2H-苯并b1,4恶嗪-3(4H）-酮衍生物

技术领域

本发明涉及药物化学领域，具体涉及新型2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物和2H- 苯并[b][1,4]噻嗪-3(4H)-酮衍生物类化合物、异构体、及其药物组合物在制备治疗和预防中的用途，尤其在疼痛、炎性疾病、神经退行性疾病等的治疗中的用途。

背景技术

疼痛作为第五大生命体征，是临床上最常见、最困扰患者的症状，是影响生活质量和致残的重要因素，也是最重要的未满足的医疗需求之一。受限于现有镇痛药物的有限疗效和不良反应，美国疼痛协会统计约75％的患者未能得到有效的疼痛治疗。在多模式镇痛指导下，阿片类药物(Opioid)在中到重度疼痛，尤其是术后镇痛中广泛应用。但因其显著的不良反应如恶心，呕吐，便秘，尿储留和呼吸抑制等以及耐受性限制了临床使用，同时较强的成瘾性受到使用限制。因此，临床对于具有相似镇痛活性同时降低不良反应的新型镇痛药物具有较大需求。

广泛研究中积累的证据表明，人体内广泛分布的大麻素受体(cannabinoidreceptors) 参与内源性大麻素系统介导的中枢及外周镇痛，以及抗炎等调节。大麻素受体包含大麻素 CB1受体(主要分布在中枢，低水平表达在外周神经元末端)和大麻素CB2受体(主要表达在外周循环免疫细胞)。CB1和CB2受体激动剂已被证实能够参与急、慢性疼痛抑制，且缺乏典型的躯体依赖症状。其中CB1受体主要在中枢分布，承担了大麻类化合物的精神活性，早期针对CB1受体开发的激动剂和拮抗剂均受到精神不良反应的限制，现研发方向已转向开发选择性CB2受体激动剂，在保留有效镇痛活性的同时，能够避免CB1受体介导的精神类副作用。广泛研究已证实，CB2受体选择性激动剂在临床前神经性疼痛，炎症性疼痛和急性疼痛等多种动物疼痛模型中具有显著的镇痛作用，且未观察到CB1受体相关的CNS不良反应，是潜在的低毒高效的新型镇痛药物。

因此，本发明在已有国内外研究基础上，力求开发出新型结构的CB2受体选择性激动剂，具有很好镇痛效果、毒副作用小，为临床应用提供更好的药物。

发明内容

本发明涉及一类新型2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物及2H-苯并[b][1,4]噻嗪 -3(4H)-酮衍生物类化合物作为大麻素受体的选择性激动剂，特别是涉及一类新型2H-苯并 [b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物及2H-苯并[b][1,4]噻嗪-3(4H)-酮衍生物类化合物和在医药上的应用，特别是如下通式(I)所示的2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物及2H-苯并[b][1,4] 噻嗪-3(4H)-酮衍生物类化合物及其在制备治疗或预防疼痛、炎性疾病、神经退行性疾病药物中的用途，具体而言，在制备治疗或预防疼痛药物中的用途，更具体而言，在用于制备治疗或预防神经性疼痛，炎症性疼痛和疼痛药物中的用途，再具体而言，在制备治疗或预防中度至重度疼痛药物中的用途。

本发明的一个目的在于，提供了如下通式(I)所示结构的2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H) -酮衍生物及2H-苯并[b][1,4]噻嗪-3(4H)-酮衍生物类化合物：

或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、水合物、溶剂化合物、代谢产物，

其中：

A选自N或C；

B选自N或C；

E选自N或C；

D选自O或S；

Y选自O或S；

F选自取代或未取代的C

R

R

优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自N或C；

B选自N或C；

E选自N或C；

D选自O或S；

Y选自O或S；

F选自取代或未取代的C

R

R

更优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自C；

B选自C；

E选自C；

D选自O或S；

Y选自O；

F选自取代或未取代的C

R

R

进一步优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自C；

B选自C；

E选自C；

D选自O或S；

Y选自O；

F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

R

R

进一步更优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自C；

B选自C；

E选自C；

D选自O或S；

Y选自O；

F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

R

R

再进一步优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自C；

B选自C；

E选自C；

D选自O或S；

Y选自O；

F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

R

R

再进一步更优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自C；

B选自C；

E选自C；

D选自O或S；

Y选自O；

F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

R

R

最优选的，本发明通式(I)所示化合物中：

A选自C；

B选自C；

E选自C；

D选自O或S；

Y选自O；

F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

R

R

本发明通式(I)所示的2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物及2H-苯并[b][1,4]噻嗪 -3(4H)-酮衍生物类化合物中，优选化合物包括，但不限于化合物：

