痤疮丙酸杆菌菌株及其医学用途
文献发布时间:2023-06-19 18:32:25
技术领域
本发明涉及属于皮肤细菌属(genus Cutibacterium)、痤疮种的选定细菌菌株及其医学用途,以及涉及包含该菌株的药物和营养组合物。
本发明源于自微生物领域,并在药物、化妆品和营养领域得到应用。
具体地,本发明涉及痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)的选定菌株,还涉及通过结构微生物成分和/或通过产生促进成纤维细胞生长的物质的菌株的后生元(postbiotics)和细胞壁片段。本发明的菌株、其壁片段及其后生元具有抗炎和抗菌活性。优选地,选定的细菌菌株或其壁的片段用于治疗皮肤病、感染或皮肤病变(affection)的局部应用。
背景技术
炎症本质上是对有害刺激或生物体组织损伤的生物反应,所述刺激或损伤可能是由外部原因引起的,例如与刺激物或微生物接触。炎症被认为是机体的保护性反应,旨在消除组织损伤的原因,清除因原始损伤和炎症过程而受损的坏死组织,并启动组织修复。生物体的这种反应涉及免疫细胞和分子介质。
目前,通过全身或局部施用非甾体或甾体抗炎药来治疗炎症。尽管抗炎剂广泛使用,但仍存在一些残余风险,即在用抗炎药物治疗后炎症可能持续存在。此外,在局部应用和全身施用的情况下,抗炎治疗并非没有副作用。
在过去几年中,由于滥用或误用旨在治疗皮肤炎症的甾体乳膏,局部施用的副作用发生率增加。
因此,目前需要具有抗炎活性的新产品,其即使长时间使用也不会受到严重的副作用影响。
在皮肤或粘膜感染的情况下,皮肤病学和妇科领域也出现类似的问题。
滥用局部使用的抗生素产品来治疗皮肤感染已经增加了对局部抗生素疗法的抗性病例的数量,这迫使医生开出第二代抗生素的处方。
因此,目前需要具有抗炎和/或甚至可能具有抗微生物活性的新产品,其可以替代市售药物。
本发明的目的之一在于提供具有抗炎和可能的抗微生物或抗真菌活性的产品,其使用基本上没有副作用。还希望提供在控制人类微生物群方面有活性的产品。
本发明的另一个目的在于提供具有抗炎活性的非甾体产品,其特别针对皮肤或粘膜例如阴道粘膜的局部应用。
后者通常针对病原体细菌和/或真菌,根据靶标,作为杀菌剂或抑菌剂或作为杀真菌剂或抑真菌剂。
另一方面,通过对比病原体,通过常驻微生物群的归一化,可以更快地恢复体内稳态条件。
发明内容
本发明源于这样的发现,即选定的皮肤细菌属、痤疮种细菌菌株促进成纤维细胞的增殖,并具有干扰大多数普通细菌和真菌生长的能力,尤其是那些影响人类皮肤的细菌和真菌。
特别是如权利要求1中所定义的选定的痤疮丙酸杆菌细菌菌株、其细胞壁的片段或如本文中所定义的包含其的后生元或组合物,显示出对免疫系统的调节以及对皮肤病原体微生物的改善的抑制作用。这些作用部分与菌株和附着于宿主细胞的病原体的干扰有关。
此外,发明人发现活的或灭活的细菌菌株或它们的一部分,例如本发明的它们的壁的片段,产生促进成纤维细胞生长和迁移的物质或副产物。该特性进一步支持了选定菌株的用途或由此产生的物质作为免疫调节剂的用途,并使其成为皮肤病学或妇科领域应用的合适候选物,尤其是在治疗细菌或真菌皮肤感染,尤其是白色念珠菌或细菌感染中。
因此,在第一个方面,本发明提供了保藏在国际保藏机构莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心有限公司(Leibniz-Institut DSMZ Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)的保藏编号(或备案号)为DSM 28251的皮肤菌属痤疮种的细菌菌株,或基本上衍生自所述菌株的变体。
一方面,本发明提供了上述保藏编号为DSM 28251的痤疮丙酸杆菌细菌菌株的医学用途。根据这一方面,本发明的菌株用于局部或全身施用。
全身施用是指将包括本发明菌株的药物、营养物施用至循环系统中的途径,从而使整个身体受到影响。施用可以通过肠内、口服施用或肠胃外施用进行,例如通过注射、输注或植入。
局部施用或应用是根据本发明的痤疮丙酸杆菌DSM 28251的优选施用途径。痤疮丙酸杆菌DSM 28251,后生元,细胞壁片段和包含其片段的组合物可以以任何适于局部施用的形式应用在皮肤上。
根据另一方面,本发明提供了如上鉴定的细菌菌株DSM 28251的菌株或变体,其基本上通过自发突变、诱导突变和选择、杂交和选择或其它遗传操作方法获得的,并且可以追溯到它。在另一方面,本发明涉及上述菌株的后生元及其医学或营养用途。
根据本发明,细菌菌株可以从健康皮肤中,从构成皮肤微生物组的众多菌株中分离和选择。
根据另一方面,本发明涉及保藏在国际保藏机构莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心有限公司的保藏编号为DSM 28251的痤疮丙酸杆菌细菌菌株,或基本上衍生自所述菌株的变体,其用于预防或治疗炎性疾病或感染,特别是皮肤或粘膜的炎性疾病或感染。
优选地,本发明的细菌菌株可以应用于皮肤病学和妇科领域,例如用于治疗皮肤或粘膜炎症或细菌、真菌或原生动物的感染。特别地,上述菌株在预防和/或治疗感染尤其是皮肤感染中是有效的。
本发明选定的菌株可以有效治疗真菌,尤其是念珠菌(Candida spp)属的酵母,尤其是白色念珠菌,或皮肤真菌例如马拉色菌属(Malassezia spp),两者都是人体的机会性感染的最常见病原体。此外,本发明选定的菌株用于治疗对市场上可获得的抗真菌产品有抗性的真菌感染。
本发明还提供了痤疮丙酸杆菌DSM 28251(特别热灭活的)、后生元或该菌株的壁片段、或其局部组合物的直肠用途,特别是在治疗痔疮或肛门皲裂或皮肤疤痕中的用途。
在另一方面,本发明涉及透明质酸和痤疮丙酸杆菌(C.acnes)DSM 28251细菌壁片段的组合物,特别是用于治疗伤口、擦伤、皮肤溃疡,例如压迫性溃疡。
本发明的另一方面涉及上述鉴定的细菌菌株的美容用途,用于改善皮肤的美容方面,例如发红或红斑。
根据另一方面,本发明涉及上述鉴定的菌株的营养用途或由此获得的后生元的营养用途。
附图说明
现在将参照附图详细描述本发明,其中:
图1示出了报告用image j软件计算的实施例1的隔膜值的柱状图;
图2示出了用image j软件计算的实施例1的隔膜面积的柱状图;
图3示出了说明通过向培养基中加入不同浓度的热灭活的痤疮丙酸杆菌DSM28251对金黄色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)和白色念珠菌(C.albicans)的生长曲线的体外影响的柱状图。
