtag taacagctgg gtacaggtga aaacacaccg caccattggc 240

gatgccgtcg ctcatctcaa aggccagggc atgcagattc tggcaaccca tctttctgat 300

aacgctgtcg atttccgcga aattgattac actcgcccga cctgcatttt gatgggacag 360

gagaaaacgg gcatcacgca ggaagcattg gccctggcgg atcaggacat catcattccg 420

atgatcggca tggtgcagtc gctgaatgtt tccgttgcct cagccctcat tctttacgaa 480

gcccagcgtc agcggcaaaa tgcaggcatg tacctgcgtg aaaacagcat gttgccggaa 540

gcagagcaac aacgcctgtt gtttgaaggc ggctatccgg tgctggcgaa agtcgcaaaa 600

cgcaaaggcc tgccttatcc ccacgtcaat cagcaaggcg agatcgaagc tgatgccgac 660

tggtgggcta ctatgcaggc tgcagggtaa 690

<210> 2

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgaccgctt tttctaccct gaatgttttg cctcccgccc aactcacgaa ccttaatgag 60

ttgggttatt taaccatgac gccggtgcag gccgccgcgc ttccggcgat ccttgccgga 120

aaagatgttc gcgtgcaggc gaaaaccggc agcggcaaaa cggcggcttt tggcctcggc 180

ttgttacagc aaattgatgc gtcgctattt caaacccagg ctttagtgct gtgtcctacg 240

cgtgaactgg cggatcaggt ggcaggtgaa ttgcgtcggc tggcgcgttt tctgccaaat 300

accaaaattt tgacgttgtg cggtggtcaa ccgttcggta tgcagcgtga ttcgttgcaa 360

catgcgccgc atattatcgt ggcaacgccg gggcgtttgc tggatcacct gcaaaaaggc 420

acggtatcac tggatgcgtt gaatacgctg gtgatggatg aggccgaccg catgctggat 480

atgggattta gcgatgccat tgatgatgtc atccgttttg cgcctgcatc tcgacagacg 540

cttctgtttt cggcaacctg gccggaagcc atcgctgcaa tcagcggacg agtgcaacgc 600

gatcctttgg cgattgaaat tgactcaaca gatgctttgc cacccattga acaacaattt 660

tatgagacat ccagcaaagg caaaattcct ctgttgcaac ggttattaag cttgcatcag 720

ccatcctctt gcgtggtgtt ttgcaatacc aaaaaagatt gccaggctgt ctgcgacgcg 780

ctgaatgaag tagggcaaag tgcattgtca ttacacggcg atttggagca acgcgatcgc 840

gatcagaccc tggtacgttt tgctaacggt agcgcccgtg tactggtcgc gactgatgtt 900

gctgcgcgtg gtctggatat taaatcgctt gagctggtgg tgaactttga gctggcgtgg 960

gaccctgaag ttcatgtaca tcgcatcggt cgtacagctc gtgcaggaaa tagcggtctg 1020

gcgatcagtt tctgtgctcc ggaagaagca cagcgggcca atatcatttc tgacatgttg 1080

cagataaaac ttaactggca aacgccgcca gctaatagtt ccattgcgac gctggaagca 1140

gaaatggcaa cgttgtgtat cgatggcggg aaaaaagcca aaatgcgccc gggtgatgta 1200

ttaggtgcac tgacaggaga tatcgggctt gatggcgcag atattggcaa aatcgccgtg 1260

catccggcgc atgtctatgt cgcggtccgt caggctgttg ctcataaagc atggaaacag 1320

ttacagggcg ggaagattaa aggaaaaacg tgccgggtgc ggttattaaa ataa 1374

<210> 3

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asn Pro Thr Arg Tyr Ala Arg Ile Cys Glu Met Leu Ala Arg Arg

1 5 10 15

Gln Pro Asp Leu Thr Val Cys Met Glu Gln Val His Lys Pro His Asn

20 25 30

Val Ser Ala Ile Ile Arg Thr Ala Asp Ala Val Gly Val His Glu Val

35 40 45

His Ala Val Trp Pro Gly Ser Arg Met Arg Thr Met Ala Ser Ala Ala

50 55 60

Ala Gly Ser Asn Ser Trp Val Gln Val Lys Thr His Arg Thr Ile Gly

65 70 75 80

Asp Ala Val Ala His Leu Lys Gly Gln Gly Met Gln Ile Leu Ala Thr

85 90 95

His Leu Ser Asp Asn Ala Val Asp Phe Arg Glu Ile Asp Tyr Thr Arg

100 105 110

Pro Thr Cys Ile Leu Met Gly Gln Glu Lys Thr Gly Ile Thr Gln Glu

115 120 125

Ala Leu Ala Leu Ala Asp Gln Asp Ile Ile Ile Pro Met Ile Gly Met

130 135 140

Val Gln Ser Leu Asn Val Ser Val Ala Ser Ala Leu Ile Leu Tyr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Arg Gln Arg Gln Asn Ala Gly Met Tyr Leu Arg Glu Asn Ser

