表皮角质细胞增殖促进剂,FLGmRNA、SPTmRNA及IVLmRNA表达促进剂

技术领域

本发明涉及一种表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA表达促进剂及外皮蛋白 (involucrin)mRNA表达促进剂。

背景技术

表皮具有缓和外部刺激、控制水分等体内成分的流失的作用，从作为最下层的基底层开始，由基底层、棘层、颗粒层、角质层的连续4层结构构成。存在于各个层的大部分的细胞为由基底层分化的角质细胞。在基底层分裂、增殖的角质细胞一边通过棘层、颗粒层一边进行分化而成为角化细胞，构成由具有牢固的交联键的角蛋白纤维构成的角质层，最终作为污垢从角质层上脱落。该角质层存在于皮肤的最外层，作为针对来自外界的刺激的物理屏障发挥作用。为了使皮肤具有该屏障功能，通常以4周的周期重复从在基底层产生角质细胞开始到其成为污垢并剥落为止的循环(角化)，进行表皮的新陈代谢。

然而，由于当皮肤受到紫外线、强烈的空气干燥、过度的皮肤清洗、吸烟等外在因素的影响时，或者随着年龄的增长，表皮细胞的活动和增殖能力会降低，表皮的更新速度(turnover speed)随之延迟，因此会引起表皮变薄或角质层增厚等分化不全。其结果，皮肤的保湿功能或弹性降低，发生角质的异常剥离，而且皮肤会老化并产生皱纹、暗沉、肌理消失、弹性降低等变化。

因此，认为只要能够促进角质细胞的增殖，皮肤的更新就会得以促进、肌肤的新陈代谢功能就会恢复，因而可改善细纹、暗沉、色素沉着等皮肤的老化。以往，作为具有表皮角质细胞增殖促进作用的物质，已知来自大枣的提取物(参照专利文献1)、来自土贝母的提取物(参照专利文献2)等。

丝聚蛋白为皮肤的构成成分，认为其参与皮肤的屏障功能，具有防止过敏原、毒素、感染性生物的侵入的功能。已知由丝聚蛋白的基因突变等导致的功能降低与包含特应性皮炎(湿疹、皮肤的炎症、皮肤的瘙痒等)、过敏、哮喘等在内的特应性疾病的发病风险有关，此外，在严重的情况下会导致寻常性鱼鳞病等皮肤病(参照非专利文献1)。

另一方面，源自透明角质颗粒的丝聚蛋白在角质层内分解而产生作为天然保湿因子(Natural Moisturizing Factors；NMF)的主要成分的氨基酸。已知该丝聚蛋白在存在于角质层正下方的颗粒层中的表皮角质细胞中，以丝聚蛋白原的形式表达。然后，立即进行磷酸化，并在透明角质颗粒中蓄积，经过脱磷酸、水解而分解为丝聚蛋白，并转移至角质层，提高角蛋白丝的凝集效率，参与角化细胞的内部构筑(参照非专利文献 2)。近年来，已知该丝聚蛋白对皮肤的水分保持非常重要且必不可少，并且因干燥等条件的不同会导致丝聚蛋白的合成力降低、角质层中的氨基酸量降低(参照非专利文献3)。

因此，认为通过在表皮角质细胞中促进丝聚蛋白(丝聚蛋白原)的表达，可预防·治疗或改善包含特应性皮炎(湿疹、皮肤的炎症、皮肤的瘙痒等)、过敏、哮喘等在内的特应性疾病。此外，期待通过促进丝聚蛋白的表达，并由此增加角质层内的氨基酸量，从而可在本质上改善角质层的水分环境。作为具有丝聚蛋白表达促进作用的物质，已知艾叶提取物(参照专利文献3)等。

神经酰胺在表皮细胞的角化过程中以丝氨酸与棕榈酰辅酶A为基础，通过以作为神经酰胺合成的限速酶而已知的丝氨酸棕榈酰转移酶 (SPT)为首的酶的作用而生成。神经酰胺作为覆盖皮肤最外层的角化细胞间脂质的主要成分而特异性存在，并在维持皮肤本来具有的、作为生物体与外界的屏障膜的功能方面发挥重要的作用。