图4说明了在实施例3的测试中使用的上清液和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的制备。
图5A和5B示出了说明大蜡螟幼虫在注射来自金黄色葡萄球菌ATCC BAA1680(At)培养物和金黄色葡萄球菌ATCC 29213(B)培养物的上清液后的存活率的图,所述培养物用根据实施例4测试1h的配方预孵育。“上清液+配方A(formA)”代表与LimpiAD A一起孵育的上清液,“上清液+配方D(formD)”代表与配方LimpiAD D一起孵育的上清液,“上清液+壁”代表与LimpiAD活性成分一起孵育的上清液,“上清液”代表对照组,“培养基”代表单独的培养基(无细菌培养),“盐水”代表假处理。
图6A和图6B示出了说明大蜡螟幼虫在注射来自金黄色葡萄球菌ATCC BAA1680(A)和金黄色葡萄球菌ATCC 29213(B)培养物的上清液后的存活率的图,所述培养物用根据实施例4测试4h的配方预孵育。“上清液+配方A(formA)”代表与配方LimpiAD A(如实施例4中所定义)一起孵育的上清液,“上清液+配方D(formD)”代表与LimpiAD D一起孵育的上清液,“上清液+壁”代表与LimpiAD活性成分一起孵育的上清液,“上清液”代表对照组,“培养基”代表单独的培养基(无细菌培养),“盐水”代表假处理。
图7示出了对照组中“标准化”的靶基因的表达,表示为如实施例4中报道的倍数增加或减少。
图8示出了五张图,每张图说明了用来自七种已知的痤疮丙酸杆菌菌株的上清液和来自(对比)痤疮丙酸杆菌DSM 28251菌株的上清液,以及没有菌株的对照组的上清液孵育的金黄色葡萄球菌(三种不同菌株)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和白色念珠菌菌株的比较生长曲线;
图9示出了五张图,每张图说明了三种金黄色葡萄球菌菌株、一种表皮葡萄球菌菌株和一种白色念珠菌菌株各自在孵育有七种不同的热灭活的痤疮丙酸杆菌菌株和痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251(对比热灭活菌株)的培养基中的对比生长曲线;
图10示出了五张图,每张图说明了三种金黄色葡萄球菌菌株、一种表皮葡萄球菌菌株和一种白色念珠菌菌株各自在孵育有细菌壁片段的培养基中的比较生长曲线,所述细菌壁片段是通过将七种不同的已知痤疮丙酸杆菌菌株和痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251(对比细菌壁片段)均质并随后梯度分离而获得。
具体实施方式
在第一方面,本发明涉及属于皮肤细菌属、痤疮种的菌株,其以保藏编号DSM28251(ID19-401)保藏于国际保藏机构莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心有限公司,或者基本上衍生自所述菌株的变体。
本发明还涉及权利要求2、3中定义的后生元和权利要求4、5中定义的细胞壁。
上述细菌菌株具有体内抗炎活性和至少体外抗微生物活性。来自上述菌株的细胞壁或后生元也具有这些活性。
发明人进行的实验测试证明了上述活性,并在以下实施例中报道。这些测试为将上述鉴定的细菌菌株用作抗炎剂、免疫调节剂和抗微生物剂的用途,尤其是用于局部应用提供了科学基础。
在本发明的某些方面,本文提供了组合物,尤其是药物或营养组合物,其包含如本文所定义的菌株/壁或后生元。
根据另一方面,本发明涉及上述鉴定的菌株/壁/后生元作为药物的用途及其医学用途,特别是如权利要求9-13中所定义的。
选定的细菌菌株的固有特性提供了抗炎作用,使医生能够治疗多种疾病,尤其是那些位于人体皮肤或粘膜上的疾病。
此外,选定的菌株的抗菌和/或抑菌特性使其可用于治疗感染,尤其是皮肤和粘膜感染。选定的菌株已被证明对普通细菌有效,尤其是革兰氏阳性菌(gram positivebacteria),尤其是球菌(cocci bacteria)例如金黄色葡萄球菌,或对大肠杆菌和真菌(如念珠菌属)有效。
根据本发明的菌株具有基因型特征,并且可以通过在基因组中鉴定的特定性状以清晰和明确的方式进行鉴定。该菌株是自发进化的,没有任何直接干预或基因操作,并具有工业应用的相关特征。为了验证和确定DSM 28251菌株的特征,并排除该菌株与现有技术中描述的菌株的可能重叠,通过DSMZ进行了基因型表征。
一方面,本发明提供了如权利要求7、8所定义的局部组合物的美容用途,特别是用于特别是人类面部的敏感皮肤、红皮肤、红斑、干性皮肤的美容治疗或预防。
在某些方面,本发明还涉及DSM 28251痤疮丙酸杆菌菌株的菌株或壁或后生元,用于治疗以下的医学用途:
-妇科疾病,例如阴道炎、阴道感染或炎症或
-直肠病症,例如痔疮、肛门皲裂或皮肤疤痕或肛周区域或
-伤口、损伤、擦伤、皮肤溃疡,例如压迫性溃疡,或用于愈合伤口。
-“菌株DSM 28251”是指包括2013年12月18日提交的(鉴定参考号ULTIMO),并根据布达佩斯条约于2019年12月22日转化为保藏于国际保藏机构莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心有限公司的保藏编号为DSM 28251的皮肤细菌属、痤疮种的细菌菌株;通常,痤疮丙酸杆菌是一种革兰氏阳性细菌。
-“遗传操作”是指包括任何旨在指导以相应的表型性状表达的特定遗传特征的获得过程的技术干预,其中技术干预包括(Sturley&Young,1986):(i)使天然菌株杂交,然后进行选择;(ii)产生杂交体,然后进行选择;(iii)转化,即在染色体或线粒体基因组中插入外源DNA,或其它遗传元素,例如质粒;(iv)诱导随机突变,通常随后选择和/或产生的杂交体(Nevoigt 2008)可作为进一步的操作模式加入;
-“衍生的变体”是指包括保藏在DSMZ的保藏编号为DSM 28251的痤疮丙酸杆菌菌株的变体,通过微卫星DNA图谱或由于通过基因组测序和比较分析可检测到的独特的遗传特征,可以追溯到该菌株。
-“生长培养基”(同义词:培养基、生长培养基/培养肉汤/生长肉汤)是指含有微生物,尤其是细菌例如革兰氏阳性细菌用于细胞复制,使单细胞数量增加和群体增长所需的所有化合物(因子)的物质。微生物在培养基中生长所需的因子主要属于以下几类:碳源、类似氮源(由氨和游离氨基酸组成,后者也称为FAN)、维生素和盐(微量元素)。典型的碳源是甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、大麦芽提取物和小麦芽提取物。