进一步，本发明通式(I)所示的2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮衍生物及2H-苯并[b][1,4] 噻嗪-3(4H)-酮衍生物类化合物中，优选化合物包括，但不限于化合物：

本发明的另一目的在于，提供了制备上述式(I)化合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

化合物II和Ⅲ发生取代反应生成中间体Ⅳ，中间体Ⅳ与有机硼酸(Ⅴ)或有机硼酸酯 (VI)反应，制得化合物I。

其中，X为Br或Cl，Z为Br或Cl或MsO；

其中所述原料中A选自N或C；B选自N或C；E选自N或C；D选自O或S；Y选自O或S；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

进一步的，A选自C；B选自C；E选自C；D选自O或S；Y选自O；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

再进一步的，A选自C；B选自C；E选自C；D选自O或S；Y选自O；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

更进一步的，A选自C；B选自C；E选自C；D选自O或S；Y选自O；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

本发明的又一目的在于，提供了上述通式(I)所示化合物在制备选择性CB2受体激动剂药物的用途，具体而言是作为制备镇痛药物中的用途，更具体而言提供了上述通式(I)所示化合物作为制备适用于中度至重度疼痛药物中的用途。通过对CB1、CB2的体外作用试验，本发明化合物显示出了优异的CB2选择性和激动活性；通过对小鼠醋酸扭体模型的影响的药效试验，本发明化合物显示出了较好的镇痛作用；通过对正常大鼠药代动力学的研究试验，本发明化合物显示出了优异的药动学特征。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

化合物的结构是通过质谱(MS)或核磁共振(

核磁共振(

质谱(MS)的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Therm，型号：FinniganLCQ advantage MAX)进行。

薄层硅胶使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板。

柱层析一般使用烟台黄海硅胶200-300目硅胶为载体。

在本发明未给出特殊说明的情况下，本发明中所提及的反应均在N

在本发明的术语，“N

在本发明未给出特殊说明的情况下，本发明反应中提及的溶液是水溶液。

在本发明的术语“室温”是指温度处于10℃-25℃之间。

在一个实施方式中，本发明涉及具有如下通式(I)所示结构2H-苯并[b][1,4] 恶嗪-3(4H)-酮衍生物和2H-苯并[b][1,4]噻嗪-3(4H)-酮衍生物类化合物：

或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、水合物、溶剂化合物、代谢产物，

其中：A选自C；B选自C；E选自C；D选自O或S；Y选自O；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

优选的实施方式中，

A选自C；B选自C；E选自C；D选自O或S；Y选自O；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

更优选的实施方式中，

R

最优选的实施方式中，

A选自C；B选自C；E选自C；D选自O或S；Y选自O；F选自取代或未取代的乙基、取代或未取代的C

实施例

实施例1化合物1的制备

制备方案如下图式所示：

第一步：1c的制备

将6-溴-2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮1a(2.00g，8.77mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(30ml)中，冰水浴下缓慢分批加入氢化钠(1.05g，26.31mmol)，保持冰水浴下搅拌10分钟后再向反应体系中缓慢加入4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐1b(1.96g,10.52mmol)。加毕后升温至90℃反应。待反应完全，反应液降至室温后缓慢倒入冰水中淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后用水、饱和食盐水各洗涤1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液浓缩，得到黄色油状物。将黄色油状物进行硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝ 5/1—2/1)得到化合物1c(2.20g，类白色固体)，收率73.5％。

MS m/z(ES):341.1[M+1]

第二步：化合物1的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，1d(218mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):423.2[M+1]

实施例2化合物2的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物2的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，2d(218mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):423.2[M+1]

实施例3化合物3的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物3的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，3d(202mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):407.1[M+1]

实施例4化合物4的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物4的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，4d(191mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):397.2[M+1]

实施例5化合物5的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物5的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，5d(182mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):389.2[M+1]

实施例6化合物6的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物6的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，6d(214mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):419.2[M+1]

实施例7化合物7的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步

第二步：化合物7的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，7d(182mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):389.2[M+1]

实施例8化合物8的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物8的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，8d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):390.2[M+1]