角质层的结构类似于砖与砂浆，以用细胞间脂质维系堆积成约15层的角化细胞的形式形成牢固的屏障膜。角化细胞通过在细胞内含有以氨基酸为主要成分的天然保湿因子而保持水分，另一方面，角化细胞间脂质的特征在于，以约50％的神经酰胺为主要成分，并由胆固醇、脂肪酸等两亲性脂质构成，为疏水部分与亲水部分交替重复的层板结构、即所谓的片层结构。

由各种各样的内在·外在因素导致的皮肤的屏障功能的降低使经表皮失水率增加，引起皮肤的干裂、脱屑、瘙痒感等，沦为所谓的干性皮肤。此外，皮肤的屏障功能的降低使皮肤的炎症加重，陷入对来自外界的各种各样的刺激的防御功能降低的恶性循环。最近的研究中报告了由年龄增加导致的角质神经酰胺成分(所谓的细胞间脂质)的减少或组成变化，或者在作为屏障功能障碍而已知的特应性皮炎的患者中，角质神经酰胺成分(所谓的细胞间脂质)的减少或组成变化(参照非专利文献4)，神经酰胺对维持、改善皮肤的屏障功能而言较为重要这一点已经广为人知。作为改善皮肤的屏障功能的方法，已知从外部补充神经酰胺的方法(参照非专利文献5)或在皮肤内部提高神经酰胺产生能力的方法(参照非专利文献6)等。

角化细胞以角蛋白纤维为主要成分，由包裹角蛋白纤维的角化包膜 (cornifiedenvelope，CE)构成。随着表皮角质细胞的分化而产生的多个 CE前体蛋白利用转谷氨酰胺酶而交联，并进行不溶化而形成该CE。进一步，神经酰胺等通过共价键结合而形成疏水结构，由此对CE的一部分提供细胞间脂质的片层结构的基础，由此形成角质层屏障功能的基础。

作为该CE前体蛋白之一，已知有外皮蛋白，认为通过促进该外皮蛋白的产生，可改善角质层屏障功能，可预防、治疗或改善皮肤粗糙、干性皮肤等皮肤的老化症状、特应性皮炎、银屑病、鱼鳞癣、干皮病等干燥性皮肤病等。基于这种考虑，作为具有外皮蛋白产生促进作用的物质，以往已知铁力木的种子提取物等(参照专利文献4)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2006-316028号公报

专利文献2：日本特开2006-056854号公报

专利文献3：日本特开2012-219047号公报

专利文献4：日本特开2005-213187号公报

非专利文献

非专利文献1：“Nat Genet.”,2006年,Vol.38,No.4,p.441-446

非专利文献2：“フレグランスジャーナル臨時増刊”,2000年,Vol.17, p.14-19

非专利文献3：“Arch.Dermatol.Res.”,1996年,Vol.288,p.442-446 非专利文献4：J.Dermatol.,1993年,Vol.20,No.1,p.1-6

非专利文献5：“フレグランスジャーナル”,2004年,Vol.32,No.11, p.23-32

非专利文献6：Br.J.Dermatol.,2000年,Vol.143,Issue 3,p.524-531

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明发现了一种在表皮角质细胞增殖促进作用、丝聚蛋白mRNA 表达促进作用、SPT mRNA表达促进作用或外皮蛋白mRNA表达促进作用方面具有优异作用的物质，本发明的目的在于提供一种以所述物质为有效成分的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂。

解决技术问题的技术手段

为了解决上述技术问题，本发明的特征在于，在表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂的制备中使用2-酮戊二酸。

发明效果

根据本发明，能够制备作用效果优异的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方案进行说明。

[表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、丝氨酸棕榈酰转移酶mRNA表达促进剂、外皮蛋白mRNA表达促进剂]

本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂以2-酮戊二酸为有效成分。

本实施方案中使用的2-酮戊二酸为公知化合物。2-酮戊二酸也可以为盐。

由于本实施方案中使用的2-酮戊二酸已市售，因此可使用市售的2- 酮戊二酸。此外，可以利用公知的方法由含有2-酮戊二酸的植物提取物进行分离·提纯而制备，此外，也可以利用公知的方法进行合成而制备。另外，上述植物提取物中可包含以含有2-酮戊二酸的植物为提取原料而得到的提取液、该提取液的稀释液或浓缩液、将该提取液干燥而得到的干燥物、或者它们的粗提纯物或提纯物中的任意一种。