非活细胞/非存活细胞、细胞提取物、细胞裂解物的组成与DSM 28251菌株的独特代谢和生理特性密切相关。
-“后生元”是指无活性的细菌产物,包括由微生物分泌的代谢副产物,微生物为例如保藏在DSMZ的保藏编号为DSM 28251的菌株,其在宿主中或当施用于人体组织(如皮肤)时具有生物活性。
后生元还包括痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251的任何材料,有利地包括其壁、细胞质、细胞质膜、遗传物质(类核物质)、核糖体(可以在细菌裂解后释放或获得)。后生元为宿主提供了生理益处,并可用于配制用于医疗或美容用途的组合物,以及用于本文描述的口服和/或局部施用。
痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251的后生元可以根据包括以下步骤的一般程序/方法获得:
细菌菌株在培养基或肉汤中生长以获得悬浮液。
通过使用常规技术,在试管中离心悬浮液。
在离心结束时,获得悬浮液的分层。将含有细胞的沉淀物沉积在试管底部,试管上层含有上清液,即液体/培养基。
然后除去上清液,留下沉淀物沉积在试管底部,收集沉淀物并用水洗涤。然后将沉淀物重悬于生理(盐水)溶液中以获得细胞,并进一步离心以除去剩余的培养基。悬浮在水中的细胞用机械搅拌器例如Ultratturrax(机械裂解)进行机械处理。
随着细胞壁的机械裂解,细胞内容物被释放出来,并获得后生元(上清液)。
在下面的详细描述和实施例中描述了该过程的具体实施方案。
-“载体”是指赋形剂、媒介物、稀释剂或佐剂,其可以或可以存在于本发明的组合物中。
-“营养产品”是指改善营养状况的产品,可用于支持或改善一个或多个器官的功能活性或人体在生理范围内的功能。
-本文提及的“选定的细菌菌株”或“菌株”是指保藏在DSMZ的保藏编号为DSM28251的本发明菌株。
-“细胞壁”或“(本发明)细菌菌株的壁”是指保藏编号为DSM 28251的痤疮丙酸杆菌菌株的细胞壁。
本发明菌株的细胞壁可以被破坏成部分或片段。
术语“片段”是指本发明的DSM 28251菌株的壁的一部分。
片段也可以指菌株DSM 28251的细胞壁的细胞裂解物。
DSM 28251菌株的细胞壁的片段或裂解物可以通过常规或一般的细胞破碎方法获得,例如如下文所公开的:
肉汤或培养基中的细菌通常通过使用索氏提取器进行洗涤和去脂。然后将去脂的细菌悬浮在水中,然后进行机械裂解,例如用机械搅拌器(例如通过使用Ultratturrax),并用硫酸铵处理内容物以沉淀细菌壁的片段。
然后可以例如通过用水洗涤来清洁片段,以获得壁片段。
在实施例6中描述了获得痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251的壁片段的具体方法。
通过对本发明的菌株进行机械方法/裂解处理或非机械方法/裂解处理,可以实现菌株或其壁的适当破坏/破碎。
用于破碎(裂解)本发明菌株的细胞壁并获得壁片段的合适的机械方法包括固体剪切或流体剪切方法。
固体剪切包括使用珠磨机、X-压机或Hughes压机。
液体剪切包括超声和高压方法,包括Hughes压机或French压机和/或用均质器均质或使用微流化均质器。
珠磨(或研磨)技术通常包括用玻璃珠搅拌菌株悬浮液。
通常,用珠磨法破碎细胞壁是在珠磨机中进行的,该珠磨机包括夹套研磨室,旋转轴穿过夹套研磨室中心。该轴装有搅拌器,将动能传递给腔室中的珠子,迫使它们彼此碰撞(Chisti&Moo-Young,1986;Middelberg,1995)。合适的珠子直径可以是0.10-0.15mm,以便有效地破碎细菌。大型工业仪器可以使用直径为0.4-0.6mm的珠子,因为从悬浮液中分离珠子的机制不同(Kula&Shutte,1987)。为了破碎细菌,合适的尖端速度至少为10m
合适的固体剪切还包括超声和高压方法,包括Hughes压机或French压机,其中通过高压迫使冷冻的细胞悬浮液通过一个小开口(Engler,1985)。
超声处理包括使用通常频率高于15-20kHz的超声波,其可以破碎悬浮液中的细胞壁。合适的声功率例如,当对常规液体培养基中的5-30ml 20%细菌悬浮液进行超声处理时,使用35-95W的超声功率。
或者,如Engler,1985所报道的,机械破碎可以在高压阀均质器中通过将菌株的细胞悬浮液在高压下通过可调节的限流孔排出阀来获得。典型地,基本的均质器设计包括正排量泵,其迫使细胞悬浮液通过阀座的中心并穿过阀座表面。调节阀门上的力来控制压力。流体径向流过阀门并撞击冲击环(Middelberg,1995)。细胞壁的非特异性撕裂导致破碎。
示例性的均质器类型是曼顿-高林(Manton–Gaulin)APV设计(Middelberg,1995)。例如,在均质器中,温度每10MPa升高约21C。操作压力对均质器中的破碎过程有很大的影响。通过在较高压力下操作均质器,对于给定的破碎程度,可以减少细胞浆通过均质器的次数(Chisti&Moo-Young,1986;Bury et al.,2001)。
微流化均质器也可以用作获得破碎细胞壁的设备。在该仪器中,两股细胞悬浮液流高速撞击静止表面,能量输入几乎在撞击点瞬间消散,导致细胞破碎(Middelberg,1995;Agerkvist&Enfors,1990)。菌株悬浮液在微流化器破碎室中的停留时间为25-40ms,该破碎室是装置中最热的部分。通过将破碎室浸没在冰浴中可以实现原位冷却(Sauer et al.,1989;Geciova,personal experience)。破碎细胞的比例随着压力和通过次数的增加而增加。
非机械方法基于通过将加压的亚临界或超临界气体引入细胞中而获得的减压,在通过膨胀释放所施加的压力后引起破碎。
细胞壁的另一种非机械破碎可以通过渗透休克获得,其中在常规条件下在高渗透压下平衡后,将细胞-菌株悬液在液体培养基/肉汤中稀释。
细胞裂解的可选择方法是热解,其包括在常规条件下对细胞进行热处理。另一种非机械细胞裂解可以通过化学透化来实现,化学透化特别地采用选自抗生素例如β-内酰胺抗生素(如青霉素),螯合剂如EDTA,离液剂如尿素、胍、乙醇,去污剂如Triton X系列、十二烷基硫酸钠、月桂基肌氨酸钠,溶剂如甲苯、丙酮、氯仿,氢氧化物如氢氧化钠,次氯酸盐如次氯酸钠及其混合物的物质。