165 170 175

Met Leu Pro Glu Ala Glu Gln Gln Arg Leu Leu Phe Glu Gly Gly Tyr

180 185 190

Pro Val Leu Ala Lys Val Ala Lys Arg Lys Gly Leu Pro Tyr Pro His

195 200 205

Val Asn Gln Gln Gly Glu Ile Glu Ala Asp Ala Asp Trp Trp Ala Thr

210 215 220

Met Gln Ala Ala Gly

225

<210> 4

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Thr Ala Phe Ser Thr Leu Asn Val Leu Pro Pro Ala Gln Leu Thr

1 5 10 15

Asn Leu Asn Glu Leu Gly Tyr Leu Thr Met Thr Pro Val Gln Ala Ala

20 25 30

Ala Leu Pro Ala Ile Leu Ala Gly Lys Asp Val Arg Val Gln Ala Lys

35 40 45

Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala Ala Phe Gly Leu Gly Leu Leu Gln Gln

50 55 60

Ile Asp Ala Ser Leu Phe Gln Thr Gln Ala Leu Val Leu Cys Pro Thr

65 70 75 80

Arg Glu Leu Ala Asp Gln Val Ala Gly Glu Leu Arg Arg Leu Ala Arg

85 90 95

Phe Leu Pro Asn Thr Lys Ile Leu Thr Leu Cys Gly Gly Gln Pro Phe

100 105 110

Gly Met Gln Arg Asp Ser Leu Gln His Ala Pro His Ile Ile Val Ala

115 120 125

Thr Pro Gly Arg Leu Leu Asp His Leu Gln Lys Gly Thr Val Ser Leu

130 135 140

Asp Ala Leu Asn Thr Leu Val Met Asp Glu Ala Asp Arg Met Leu Asp

145 150 155 160

Met Gly Phe Ser Asp Ala Ile Asp Asp Val Ile Arg Phe Ala Pro Ala

165 170 175

Ser Arg Gln Thr Leu Leu Phe Ser Ala Thr Trp Pro Glu Ala Ile Ala

180 185 190

Ala Ile Ser Gly Arg Val Gln Arg Asp Pro Leu Ala Ile Glu Ile Asp

195 200 205

Ser Thr Asp Ala Leu Pro Pro Ile Glu Gln Gln Phe Tyr Glu Thr Ser

210 215 220

Ser Lys Gly Lys Ile Pro Leu Leu Gln Arg Leu Leu Ser Leu His Gln

225 230 235 240

Pro Ser Ser Cys Val Val Phe Cys Asn Thr Lys Lys Asp Cys Gln Ala

245 250 255

Val Cys Asp Ala Leu Asn Glu Val Gly Gln Ser Ala Leu Ser Leu His

260 265 270

Gly Asp Leu Glu Gln Arg Asp Arg Asp Gln Thr Leu Val Arg Phe Ala

275 280 285

Asn Gly Ser Ala Arg Val Leu Val Ala Thr Asp Val Ala Ala Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Ile Lys Ser Leu Glu Leu Val Val Asn Phe Glu Leu Ala Trp

305 310 315 320

Asp Pro Glu Val His Val His Arg Ile Gly Arg Thr Ala Arg Ala Gly

325 330 335

Asn Ser Gly Leu Ala Ile Ser Phe Cys Ala Pro Glu Glu Ala Gln Arg

340 345 350

Ala Asn Ile Ile Ser Asp Met Leu Gln Ile Lys Leu Asn Trp Gln Thr

355 360 365

Pro Pro Ala Asn Ser Ser Ile Ala Thr Leu Glu Ala Glu Met Ala Thr

370 375 380

Leu Cys Ile Asp Gly Gly Lys Lys Ala Lys Met Arg Pro Gly Asp Val

385 390 395 400

Leu Gly Ala Leu Thr Gly Asp Ile Gly Leu Asp Gly Ala Asp Ile Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Val His Pro Ala His Val Tyr Val Ala Val Arg Gln Ala

