一种微藻菌细胞总RNA的提取方法

技术领域

本发明涉及微藻细胞提取RNA技术领域，具体为一种微藻菌细胞总 RNA的提取方法。

背景技术

海洋里的微藻是一类结构简单的植物，个体非常小，喜欢随着海水自 由漂荡。微藻一般含有叶绿体，因而可以进行光合作用，制造丰富的有机 物，释放氧气，让海洋生态系统有序运行，是指那些在显微镜下才能辨别 其形态的微小的藻类群体。微藻通常是指含有叶绿素a并能进行光合作用 的微生物的总称，属于原生生物的一种。应用生物技术进行大量培养或生 产的微藻分属于4个藻门：蓝藻门、绿藻门、金藻门和红藻门。

核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，存在于生物细胞以 及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键 缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。 RNA的碱基主要有4种，即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U (尿嘧啶)，其中，U(尿嘧啶)取代了DNA中的T(胸腺嘧啶)。核糖 核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。

现有技术存在以下缺陷或问题：

1、现有的微藻菌细胞总RNA的提取方法,大多取纯度较差的藻体进行 提取，RNA提取后品质较差；

2、现有的微藻菌细胞总RNA的提取方法，微藻浓缩液制备浓缩率较 差，无法满足后续提取所需，且制备过程中易产生二氧化碳，对环境造成 污染；

3、现有的微藻菌细胞总RNA的提取方法，提取流程繁琐，周期较 长。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足之处，提供一种微藻菌细胞总 RNA的提取方法，以解决背景技术中所提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：包括如下步骤：

步骤一：取直径较细的玻璃管，在火焰上进行加热处理，加热完成的 玻璃管，快速拉成口径极细的微吸管；

步骤二：将稀释适度的藻液水样，置放在凹载玻片上，进行镜检；

步骤三：通过微吸管挑选需要分离的藻体，放在另一块玻片上，进行 镜检，待镜检合格后，移入经灭菌处理的培养液中培养，待分离出的少量 细胞扩大培养到200mL的培养量时，将分离而得的藻种用青霉素处理后， 即可得到较纯藻种；

步骤四：将含有较纯藻种的藻液由培养池引入至浓缩池中；

步骤五：首先将氢氧化钠导入至浓缩池中，随后将碳酸钠导入至浓缩 池中，进行搅拌，随后完成静置，将制备而成的微藻浓缩液由浓缩池底部 移出；

步骤六：将4-10mL藻液浓缩收集的微藻细胞导入至10mL离心管中；

步骤七：将0.6-1.2mL植物RNA提取辅助液以及0.5-1.0g石英砂导 入至离心管中，随后进行振荡操作；

步骤八：振荡完成后，将离心管置放入离心机中，进行离心处理，以 此制得上清液，完成收集；

步骤九：将上清液导入至2mL离心管中，随后加入1mL的Trizol后 进行混匀处理，静置后加入200-250μL氯仿，进行剧烈振荡；

步骤十：待溶液充分乳化后，再次进行离心处理，将上清液转移至一 组新的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后进行冰浴处理；

步骤十一：用1mL75％的乙醇悬浮沉淀后，进行离心处理，处理完成 后弃上清，再次进行短暂离心，沉淀于室温下晾干；

步骤十二：随后加入30-50μLDEPC处理的水溶解RNA。

作为本发明的优选技术方案，所述玻璃管取直径为5毫米玻管。

作为本发明的优选技术方案，所述镜检过程中，检测由微吸管导入的 液体，检测液体是否能够达到纯分离的要求，该过程可重复进行多次，直 至达到分离目的。

作为本发明的优选技术方案，所述氢氧化钠对藻液PH值进行调节， 其PH值控制在8-10，所述碳酸钠浓度控制在20-35mmol，搅拌过程持续 2-3min，所述浓缩池内藻液静置时间控制在45min。