菌株的细胞裂解也可以通过酶裂解获得,例如通过使用蛋白酶和葡聚糖酶首先攻击细胞壁的甘露糖蛋白复合物(mannoprotein complex),然后攻击葡聚糖骨架(Kitamura,1982)。用于菌株细胞壁裂解的合适产品是商业产品酵母酶-20T(Seikagaku America有限公司,罗克维尔,MD)。溶菌酶也可用于裂解肽聚糖层,因为它催化b-1,4-糖苷键的水解。
根据优选的实施方案,痤疮丙酸杆菌DSM28251菌株的壁片段可以通过用硫酸铵处理该细菌菌株来获得,优选在低于室温的温度下,例如在10至2℃的范围内,并且有利地,在处理后,离心悬浮液并收集沉淀的片段。
有利地,在用硫酸铵处理之前,将痤疮丙酸杆菌DSM 28251菌株干燥并任选用水离心。任选地,在离心后,将由离心得到的上清液加热,例如在40至95℃的温度下,优选在75至85℃下,然后例如用冷水冷却,优选在3至15℃下。此后,进行沉淀步骤,与浓度为20至60%v/v的硫酸铵溶液一起孵育,例如在2至10℃下。有利地,孵育后,将获得的悬浮液离心,并收集沉淀的片段。例如,使用选自乙醚-乙醇、氯仿、甲醇-氯仿及其混合物的有机溶剂,通过索氏处理使细菌沉淀物脱脂,然后例如在通风层流下干燥。干燥后,通过两步Ultratturrax处理均质沉淀物,优选每一步1分钟,加入蒸馏水,优选比例为1:2p/V。离心后,将上清液在80℃加热,然后在冷水下冷却,优选3至15℃,最后在冰上冷却。随后,通过在4℃下与40%v/v冷硫酸铵一起孵育24小时来进行片段沉淀步骤。孵育后,将悬浮液离心,收集沉淀的片段并冻干。
在一些实施方案中,将保藏编号为DSM 28251的痤疮丙酸杆菌的细胞壁片段去脂,即通过化学/生物技术方法进行处理以去除或显著减少细菌细胞壁的脂质成分。例如,在破碎产生细胞壁片段之前,将保藏编号为DSM 28251的痤疮丙酸杆菌去脂。典型地,本发明菌株细胞壁的去脂片段包含糖和肽链,典型地糖和肽链彼此结合成糖肽,形成紧密的网状结构。细胞壁的典型糖包括N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺。
药物组合物
细菌菌株DSM 28251及其基本上衍生的菌株或由此产生的片段或后生元被证明对于制备药物组合物(尤其是局部应用的药物组合物)工业应用是极其有利的。
根据一方面,本发明涉及药物组合物,其包含如上定义的细菌菌株、片段或由此产生的后生元,以及药学上或生理学上可接受的赋形剂。
生理学或药学上合适的载体、稀释剂或赋形剂可以根据所得药物组合物的目标施用途径来选择。
本发明的药物组合物包括通过将根据本发明的如本文定义的菌株、其片段或其后生元与药学上可接受的载体混合而制成的任何组合物。这种组合物适用于动物或人类的药物用途。
本发明的药物组合物包含治疗有效量的如上定义的菌株或其片段/后生元,以及药学上可接受的载体。
药物组合物可以任选地含有其它活性成分。术语“载体”是指与治疗或活性成分一起施用的媒介物、赋形剂、稀释剂或佐剂。适用于期望施用的制剂形式的任何载体和/或赋形剂都被考虑与本文公开的菌株/壁/后生元一起使用。
根据施用所期望的制剂形式,载体可以采取多种形式,例如口服或肠胃外施用,包括静脉内施用。在制备用于口服剂型的组合物时,可以使用任何常用的药物介质,例如水、乙二醇、油、醇、调味剂、防腐剂、着色剂等,在口服液体制剂的情况下,可以使用例如悬浮液、酏剂和溶液;或者在口服固体制剂如粉末、硬胶囊和软胶囊以及片剂的情况下,可以使用载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、制粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等,固体口服制剂比液体制剂更优选。
在某些实施方案中,根据常规药物混合技术,本发明的菌株/壁/后生元可以作为活性成分与合适的药物载体和/或赋形剂紧密混合。
该组合物包括适于肠胃外施用(包括皮下、肌内和静脉内、肺、鼻、直肠、局部或口服给药)的组合物。在任何给定的情况下,合适的施用途径将部分取决于所治疗病症的性质和严重程度以及活性成分的性质。典型的施用途径是口服途径。该组合物可以方便地以单位剂量形式存在,并通过药学领域公知的任何方法制备。优选的组合物包括适于口服、肠胃外、局部、皮下或肺部、以鼻或口腔吸入的形式施用。该组合物可以通过药学领域公知的任何方法制备。
药物组合物可以是片剂、丸剂、胶囊、溶液、悬浮液、乳液、粉末、栓剂的形式,以及作为持续释放配方。
如果需要,可以通过标准的水性或非水性技术对片剂进行包衣。在某些实施方案中,这种组合物和制剂可以包含至少0.1%的菌株。当然,这些组合物中的活性菌株/壁/后生元的百分比可以变化,并且可以方便地在单位重量的约0.1%至约60%之间,0.5%至20%之间变化。在这种治疗上有用的组合物中,活性菌株/壁/后生元的量是可以获得治疗上的活性剂量。菌株/壁/后生元也可以以例如液滴或喷雾的形式鼻内施用。
片剂、丸剂、胶囊等也可以含有粘合剂,例如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂例如磷酸二钙;崩解剂,例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸;润滑剂,例如硬脂酸镁;和甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精。当剂量单位形式是胶囊时,除了上述类型的材料之外,它还可以含有液体载体例如脂肪油。各种其它材料可以作为包衣存在,或者改变剂量单位的物理形式。例如,片剂可以用虫胶、糖或两者包衣。除了活性成分之外,糖浆或酏剂可以包含作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味剂例如樱桃或橙子香料。为了防止在通过胃肠道上部的过程中分解,该组合物是肠溶包衣配方。
在本发明的框架中,优选局部使用。因此,在某些优选的实施方案中,组合物用于局部应用。在这种应用中,含有如本文所定义的菌株/壁/后生元的组合物可以应用于人类皮肤上。
用于局部施用的组合物包括但不限于软膏、乳膏、洗剂、溶液、糊剂、凝胶、粘剂、脂质体、纳米颗粒、贴剂、绷带和伤口敷料。在某些实施方案中,局部配方包含渗透促进剂。
用于肺部施用的组合物包括但不限于由菌株/片段/后生元的粉末和合适的载体和/或润滑剂的粉末组成的干粉组合物。用于肺部施用的组合物可以从本领域技术人员已知的任何合适的干粉吸入器装置中吸入。