实施例9化合物9的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物9的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，9d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol) 溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):390.2[M+1]

实施例10化合物10的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物10的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，10d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):390.2[M+1]

实施例11化合物11的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物11的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，11d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):390.2[M+1]

实施例12化合物12的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物12的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，12d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):390.2[M+1]

实施例13化合物13的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物13的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，13d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N2保护下加入Pd(dppf)Cl

MS m/z(ES):390.2[M+1]

实施例14化合物14的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物14的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，14d(202mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N2保护下加入Pd(dppf)Cl

MS m/z(ES):408.2[M+1]

实施例15化合物15的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物15的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，15d(202mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N2保护下加入Pd(dppf)Cl

MS m/z(ES):408.2[M+1]

实施例16化合物16的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物16的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，16d(172mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N2保护下加入Pd(dppf)Cl

MS m/z(ES):408.2[M+1]

实施例17化合物17的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例1第一步；

第二步：化合物17的制备

将化合物1c(300mg，0.88mmol)，17d(242mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):445.2[M+1]

实施例18化合物18的制备

制备方案如下图式所示：

第一步：18c的制备

将6-溴-2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮1a(2.00g，8.77mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(30ml)中，冰水浴下缓慢分批加入氢化钠(1.05g，26.31mmol)，保持冰水浴下搅拌10分钟后再向反应体系中缓慢加入4-(2-氯乙基)-3-甲基吗啉盐酸盐18b(2.11g, 10.52mmol)。加毕后升温至90℃反应。待反应完全，反应液降至室温后缓慢倒入冰水中淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后用水、饱和食盐水各洗涤1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液浓缩，得到黄色油状物。将黄色油状物进行硅胶柱层析纯化(石油醚/ 乙酸乙酯＝5/1—2/1)得到化合物18c(2.17g，类白色固体)，收率69.5％。

MS m/z(ES):355.1[M+1]

第二步：化合物18的制备

将化合物18c(313mg，0.88mmol)，2d(218mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):437.2[M+1]

实施例19化合物19的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例18第一步；

第二步：化合物19的制备

将化合物18c(313mg，0.88mmol)，13d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):404.2[M+1]

实施例20化合物20的制备

制备方案如下图式所示：

第一步同实施例18第一步；

第二步：化合物20的制备

将化合物18c(313mg，0.88mmol)，11d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):404.2[M+1]

实施例21化合物21的制备

制备方案如下图式所示：

第一步：21c的制备

将6-溴-2H-苯并[b][1,4]恶嗪-3(4H)-酮1a(2.00g，8.77mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(30ml)中，冰水浴下缓慢分批加入氢化钠(1.05g，26.31mmol)，保持冰水浴下搅拌10分钟后再向反应体系中缓慢加入4-(2-氯乙基)-3-甲氧甲基吗啉盐酸盐21b(2.42g,10.52mmol)。加毕后升温至90℃反应。待反应完全，反应液降至室温后缓慢倒入冰水中淬灭反应，乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后用水、饱和食盐水各洗涤1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液浓缩，得到黄色油状物。将黄色油状物进行硅胶柱层析纯化(石油醚/ 乙酸乙酯＝5/1—2/1)得到化合物21c(2.29g，类白色固体)，收率67.8％。

MS m/z(ES):385.1[M+1]

第二步：化合物21的制备

将化合物21c(339mg，0.88mmol)，11d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N

MS m/z(ES):434.2[M+1]

实施例22化合物22的制备

制备方案如下图式所示：

第一步：22c的制备

将5-溴-2-氟硝基苯22a(2.00g，9.08mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，随后依次向反应体系中加入碳酸钾(3.13g，22.68mmol)和巯基乙酸22b(1.00g，10.86 mmol)，室温搅拌过夜。待反应完全，加水溶解反应体系，用乙酸乙酯萃取3次，水相用稀盐酸(2M)调节pH至6，吸出大量固体，抽滤，干燥滤饼，得到化合物22c(2.60g，黄色固体)，收率98.1％。

MS m/z(ES):291.9[M+1]

第二步：22d的制备

将化合物22c(2.60g，8.90mmol)溶于氨水(25mL)中，室温搅拌下缓慢滴加七水合硫酸亚铁(24.75g，89.04mmol)的水(40mL)溶液。反应完毕，抽滤，滤液用乙酸乙酯萃取三遍，有机相合并后用水、饱和食盐水各洗涤1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液浓缩后得到化合物22d(1.78g，黄色固体)，收率81.9％。