作为含有2-酮戊二酸的植物，没有特别限定，例如可列举出大米。

可对上述植物提取物进行利用微生物的发酵。发酵处理可通过下述方式进行：例如，将浓缩干燥的植物提取物溶解于水并接种进行发酵的微生物；或者直接使用植物提取物而不将其浓缩干燥，并接种进行发酵的微生物。

进行发酵的微生物没有特别限定，可列举出乳酸菌、酵母、米曲霉等，优选为酵母，特别优选为saccharomyces veronae。

由于本实施方案中使用的2-酮戊二酸具有优异的表皮角质细胞增殖促进作用、丝聚蛋白mRNA表达促进作用、SPT mRNA表达促进作用及外皮蛋白mRNA表达促进作用，因此可分别用作表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂的有效成分。

换言之，为了制备表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂，能够使用2-酮戊二酸。

本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂可用于药品、准药品(quasi drug)、饮食等广范的用途中。

此外，作为本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA 表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂的有效成分，可使用含有2-酮戊二酸的组合物来代替分离的2-酮戊二酸。此处，在本实施方案中，含有2-酮戊二酸的组合物包括以含有2-酮戊二酸的植物为提取原料而得到的提取物、含有2-酮戊二酸的发酵物、及以该发酵物为提取原料而得到的提取物。此外，“提取物”包括通过提取处理而得到的提取液、该提取液的稀释液或浓缩液、或者将该提取液干燥而得到的干燥物。

2-酮戊二酸可通过其所具有的表皮角质细胞增殖促进作用来促进皮肤的更新，因此还可用作皮肤更新促进剂的有效成分。此外，2-酮戊二酸可用作由皮肤更新的延迟导致的皮肤弹性下降或暗沉等的预防·改善剂的有效成分。

进一步，2-酮戊二酸可通过其丝聚蛋白mRNA表达促进作用、SPT mRNA表达促进作用或外皮蛋白mRNA表达促进作用来改善皮肤的屏障功能，因此还可用作皮肤屏障功能改善剂的有效成分。

本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂可以为仅由2- 酮戊二酸形成的物质，也可以为将2-酮戊二酸制剂化而得到的物质。

可使用糊精、环糊精等药学上允许的载体和其他任意助剂，按照常规方法，将本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂制剂化成粉末状、颗粒状、片剂状、液状等任意的剂型。此时，作为助剂，例如可使用赋形剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味·矫臭剂等。表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂除了可掺合于其他组合物(例如，后述的皮肤外用剂、经口组合物等)而使用以外，也可制成软膏剂、外用液体制剂、贴剂等使用。

将本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂制剂化时， 2-酮戊二酸的含量没有特别限定，可根据目的适当设定。

另外，本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPTmRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂可根据需要将具有表皮角质细胞增殖促进作用、丝聚蛋白mRNA表达促进作用、SPT mRNA表达促进作用或外皮蛋白mRNA表达促进作用的其他物质 (例如，天然提取物等)与2-酮戊二酸一起掺合而用作有效成分。

作为对患者给药本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白 mRNA表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂的方法，可列举出经皮给药、经口给药等，根据疾病的种类适当选择适合于疾病的预防·治疗等的方法即可。

此外，关于本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA 表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂的给药量，根据疾病的种类、严重程度、患者的个体差异、给药方法、给药期等适当增减即可。

本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂通过2-酮戊二酸所具有的表皮角质细胞增殖促进作用，促进皮肤的更新，由此能够预防·改善皱纹、肌理消失、弹性降低等皮肤的老化症状。此外，本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂通过2-酮戊二酸所具有的表皮角质细胞增殖促进作用，恢复黑色素异常蓄积的角化细胞从角质层上的脱落等肌肤的新陈代谢功能，由此能够预防·改善皮肤的暗沉、色素沉着等症状。进一步，本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂通过其优异的表皮角质细胞增殖促进作用，也可用于需要促进表皮角质细胞的增殖的再生医疗等用途。然而，除了这些用途以外，本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂还可用于发挥表皮角质细胞增殖促进作用具有意义的所有用途。