典型地,相对于组合物的总重量,局部使用的组合物可以包含0.00001%至10%、0.0001%至3%、0.1%至2%重量的上述鉴定的细菌菌株。
局部应用的组合物可以是固体、半固体或流体形式。固体形式的合适配方包括乳膏、凝胶、软膏、糊剂、油膏剂、乳膏、贴剂。
用于局部应用的流体形式的组合物可以是洗液、凝胶、悬浮液、乳液的形式。
在流体或半流体配方形式的情况下,细菌菌株可以在生理学上可接受的液体形式的载体中稀释,生理学上可接受的液体形式为例如水、醇、水醇或甘油溶液,或者与适于局部应用的其它液体混合。
举例来说,液体形式的本发明的组合物可以通过将细菌菌株或其副产物溶解或分散在水和/或醇中来制备。液体组合物可以被缓冲以达到与皮肤的pH值相容的pH值范围,该pH值范围方便地选自5至7,然后过滤,并包装在合适的容器(例如瓶子或小瓶)中。
在一个实施方案中,用于局部应用的配方是乳膏或乳液的形式,其含有在合适的赋形剂中携带的细菌菌株。
根据其它实施方案,本发明的组合物是用于全身施用的形式,特别是用于口服施用的形式。在这些情况下,组合物包含如前定义的细菌菌株和一种或多种适于全身施用的载体或赋形剂。
组合物的施用在足以减轻受试者的目标疾病的方案和剂量下进行。
在一些实施方案中,在本发明的药物组合物中,一种或多种活性成分通常以剂量单位配制。用于每日施用的剂量单位可以每剂量单位包含0.00001至1000mg的菌株/壁/后生元。
在一些实施方案中,局部配方的有效量将取决于疾病、病症或病况的严重程度、先前疗法、个体的健康状况和对药物的反应。在一些实施方案中,剂量占配方重量的0.001wt%至约60wt%的范围内。
当与一种或多种其它活性成分组合使用时,本发明的菌株/壁/后生元和其它活性成分可以以比各自单独使用时更低的剂量使用。
关于各种施用途径的配方,药物施用的方法和配方公开于雷明顿制药科学,第17版,Gennaro等人编,Mack出版公司,1985(Remington's Pharmaceutical Sciences,17
在某些实施方案中,用于口服施用的本发明组合物是营养产品或饮食产品或营养产品。
下面描述本发明的实施方案和优选程序的实施例来说明本发明。
实施例1
用衍生自保藏编号为DSM 28251的细菌菌株培养物的上清液来刺激的人成纤维细胞的体外潜在迁移。
保藏编号为DSM 28251的细菌菌株培养物上清液的作用机制之一归因于后生元效应。术语后生元指微生物(尤其是细菌和/或益生菌)的代谢副产物。典型地,后生元由细菌例如益生菌(当以合适的量施用时,活微生物对宿主产生有益的效果)的代谢活动或发酵过程产生。
后生元在调节健康和维持健康的微生物群方面发挥着极其重要的作用。
本研究的目的之一是评估后生元对永生化人皮肤成纤维细胞迁移的影响,以评估衍生自保藏编号为DSM 28251的细菌菌株培养物的上清液是否促进该细胞系的迁移。
衍生自保藏编号为DSM 28251的细菌菌株培养物的上清液。
细菌
将本发明的保藏编号为DSM 28251的细菌菌株在37℃下在脑心浸液肉汤(BHI)培养基中生长过夜,然后为了评估后生元效应,将来自细菌生长的上清液离心,随后过滤(0.45μm)以除去细菌细胞。使用前,将等分试样涂在BHI琼脂上,并在37℃下孵育24小时,以验证没有微生物生长。
细胞系
将非致瘤性人皮肤成纤维细胞维持在25cm
迁移分析的细胞实验
用预先过滤的衍生自用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲盐水)以1:10和1:100稀释的Aileens细菌培养物的上清液处理细胞。此外,用DPBS1:10稀释和1:100稀释的BHI处理成纤维细胞,用作对照。
将细胞再保持24小时。将通过数字显微镜目镜拍摄细胞迁移的程度,并使用图像分析软件Image J(V 1.45s,由美国国立卫生研究院提供)进行测量。随后将通过使用软件的功能将每个图像转换成负片,然后进行测量。实验进行三次,结果表示为平均值±SE。学生T检验将用于统计显著性。p>0.05的值被认为具有统计学意义。
结果
获得的结果显示,用DPBS以1:10和1:100稀释的细菌菌株保藏编号为DSM 28251的上清液促进细胞迁移(图1和图2)。此外,用DPBS以1:10和1:100稀释的BHI不干扰成纤维细胞的迁移。
实施例2
保藏于DSMZ的保藏编号为DSM 28251的热灭活细菌菌株对人类病原体微生物生长的活性。
该细菌菌株在37℃的脑心浸液(BHI)培养基中生长,然后在60℃热灭活1小时。
用水洗涤培养物以洗去培养基,将无培养基的培养物在Muller Hinton(MH)培养基或Sabouraud氏培养基中稀释至10
用Hall等描述的分光光度法测试了保藏编号为DSM 28251的细菌菌株干扰或抑制人类皮肤中常见的细菌和真菌(参见测试的细菌菌株)的微生物生长的能力。
在96孔聚苯乙烯平板中,评估微生物生长抑制。用测试的微生物,连同单独的微生物(对照)和培养基(空白)一起,接种硝化(tindalized)混合物的系列稀释液(10
在规定的时间间隔(3、6、20和24小时i),在600nm处进行分光光度读数。结果以生长曲线(单独的微生物)和抑制曲线(微生物和目标浓度)的形式提供。每个实验以八倍进行,重复三次,结果表示为平均值±SD。
测试的细菌菌株:
-金黄色葡萄球菌
-白色念珠菌
-大肠杆菌
结果在附图3中报告。
如图3所示,向金黄色葡萄球菌培养物中添加本发明的保藏编号为DSM 28251的细菌菌株以依赖剂量的方式减缓了对数生长期。
在白色念珠菌中也发现了类似的结果。
这些实验数据支持根据本发明的保藏编号为DSM 28251的细菌菌株的抑制作用。
仅采用培养基的对比试验(即没有28251菌株)。
实施例3
测试配方
A)基础配方(不含
B)含有1%
C)含有2.5%
D)含有2.5%
该配方的基础配方包含水、辛酸/辛酸三甘油酯、甘油牛油果树果脂。
每种配方都包含在4扇区平板的琼脂培养基(20%)中。这4个部分用于涂布不同的真菌稀释液(10-5 10-8CFU/mL),相同的稀释液涂布在没有配方的培养基上,作为对照。接种后,将含有配方的平板在37℃孵育48小时。对比对照检查含有配方的培养基中的真菌生长。此外,记录单独培养基和配方/培养基的pH,以验证白色念珠菌的毒力状态对非毒力转变的可能干扰。
结果
在对照组中,观察到具有典型白色和混浊形态的大量菌落(2×109CFU/mL)的明显形成。
从显微镜下的发现,我们观察到病原微生物的特征性细胞形态和真菌菌丝的产生。
对于所有测试的配方,我们观察到不透明铜绿的形成,菌丝形成失败,这两个特征与病原体从毒力状态到非毒力状态的转变有关。