MS m/z(ES):243.9[M+1]

第三步：22f的制备

将化合物22d(1.00g，4.10mmol)溶于N，N-二甲基甲酰胺(15mL)中，冰水浴下缓慢分批加入氢化钠(0.49g，12.30mmol)，保持冰水浴下搅拌10分钟后再向反应体系中缓慢加入4-(2-氯乙基)吗啉盐酸盐22e(1.13g，,6.07mmol)。加毕后升温至90℃反应。待反应完全，反应液降至室温后缓慢倒入冰水中淬灭反应，用乙酸乙酯萃取3次，有机相合并后用水、饱和食盐水各洗涤1次，用无水硫酸钠干燥，抽滤，将滤液浓缩，得到黄色油状物。将黄色油状物进行硅胶柱层析纯化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1—3/1)得到化合物22f(1.05g，黄色固体)，收率72.1％。

MS m/z(ES):357.0[M+1]

第四步：化合物22的制备

将化合物22f(300mg，0.84mmol)，13d(183mg，1.06mmol)和CsF(267mg，1.76 mmol)溶于1,4-二氧六环(5mL)和水(0.5mL)的混合溶液中，N2保护下加入Pd(dppf)Cl

MS m/z(ES):406.2[M+1]

药理毒理试验评价

受试药：

实施例1化合物：实施例1制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：99.25％；

实施例2化合物：实施例2制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：99.25％；

实施例3化合物：实施例3制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：99.55％；

实施例4化合物：实施例4制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：99.33％；

实施例5化合物：实施例5制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：99.73％；

实施例6化合物：实施例6制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，白色固体，纯度：99.82％；

实施例7化合物：实施例7制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，白色固体，纯度：99.56％；

实施例8化合物：实施例8制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：99.31％；

实施例9化合物：实施例9制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：97.74％；

实施例10化合物：实施例10制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：97.79％；

实施例11化合物：实施例11制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：99.01％；

实施例12化合物：实施例12制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，褐色固体，纯度：97.57％；

实施例13化合物：实施例13制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：99.34％；

实施例14化合物：实施例14制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，淡黄色固体，纯度：97.11％；

实施例15化合物：实施例15制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：98.12％；

实施例16化合物：实施例16制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄绿色固体，纯度：96.68％；

实施例17化合物：实施例17制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：98.54％；

实施例18化合物：实施例18制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，类白色固体，纯度：96.39％；

实施例19化合物：实施例19制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：96.50％；

实施例20化合物：实施例20制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，淡黄色固体，纯度：91.21％；

实施例21化合物：实施例21制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，淡黄色固体，纯度：92.01％；

实施例22化合物：实施例22制备，由成都苑东生物制药股份有限公司合成研究室提供，黄色固体，纯度：95.03％。

实验例1式(I)各实施例化合物对不同受体活性作用的体外试验

1、试验目的：利用Flp-In-CHO-CB1、Flp-In-CHO-CB2细胞株，应用已经建立的cAMPassay 检测平台，对各实施例化合物样品的CB1、CB2激动活性进行检测。

2试验方法：

2.1细胞培养及试剂配制

a.细胞株：Flp-In-CHO-CB1(用于CB1激动活性的检测)、Flp-In-CHO-CB2(用于CB2激动活性的检测)