本实施方案的丝聚蛋白mRNA表达促进剂通过2-酮戊二酸所具有的丝聚蛋白mRNA表达促进作用，可促进丝聚蛋白在细胞内的表达，改善皮肤的保湿能力，由此可维持皮肤的弹性，预防、治疗或改善皮肤的老化、皮肤粗糙等。此外，本实施方案的丝聚蛋白mRNA表达促进剂通过其丝聚蛋白mRNA表达促进作用，促进细胞内的丝聚蛋白的产生，提高皮肤的屏障功能，由此可预防、治疗或改善包含特应性皮炎(湿疹、皮肤的炎症、皮肤的瘙痒等)、过敏、哮喘等在内的特应性疾病。然而，除了这些用途以外，本实施方案的丝聚蛋白mRNA表达促进剂还可用于发挥丝聚蛋白mRNA表达促进作用具有意义的所有用途。

本实施方案的SPT mRNA表达促进剂通过2-酮戊二酸所具有的SPT mRNA表达促进作用，可强化皮肤的屏障功能，除了可预防、治疗或改善皮肤粗糙、干性皮肤等以外，还可预防、治疗或改善干燥性皮肤病(例如，特应性皮炎、银屑病、鱼鳞癣等)。然而，除了这些用途以外，本实施方案的SPT mRNA表达促进剂还可用于发挥SPT mRNA表达促进作用具有意义的所有用途。

本实施方案的外皮蛋白mRNA表达促进剂通过2-酮戊二酸所具有的外皮蛋白mRNA表达促进作用，可强化皮肤的屏障功能，预防、治疗或改善皮肤粗糙、干性皮肤等皮肤的老化症状、或者鱼鳞癣、银屑病、特应性皮炎、干皮病等干燥性皮肤病等。然而，除了这些用途以外，本实施方案的外皮蛋白mRNA表达促进剂还可用于发挥外皮蛋白mRNA表达促进作用具有意义的所有用途。

由于2-酮戊二酸具有优异的表皮角质细胞增殖促进作用、丝聚蛋白mRNA表达促进作用、SPT mRNA表达促进作用及外皮蛋白mRNA表达促进作用，因此例如适合于掺合在皮肤外用剂或经口组合物中。此时，可以直接掺合2-酮戊二酸，也可以掺合由2-酮戊二酸制剂化而成的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPTmRNA表达促进剂或外皮蛋白mRNA表达促进剂。

此处，作为皮肤外用剂，对其分类没有限制，广范地包括经皮使用的皮肤化妆品、准药品、药品等，具体而言，例如可列举出软膏、霜、乳液、化妆水、美容液、爽肤水(lotion)、啫喱(gel)、美容油、面膜、粉底、唇膏、入浴剂、生发油(hairtonic)、生发水(hair lotion)、洗发剂、护发素、肥皂、沐浴露等。

经口组合物是指危害人体健康的可能性小、在通常的社会生活中通过经口或消化道施与而摄取的物质，不受行政区对饮食、药品、准药品等的分类的限制。因此，本实施方案中的“经口组合物”广范地包括可经口摄取的普通食品、饲料、健康食品、保健功能食品(特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品)、准药品、药品等。

此外，由于本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA 表达促进剂、SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂具有优异的表皮角质细胞增殖促进作用、丝聚蛋白mRNA表达促进作用、SPT mRNA表达促进作用及外皮蛋白mRNA表达促进作用，因此也可作为用于与表皮角质细胞的增殖机制、丝聚蛋白、SPT及外皮蛋白的mRNA表达机制相关的研究的试剂而加以适当利用。

另外，本实施方案的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、SPTmRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂适合适用于人，但只要可发挥各自的作用效果，则也可适用于除人以外的动物 (例如，小鼠、大鼠、仓鼠、狗、猫、牛、猪、猴等)。

实施例

以下，示出试验例来对本发明进行具体说明，但本发明不受下述各个实例的任何限制。

另外，在以下的试验例中，作为2-酮戊二酸，使用了试样1：2-酮戊二酸(HYDRUSCHEMICALINC.制造)。

[试验例1]表皮角质细胞增殖促进作用试验

对于试样1，以下述方式对表皮角质细胞增殖促进作用进行试验。

使用正常人表皮角质细胞生长培养基(KGM)培养正常人新生儿表皮角质细胞(NHEK)后，通过胰蛋白酶处理来回收细胞。以使细胞密度成为 3.0×10

使用MTT比色法测定表皮角质细胞增殖促进作用。培养3天后，去除培养基，向各个孔中各添加100μL以终浓度为0.4mg/mL的方式溶解于PBS缓冲液而得到的MTT。培养2小时后，用100μL的2-丙醇提取在细胞内生成的蓝色甲臜(blue formazan)。提取后，对波长570nm下的吸光度进行测定。同时，作为浊度，对波长650nm下的吸光度进行测定，将两者的差作为蓝色甲臜生成量。根据得到的结果，利用下述式计算表皮角质细胞增殖促进率(％)。