此外,单独培养基(S)的pH与配方pH培养基相似;因此,pH值的变化似乎与表型转换无关。
结论
在白色念珠菌中,观察到菌落形态的变化:在没有配方的情况下,观察到具有乳白色外观的典型菌落,而在有配方的情况下,获得均匀和半透明的铜绿。这种变化也在微观层面得到了证实,在没有配方的情况下,微生物被观察为酵母和霉菌(存在菌丝),而在有配方的情况下,微生物仅被观察为酵母。
这一观察结果证明了含有本发明所选菌株的配方对白色念珠菌生长的抑制活性。
实施例4
含有菌株DSM 28251(LimpiAD)的配方对金黄色葡萄球菌产生的毒素/分解代谢物的抑制作用:大蜡螟体内试验和基因表达测定
引言
测试了该配方和活性成分作为能够降低金黄色葡萄球菌毒素对特定生物靶标的作用的药剂的潜在作用。金黄色葡萄球菌是在特应性皮炎的病因和发展中最熟知的微生物之一。其主要发病机制之一是产生多种毒素。
测试的LimpiAD配方含有水,辛酸/辛酸三甘油酯,甘油牛油果树果脂。
为此,使用大蜡螟幼虫进行了体内试验。较大的大蜡螟(G.mellonella)是一种模式生物,已经被证实用于细菌感染实验和药理学毒性试验。它是新化合物的初步筛选和潜在抑制活性的快速可靠评估的重要工具,因此应该减少使用哺乳动物模型所需的实验次数[6]。
大蜡螟的幼虫提供了多种选择来容易地递送病原体,例如局部应用、口服递送和注射。微生物可以直接注射到幼虫血腔中,因此,幼虫接受已知量的病原体。
大蜡螟模型的另一个优点是可以评估与免疫和应激相关的基因的表达。因此,为了研究该装置对接种了金黄色葡萄球菌上清液的大蜡螟幼虫的作用,我们进行了qPCR测定以评估LimpiAD对大蜡螟的免疫和应激基因的影响。我们选择了在昆虫对感染的免疫反应中起关键作用的基因:吞噬作用、细胞因子调节、细胞粘附和金属蛋白酶抑制。
材料和方法
测试的微生物菌株和培养条件
金黄色葡萄球菌ATCC BAA1680和金黄色葡萄球菌ATCC 29213在脑心浸液肉汤中生长,并在37℃的热条件下孵育过夜。
上清液制备:将两种葡萄球菌菌株的过夜培养物以5000rpm离心5分钟。通过过滤灭菌(0,22μm)除去残留的细菌细胞,并以1:2的比例稀释在盐水溶液中。
将稀释的上清液与三种不同的配方混合(1:5w/v)(表1):
-LimpiAD A(基础配方,无活性成分);
-LimpiAD D(含2.5%活性成分);
-单独的活性成分。
将配方孵育1h和4h后,离心回收上清液,用于接种大蜡螟幼虫。采用1:2比例的上清液(无配方)和单独培养基(脑心浸液肉汤)注射处理幼虫,用作对照(图25)。
评估幼虫存活的大蜡螟幼虫感染:根据体重和尺寸选择幼虫,并将其分成表1中列出的实验组。使用装有胰岛素注射器(BD,惠灵顿)和1mL超细针的重复分配器穿过幼虫的最近的前肢通过注射接种幼虫。接种后,将每种条件下的幼虫在培养皿中于35℃孵育,并在接下来的96小时内观察存活情况。
表N.1测试物质和每组中注射的大蜡螟幼虫数量。
基因表达测定:qPCR
将每组中的三只存活幼虫(对照,盐水溶液;感染的,上清液ATCC BAA1680;用上清液ATCC BAA1680金黄色葡萄球菌处理)处理后,在96h时回收。按照制造商的方案,在TRI试剂(西格玛奥德里奇贸易有限公司)中提取RNA,用分光光度计定量RNA提取物,然后用ReadyScript
基因表达中使用的引物名称、功能和序列列于表2。通过转子基因Q-QIAGEN,用
表2用于分析大蜡螟幼虫基因表达的引物
试验中使用的上清液和金黄色葡萄球菌的制备如图5所示。
幼虫存活
与对照组相比,用试验配方预孵育一小时的上清液的致死性要低得多。
因此,幼虫存活率的增加归因于金黄色葡萄球菌ATCC BAA1680活性成分的作用。
类似地,在孵育4小时后,证实基础配方A的活性处于较低水平,而配方D证实了较高的幼虫存活率。
关于菌株金黄色葡萄球菌ATCC 29213,也证实了基础配方A相对于其它测试配方的较低活性。在这种情况下,相对于配方D,活性成分在1h和4h预处理中均产生更大的幼虫存活率增加。
总之,这些结果表明,活性成分可以干扰与金黄色葡萄球菌ATCC BAA1680产生的毒素/分解代谢物相关的发病机理。此外,对于两种菌株以及对于金黄色葡萄球菌ATCC29213菌株,在孵育1小时后已经可以发挥该作用。随着与上清液中的毒素/分解代谢物的推定相互作用持续时间越长,导致的干扰强度越高(图27-28)。
相反,与治疗组相比,18-wheeler基因在感染组中是低表达(99.98%)。因此,LimpiAD预孵育显著增加了该基因在细胞粘附和迁移中的表达。
基因表达测定
如图7所示,与两组中的对照相比,与代谢应激相关的两个基因IMPI和GLUT的表达没有显著改变。因此,LimpiAD不会改变这些基因的表达。与先天免疫相关的两个基因在感染组和治疗组中的表达不同。与治疗组相比,感染组中调节炎性细胞因子的CITOK基因(NF-κB级联)过表达(93.8%)。因此,LimpiAD减少了促炎细胞因子的表达。
表3用LimpiAD/感染处理后大蜡螟的基因表达
结论
金黄色葡萄球菌致病菌株的感染被认为是特应性皮炎中的有害因素,因为这些微生物产生分解代谢物,刺激炎性细胞因子的产生,并导致表皮屏障的破坏和疾病特征性症状的表现。
获得的结果表明,LimpiAD成分降低了金黄色葡萄球菌产生的分解代谢物对注射的大蜡螟幼虫存活的影响。此外,用LimpiAD治疗减少了促炎细胞因子的表达,增加了参与细胞粘附和迁移的18-wealer基因的表达。从代谢应激和免疫基因的表达中获得的数据为LimpiAD装置的作用机制提供了进一步的证据。
实施例5
用间歇灭菌的(tyndallized)痤疮丙酸杆菌DSM 28251与其它皮肤细菌菌株对皮肤病原体微生物生长的对比测试。
将痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251的热灭活细菌对寄居在皮肤上的细菌的抑制活性与相同种属的四种不同菌株(具有相同肽聚糖组成的皮肤细菌菌株)和从进化角度看非常接近(系统发育接近)的颗粒皮肤杆菌(C.granulosum)菌株的活性进行比较。
本研究的目的是评估与其它具有系统发育接近性的种属相比,痤疮丙酸杆菌菌株DSM28251是否具有特殊或改善的特性。
为此,选择并测试了与DSM 28251菌株在种系型或系统发育距离上不同的四种皮肤杆菌属菌株(三种痤疮皮肤杆菌和一种颗粒皮肤杆菌(Cutibacterium granulosum))(测试菌株)。