420 425 430

Val Ala His Lys Ala Trp Lys Gln Leu Gln Gly Gly Lys Ile Lys Gly

435 440 445

Lys Thr Cys Arg Val Arg Leu Leu Lys

450 455

<210> 5

<211> 690

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgaacccaa cacgttatgc acgcatctgc gaaatgctcg ccaggcggca gcctgatctg 60

accgtctgca tggagcaggt ccacaaacct cataacgttt ctgcgattat tcgtaccgca 120

gatgccgttg gcgtacatga agttcacgcc gtctggcctg gtagccgcat gcgcaccatg 180

gcttcggcag cggcgggtag taacagctgg gtacaggtga aaacacaccg caccattggc 240

gatgccgtcg ttcatctcaa aggccagggc atgcagattc tggcaaccca tctttctgat 300

aacgctgtcg atttccgcga aattgattac actcgcccga cctgcatttt gatgggacag 360

gagaaaacgg gcatcacgca ggaagcattg gccctggcgg atcaggacat catcattccg 420

atgatcggca tggtgcagtc gctgaatgtt tccgttgcct cagccctcat tctttacgaa 480

gcccagcgtc agcggcaaaa tgcaggcatg tacctgcgtg aaaacagcat gttgccggaa 540

gcagagcaac aacgcctgtt gtttgaaggc ggctatccgg tgctggcgaa agtcgcaaaa 600

cgcaaaggcc tgccttatcc ccacgtcaat cagcaaggcg agatcgaagc tgatgccgac 660

tggtgggcta ctatgcaggc tgcagggtaa 690

<210> 6

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asn Pro Thr Arg Tyr Ala Arg Ile Cys Glu Met Leu Ala Arg Arg

1 5 10 15

Gln Pro Asp Leu Thr Val Cys Met Glu Gln Val His Lys Pro His Asn

20 25 30

Val Ser Ala Ile Ile Arg Thr Ala Asp Ala Val Gly Val His Glu Val

35 40 45

His Ala Val Trp Pro Gly Ser Arg Met Arg Thr Met Ala Ser Ala Ala

50 55 60

Ala Gly Ser Asn Ser Trp Val Gln Val Lys Thr His Arg Thr Ile Gly

65 70 75 80

Asp Ala Val Val His Leu Lys Gly Gln Gly Met Gln Ile Leu Ala Thr

85 90 95

His Leu Ser Asp Asn Ala Val Asp Phe Arg Glu Ile Asp Tyr Thr Arg

100 105 110

Pro Thr Cys Ile Leu Met Gly Gln Glu Lys Thr Gly Ile Thr Gln Glu

115 120 125

Ala Leu Ala Leu Ala Asp Gln Asp Ile Ile Ile Pro Met Ile Gly Met

130 135 140

Val Gln Ser Leu Asn Val Ser Val Ala Ser Ala Leu Ile Leu Tyr Glu

145 150 155 160

Ala Gln Arg Gln Arg Gln Asn Ala Gly Met Tyr Leu Arg Glu Asn Ser

165 170 175

Met Leu Pro Glu Ala Glu Gln Gln Arg Leu Leu Phe Glu Gly Gly Tyr

180 185 190

Pro Val Leu Ala Lys Val Ala Lys Arg Lys Gly Leu Pro Tyr Pro His

195 200 205

Val Asn Gln Gln Gly Glu Ile Glu Ala Asp Ala Asp Trp Trp Ala Thr

210 215 220

Met Gln Ala Ala Gly

225

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gtcctggcct ttgagatgag cgagttttag agctagaaat agcaa 45

<210> 10

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgctcatctc aaaggccagg actagtatta tacctaggac tgagct 46

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caccggcaac ccaaagccac 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccggcagtag ttctccgatg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagagacggc gcaggagttc 20

<210> 14

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

catgccctgg cctttgagat gaacgacggc atcgccaatg gtg 43

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caccattggc gatgccgtcg ttcatctcaa aggccagggc atg 43

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgccaacgcc cgttagggaa c 21

<210> 17

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

agtggatgag gccgaccgca tgcgttttag agctagaaat agcaa 45

<210> 18

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcatgcggtc ggcctcatcc actagtatta tacctaggac tgagct 46

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttggtgggat ccctggcggc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ttcttaaata tgttctacgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgcatcgtag taaatggttg 20

<210> 22

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cacccggcaa ttcaacattt caaatctatt ctcgtggtca tc 42

<210> 23

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatgaccacg agaatagatt tgaaatgttg aattgccggg tg 42

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcctactgcc gcgagaaaga 20