表皮角质细胞增殖促进率(％)＝A/B×100

式中，A表示“添加了待测试样的细胞中的蓝色甲臜生成量”，B 表示“未添加试样的细胞中的蓝色甲臜生成量”。

将结果示于表1。

[表1]

如表1所示，确认到试样1具有优异的表皮角质细胞增殖促进作用。

[试验例2]丝聚蛋白(FLG)mRNA表达促进作用试验

对于试样1，以下述方式对FLGmRNA表达促进作用进行试验。

使用正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人新生儿表皮角质细胞(NHEK)进行预培养，并通过胰蛋白酶处理来回收细胞。以使细胞密度成为15×10

培养24小时后，去除培养基，向各个孔中各添加2mL溶解于KBM 培养基的待测试样(试样1，最终浓度参照下述表2)，在37℃·5％CO

以该总RNA为模板，对FLG及作为内参的GAPDH的mRNA的表达量进行测定。检测使用实时PCR装置Thermal Cycler Dice Real Time System III(Takara Bio Inc.制造)，通过利用PrimeScript

FLG mRNA表达促进率(％)＝A/B×100

式中，A表示“添加待测试样时的校正值”，B表示“未添加试样时的校正值”。

将结果示于表2。

[表2]

如表2所示，确认到试样1具有优异的FLG mRNA表达促进作用。

[试验例3]丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)mRNA表达促进作用试验

对于试样1，以下述方式对SPT mRNA表达促进作用进行试验。

使用正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人新生儿表皮角质细胞(NHEK)进行预培养，并通过胰蛋白酶处理来回收细胞。以使细胞密度成为15×10

培养24小时后，去除培养基，向各个孔中各添加2mL溶解于KBM 培养基的待测试样(试样1，最终浓度参照下述表3)，在37℃·5％CO

以该总RNA为模板，对SPT及作为内参的GAPDH的mRNA的表达量进行测定。检测使用实时PCR装置Thermal Cycler Dice Real Time System III(Takara Bio Inc.制造)，通过利用PrimeScript

SPT mRNA表达促进率(％)＝A/B×100

式中，A表示“添加待测试样时的校正值”，B表示“未添加试样时的校正值”。

将结果示于表3。

[表3]

如表3所示，确认到试样1具有优异的SPT mRNA表达促进作用。

[试验例4]外皮蛋白(IVL)mRNA表达促进作用试验

对于试样1，以下述方式对IVLmRNA表达促进作用进行试验。

使用正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人新生儿表皮角质细胞(NHEK)进行预培养，并通过胰蛋白酶处理来回收细胞。以使细胞密度成为15×10

培养24小时后，去除培养基，向各个孔中各添加2mL溶解于KBM 培养基的待测试样(试样1，最终浓度参照下述表4)，在37℃·5％CO

以该总RNA为模板，对IVL及作为内参的GAPDH的mRNA的表达量进行测定。检测使用实时PCR装置Thermal Cycler Dice Real Time System III(Takara Bio Inc.制造)，通过利用PrimeScript

IVLmRNA表达促进率(％)＝A/B×100

式中，A表示“添加待测试样时的校正值”，B表示“未添加试样时的校正值”。

将结果示于表4。

[表4]

如表4所示，确认到试样1具有优异的IVLmRNA表达促进作用。

[配方例1]

利用常规方法制造下述组成的霜。

[配方例2]

按照下述组成，利用常规方法制造乳液。

[配方例3]

利用常规方法制造下述组成的美容液。

[配方例4]

利用常规方法，制造具有以下组成的片剂。

[配方例5]

利用常规方法，制造具有以下组成的经口液状制剂。

＜1个安瓿瓶(1瓶100mL)中的组成＞

工业实用性

本发明的表皮角质细胞增殖促进剂、丝聚蛋白mRNA表达促进剂、 SPT mRNA表达促进剂及外皮蛋白mRNA表达促进剂能够对皱纹、肌理的消失、弹性的降低等皮肤的老化症状的预防·改善；皮肤的暗沉、色素沉着等症状的预防·改善；干燥性皮肤病等皮肤屏障功能降低的症状的预防·改善等做出较大贡献。