研究中还包括两种痤疮丙酸杆菌菌株(DSM 30738和30753),其特征未知,尽管它们与本发明的菌株DSM 28251属于同一种属。
测试的菌株(皮肤细菌属)
NA*:未分配。种系型分类仅适用于痤疮丙酸杆菌菌株。
NAv*:不可用。
皮肤的病原体微生物
已经测试了上述六种皮肤细菌菌株对以下五种微生物的抑制活性,这五种微生物是众所周知的和广泛代表的皮肤病原体:
-金黄色葡萄球菌ATCC 29213
-金黄色葡萄球菌ATCC BAA-1680
-金黄色葡萄球菌DSM 20491
-表皮葡萄球菌ATCC 12228
-白色念珠菌ATCC 90028
材料和方法
热灭活细菌(皮肤细菌)的制备
测试的皮肤细菌用蒸煮法(tindalization)(分步灭菌法)灭活。
在37℃的温度下,所有的皮肤细菌菌株在具有20%补充物的BHI(脑心浸液)肉汤中生长,直至达到分光光度读数(O.D.600nm)验证的最大指数生长期。随后,通过离心去除培养基,并进行上清液测试。在盐溶液(NaCl 0.9%)中洗涤细菌沉淀物,直至完全除去任何残留的上清液,然后将细菌沉淀物稀释至浓度为0.5McFarland(1.5×10
将滴定过的接种物进行蒸煮灭活。
蒸煮过程包括在80℃加热30分钟以灭活营养形式,然后在37℃孵育24小时以促进未被热处理灭活的剩余营养细胞的萌发(germination),然后将材料再次放回80℃处理30分钟。整个热循环重复3次。将一等分的蒸煮灭活后的材料接种在哥伦比亚血琼脂平板(Columbia Blood Agar)上,并在有氧条件下于37℃孵育24小时,以验证不存在微生物生长和该过程的正确实施。蒸煮灭活后的细菌细胞具有灭活的复制和酶促能力,同时保持它们的细胞结构和细胞壁,因此生理上完整,并且因此具有免疫活性。
使用分光光度法评估热灭活的痤疮丙酸杆菌菌株干扰和/或抑制测试的葡萄球菌菌株和白色念珠菌菌株生长的能力。
使用相同的生长培养基(BHI肉汤,补充20%浓度)通过以下程序测试热灭活的菌株:
将热灭活的细菌预先稀释至最终浓度为10
一式三份,将100μL测试菌株金黄色葡萄球菌
将这些悬浮液用作96孔板孔中的接种物。
准备一式三份的96孔板,每份都有实验对照,即没有任何添加片段的单独的菌株接种物,和用于分光光度校准的“空白”实验(含有每个片段的BHI培养基)。
使用VICTOR Multilabel Plate Reader(珀金埃尔默仪器有限公司)系统测量600nm(O.D.600nm)处的光密度,并将其视为每个菌株和处理在时间零点(T0)的生长值。在孵育期间的2、4、6、8、18、20、22和24小时后进行随后的测量。将O.D.值相对于空白和对照进行标准化,然后进行分析,以评估有/无(CTR)壁片段的不同细菌的生长趋势。结果以平均值±S.D.(标准偏差)报告,生长曲线通过使用适合细菌生长的s形函数的非线性回归分析获得。使用软件GraphPad Prism7.0a版本进行分析。
结果
在存在和不存在(对照)皮肤细菌菌株的热灭活细菌时,皮肤病原微生物的生长曲线如图9所示。第一次AUC定性评估显示,热灭活的痤疮丙酸杆菌DSM 28251对所有测试的皮肤病原微生物的微生物生长具有改善的抑制作用。
下表2a报告了每种衍生物对所有测试的微生物的AUC的定量评估。这些值证实了图9所示的内容,其中从痤疮丙酸杆菌DSM 28251获得的热灭活细菌对所有测试的皮肤微生物的生长显示出显著的影响/抑制活性。
表2a.含有热灭活细菌/不含热灭活细菌(对照)时,如图2所示的生长曲线的曲线下面积(AUC)值和相对标准差(浅蓝色)。每个菌株的色标表示AUC值的范围:从次要(暗红色)至主要(暗绿色)AUC值。
下表2b显示了与对照条件相比生长减少的百分比。这些数据证实了上述结果,突出了热灭活的痤疮丙酸杆菌DSM 28251相对于普通痤疮丙酸杆菌菌株的活性提高。
表2b.相对于对照条件(无热灭活细菌接种物)的生长下降百分比。每个菌株的色标指示了下降的范围:从主要(暗红色)至次要(暗绿色)生长下降(%)。
实施例6
使用痤疮丙酸杆菌所有菌株的后生元/上清液(代替实施例5的热灭活菌株)重复实施例5的对比测试。
比较从实施例5的相同的六种皮肤细菌菌株获得的后生元/上清液对实施例5的皮肤的相同病原微生物的抑制活性。
本研究的目的是评估来自痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251的后生元与来自实施例5的痤疮丙酸杆菌种属的后生元相比,是否对皮肤病原微生物具有改善的抑制活性。
材料和方法
痤疮丙酸杆菌DSM 28251后生元的制备。
将先前从皮肤细菌菌株获得的细菌上清液进行过滤(0.22μm过滤器)以除去任何细胞残留物;通过在哥伦比亚血琼脂上接种并在37℃需氧条件下将待研究的每种上清液的等分试样孵育24小时后没有细菌生长来确认无菌。
为了排除由于某些皮肤杆菌菌株的典型酸性物质产生造成的任何干扰,仔细测量每种上清液的pH值,如有必要,用1M氢氧化钠溶液中和。
采用分光光度法评估后生元对病原微生物生长的活性。
使用分光光度法,评估实施例5中提及的源自痤疮丙酸杆菌菌株的后生元干扰和/或抑制实施例5中报道的相同葡萄球菌菌株和白色念珠菌菌株生长的能力。
使用与实施例5相同的生长培养基(BHI肉汤,补充20%的浓度)通过以下程序测试后生元:
将上清液在BHI肉汤中以1:10的比例稀释,然后与测试的皮肤微生物一起孵育。
一式三份,将100μL皮肤病原微生物金黄色葡萄球菌
将这些悬浮液用作96孔板孔中的接种物。
准备一式三份的96孔板,每份都有实验对照,即单独的菌株接种物,和用于分光光度校准的“空白”实验(含有每个片段的BHI培养基)。
使用VICTOR multilabel Plate Reader(珀金埃尔默仪器有限公司)系统测量600nm(O.D.600nm)处的光密度,并将其视为每种菌株和处理在时间零点(T0)的生长值。在孵育期间的2、4、6、8、18、20、22和24小时后进行随后的测量。将O.D.值相对于空白和对照进行标准化,然后进行分析,以评估有/无(CTR)壁片段的不同细菌的生长趋势。结果以平均值±S.D.(标准偏差)报告,生长曲线通过使用适合细菌生长的s形函数的非线性回归分析获得。使用软件GraphPad Prism7.0a版本进行分析。
结果
在存在和不存在(对照)痤疮丙酸杆菌DSM 28251菌株的后生元时,皮肤病原微生物的生长曲线如图8所示。