b.完全培养基:Ham's F12K+10％胎牛血清+1*青霉素链霉素+800μg/ml潮霉素

c.实验缓冲液:1*HBSS+20mM HEPES+0.1％BSA+500μM IBMX

2.2待测化合物对CB1受体活性测定

2.2.1细胞培养和种板

a.将Flp-In-CHO-CB1细胞株培养于37℃,5％CO

b.TrypLE消化处理后将细胞重悬于完全培养基中，种到384细胞培养板中，接种密度 8000每孔。

c.细胞于37℃,5％CO

2.2.2激动活性的检测

a.准备实验buffer:1*HBSS，0.1％BSA，20mM HEPES及500μM IBMX。

b.将化合物用buffer稀释，稀释起始浓度80μM，3倍浓度梯度稀释，共10个浓度。

c.去掉384板子中的培养基，每孔加入15μl的buffer(CB2活性检测省略此步)。

d.每孔加入2.5μl的化合物，37℃培养10分钟。

e.用实验缓冲液将forskolin稀释至8μM(8*)(CB2活性检测稀释至16μM)。

f.加入2.5μl稀释好的8*forskolin，于37℃孵育30分钟。

g.冻融Eu-cAMP tracer和Ulight-anti-cAMP，用cAMP detection buffer稀释。

h.加入10μl Eu-cAMP tracer至实验孔，然后加入10μl Ulight-anti-cAMP至实验孔中。

i.将反应板于室温200g离心30s，25℃静置1h后，利用Envision收集数据

2.3数据分析

a.Z’factor＝1-3*(SDMax+SDMin)/(MeanMax-MeanMin)；

b.CVMax＝(SDMax/MeanMax)*100％；

c.CVMin＝(SDMin/MeanMin)*100％；

d.S/B＝Singal/Background；

e.利用GraphPad非线性拟合公式计算化合物EC

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)*HillSlope))

X:化合物浓度log值；Y:Activation％

3、试验结果

表1各实施例化合物对CB1、CB2的激动活性作用

4、结论

本发明实验例各化合物对CB1的激动作用均明显弱于各化合物对CB2的激动作用，具有较好的选择性。

实验例2式(I)各实施例化合物对小鼠醋酸扭体镇痛作用试验

1、试验目的：利用小鼠醋酸扭体试验方法，测量各实施例化合物样品对小鼠醋酸扭体的镇痛作用。

2、试验方法：

(1)给药剂量及途径：

以1mg/kg剂量，腹腔注射给药，给药体积10mL/kg，给药浓度0.1mg/mL。

(2)操作方法：

试验在室温为23-25℃的安静环境中进行。小鼠(KM小鼠，SPF级，体重18～22g，购自于成都达硕生物科技有限公司)给药前编号(每组10只)并放入对应编号的鼠笼中适应15min。适应完成后，小鼠腹腔注射给药，给药剂量为1mg/kg，给药体积10mL/kg，阴性对照组给予相同体积相同浓度的溶媒(DMSO)。给药后10min，小鼠腹腔注射0.8％醋酸溶液10ml/kg，立即置于鼠笼中，观察小鼠15min内的扭体次数。扭体的指标为：当小鼠出现典型的腹部内凹，同时伴有躯干扭曲，臀部抬高以及后肢伸长等特征性反应时，认为是一次扭体的发生。

(3)检测指标及统计方法：

检测指标为小鼠给予1mg/kg的药物并给予醋酸溶液后，15min内的扭体次数。计算给药后的镇痛率(％)，其计算公式如下：镇痛率(％)＝(阴性对照组扭体次数-给药组扭体次数)/阴性对照组扭体次数×100％

3、试验结果

表2各化合物给药后的镇痛率(％)

本实验例各化合物对小鼠醋酸扭体均有较好的抑制作用，显示各化合物均有较好的镇痛作用。其中，实施例5、实施例7、实施例10、实施例13抑制作用达到90％以上，表现出良好的镇痛作用。

实验例3式(I)各实施例化合物单次静脉注射后的药代动力学试验

1、试验目的：考察单次静脉给药后各实验例化合物的药代动力学参数。

2、试验方法

(1)试验动物及给药

SD大鼠，SPF级，全雄性，体重180-220g，由成都达硕生物科技有限公司提供。称取各化合物约5mg用100μLDMSO溶解后加入生理盐水配制成0.25mg/mL的溶液。给药方式为尾静脉注射给药，给药体积4mL/kg，给药浓度0.25mg/mL，给药剂量1mg/kg。

(2)采血点设计：

在给药前、给药后5min、15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、6h、8h、24h，从颈静脉取血，每个时间点取200μL全血，置于含有EDTA-K

(3)样品检测

通过建立可靠的LC/MS/MS分析方法，检测各个样品的血药浓度，并计算各化合物的药代动力学参数。

3、试验结果

表3单次尾静脉注射给药主要药代动力学参数(n＝3)

实施例1、实施例2、实施例3、实施例5、实施例6、实施例7、实施例11、实施例 14、实施例17的T

根据上述结果表明本发明实施例化合物显示出镇痛作用，对于本领域的普通技术人员而言明显的是在不偏离本发明的精神或者范围，可对本发明化合物、组合物以及方法进行的多种修饰和变化，因此，本发明包含对本发明的修饰和变化，只要在权利要求和其等同的范围内。