对AUC(曲线下面积)的第一次定性评估显示,从痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251获得的后生元(上清液)对大多数测试的病原微生物的微生物生长具有最高的抑制作用。
表1a显示了每种上清液的定量AUC评估。这些值证实了图1中显示的内容。事实上,除了白色念珠菌ATCC 90028(其被DSM 30738衍生物抑制)之外,后生元/上清液痤疮丙酸杆菌DSM 28251比其它测试的上清液更能抑制所有测试的皮肤细菌的生长。
表1a
表1a.含有/不含(对照)细菌上清液时,如图1所示的生长曲线的曲线下面积(AUC)值和相对标准差(浅蓝色)。每种菌株的色标表示AUC值的范围:从次要(暗红色)至主要(暗绿色)AUC值。
由测试的上清液获得的相对于对照条件的生长减少的百分比显示在表1b中。这些数据也证实了迄今为止所讨论的结果,进一步强调了上清液DSM 30738对白色念珠菌ATCC90028菌株的活性仅略高,因此与痤疮丙酸杆菌DSM 28251上清液的活性相当。
表1b.相对于对照条件(无上清液接种物)的生长下降百分比。每种菌株的色标指示了下降的范围:从主要(暗红色)至次要(暗绿色)生长下降(%)。
结果
第一次AUC定性评估显示了痤疮丙酸杆菌DSM 28251的后生元/上清液对所有测试的皮肤病原微生物的微生物生长具有改善的抑制作用。
实施例7
使用所有测试的痤疮丙酸杆菌菌株的细胞壁片段(代替实施例5的热灭活菌株)重复实施例5的对比测试。
测试目的
测试的目的是比较实施例5的相同六种皮肤细菌菌株的壁片段对实施例5的皮肤的相同病原微生物的抑制活性。
本研究的目的是评估来自痤疮丙酸杆菌菌株DSM 28251的壁片段与实施例5的对比痤疮丙酸杆菌种属的细菌壁片段相比是否对皮肤病原微生物具有改善的抑制活性。
材料和方法
痤疮丙酸杆菌DSM 28251菌株和皮肤细菌菌株
在从5到1000ml体积的分批和放大系统中操作培养,并延长直至获得一致的细胞质量(在较高体积的接种物中平均2天)。然后收集获得的细菌沉淀物,并进行标准化程序以获得目标壁片段,如下所述。在下文中,分离片段将用衍生菌株的编目代码来指代。
具体地,壁片段的分离已经如下所述进行。
随后使用有机溶剂(即乙醚-乙醇、氯仿、甲醇-氯仿、其混合物)溶剂通过索氏处理对细菌沉淀物进行去脂程序;然后在通风柜层流下干燥。干燥后,通过两步Ultratturrax处理(每一步20秒至10min),加入蒸馏水(以1:2p/V的比例),将颗粒均化。离心后,将上清液在80℃加热,然后在冷水下(优选在3-15℃下)冷却,最后在冰上冷却。随后,在4℃下,与15-40%v/v冷硫酸铵一起孵育24小时进行片段沉淀步骤。孵育后,将悬浮液离心,收集沉淀的片段并冻干。
冻干的样本最终通过ad-hoc多步骤程序进行灭菌(-80℃超冷冻,80℃过热,1小时U.V.灭菌)。
最后,它们被用来设置实验,如下所述。
使用分光光度法,评估源自痤疮丙酸杆菌菌株(见上文)的壁片段干扰和/或抑制实施例5中报道的相同葡萄球菌菌株和白色念珠菌菌株生长的活性。
使用与实施例5相同的生长培养基(BHI肉汤,补充20%浓度),通过以下程序测试壁片段:
将壁碎片制成粉末,并在BHI生长培养基中乳化,最终浓度为10mg/ml。将100μl等份加入96孔平底平板的孔中。
一式三份,将100μl皮肤病原微生物金黄色葡萄球菌
将这些悬浮液用作96孔板孔中的接种物。
准备一式三份的96孔板,每份都有实验对照,即没有任何添加片段的单独的菌株接种物,和用于分光光度校准的“空白”实验(含有每个片段的BHI培养基)。
使用VICTOR Multilabel Plate Reader(珀金埃尔默仪器有限公司)系统测量600nm(O.D.600nm)处的光密度,并将其视为每种菌株和处理在时间零点(T0)的生长值。在孵育期间的2、4、6、8、18、20、22和24小时后进行随后的测量。将O.D.值相对于空白和对照进行标准化,然后进行分析,以评估有/无(CTR)壁片段的不同细菌的生长趋势。结果以平均值±S.D.(标准偏差)报告,生长曲线通过使用适合细菌生长的s形函数的非线性回归分析获得。使用软件GraphPad Prism7.0a版本进行分析。
结果(
在含有和不含(CTR)各种测试的壁片段的情况下,培养的皮肤细菌的生长曲线显示在图10中。基于对“曲线下面积”(AUC)参数的初步定性评估,强调了对于大多数测试的皮肤细菌,片段DSM 28251如何对微生物生长产生最高的抑制作用。
相反,在下表3a中,报告了对所有测试的皮肤细菌的相同AUC参数的定量评估结果。计算的AUC值证实了通过定性评估形成的假设。细菌细胞壁片段DSM 28251显示出比其它测试片段对细菌生长具有更高的抑制作用。
深入至生长抑制的评估,表3b中所示的值代表相对于每种菌株的对照条件的生长减少的百分比(%),其被认为是在特定实验条件下生长速率的100%。生长百分比减少的比较与上面讨论的关于菌株DSM 28251的片段的更高抑制效果的结论一致。
尽管从痤疮丙酸杆菌DSM 30738菌株获得的片段与DSM 28251片段相比显示出接近的抑制值,但后者的抑制百分比总是更高,对金黄色葡萄球菌ATCC BAA-1680菌株也具有更好的性能(DSM 30738的82.43%vs DSM 28251的94.95%)。
表3a.含有细菌壁片段/不含细菌壁片段(对照)时,如图3所示的生长曲线的曲线下面积(AUC)值和相对标准差(浅蓝色)。每种菌株的色标表示AUC值的范围:从次要(暗红色)至主要(暗绿色)AUC值。
表3b.相对于对照条件(不含片段接种物)的生长下降百分比。每种菌株的色标指示了下降的范围:从主要(暗红色)到次要(暗绿色)生长下降(%)。
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<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬菌体正向引物
<400> 9
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<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬菌体反向引物
<400> 10
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- 新颖颗粒丙酸杆菌菌株及包含该菌株或其培养物的用于预防或治疗痤疮的组合物
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