作为本发明的优选技术方案，所述石英砂取0.8g且颗粒大小控制在 10目，所述振荡操作持续4-6min。

作为本发明的优选技术方案，所述离心处理转速控制在12000- 14000rpm，时间为1min。

作为本发明的优选技术方案，所述静置时间控制在5min，且室温需 控制在20-25摄氏度。

作为本发明的优选技术方案，所述离心处理转速控制在10000- 12000rpm，时间为1min，所述冰浴处理时间控制在10-20min。

作为本发明的优选技术方案，初次离心处理转速控制在10000- 12000rpm，时间为1min，弃上清后二次离心处理转速控制在5000- 7000rpm，时间为0.5min，所述沉淀过程持续10min，且室温控制在20- 25摄氏度。

与现有技术相比，本发明提供了一种微藻菌细胞总RNA的提取方法， 具备以下有益效果：

1、该一种微藻菌细胞总RNA的提取方法，通过在提取过程中，对微 藻细胞进行提纯处理，通过微吸管吸取藻体水样，进行多次重复的镜检， 确保藻体的纯度，使得后续RNA提取纯度更好，品质得以保障；

2、该一种微藻菌细胞总RNA的提取方法，通过在藻液中添加氢氧化 钠以及碳酸钠，利用氢氧化钠和碳酸钠使微藻细胞与生成的不溶性盐一起 发生共沉淀,通过短时间的静置便可使微藻得到充分的浓缩和分离。添加 的碳酸钠可以通过氢氧化钠吸收废气中的二氧化碳来实现,减少了温室气 体二氧化碳的排放，以上述内容制得的藻液浓缩液浓缩率高，能够满足后 续制备所需；

3、该一种微藻菌细胞总RNA的提取方法，通过Trizol提取方法，完 成对微藻菌细胞进行提取，且在其内部添加植物RNA提取辅助液以及石英 砂，引入石英砂对微藻进行振荡研磨,代替了微藻的液氮研磨,使得微藻 RNA提取时对微藻菌体量的需求大大降低,并且简化了实验操作,降低了研 磨耗时，能够有效提升提取效率以及品质。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、 完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是 全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出 创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一，一种微藻菌细胞总RNA的提取方法，其特征在于：包括如 下步骤：

步骤一：取直径较细的玻璃管，在火焰上进行加热处理，加热完成的 玻璃管，快速拉成口径极细的微吸管；

步骤二：将稀释适度的藻液水样，置放在凹载玻片上，进行镜检；

步骤三：通过微吸管挑选需要分离的藻体，放在另一块玻片上，进行 镜检，待镜检合格后，移入经灭菌处理的培养液中培养，待分离出的少量 细胞扩大培养到200mL的培养量时，将分离而得的藻种用青霉素处理后， 即可得到较纯藻种；

步骤四：将含有较纯藻种的藻液由培养池引入至浓缩池中；

步骤五：首先将氢氧化钠导入至浓缩池中，随后将碳酸钠导入至浓缩 池中，进行搅拌，随后完成静置，将制备而成的微藻浓缩液由浓缩池底部 移出；

步骤六：将6mL藻液浓缩收集的微藻细胞导入至10mL离心管中；

步骤七：将0.6mL植物RNA提取辅助液以及0.5g石英砂导入至离心 管中，随后进行振荡操作；

步骤八：振荡完成后，将离心管置放入离心机中，进行离心处理，以 此制得上清液，完成收集；

步骤九：将上清液导入至2mL离心管中，随后加入1mL的Trizol后 进行混匀处理，静置后加入200μL氯仿，进行剧烈振荡；

步骤十：待溶液充分乳化后，再次进行离心处理，将上清液转移至一 组新的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后进行冰浴处理；

步骤十一：用1mL75％的乙醇悬浮沉淀后，进行离心处理，处理完成 后弃上清，再次进行短暂离心，沉淀于室温下晾干；

步骤十二：随后加入30μLDEPC处理的水溶解RNA。

需要注意的是：玻璃管取直径为5毫米玻管；镜检过程中，检测由微 吸管导入的液体，检测液体是否能够达到纯分离的要求，该过程可重复进 行多次，直至达到分离目的；氢氧化钠对藻液PH值进行调节，其PH值控 制在8，碳酸钠浓度控制在20mmol，搅拌过程持续2min，浓缩池内藻液 静置时间控制在45min；石英砂取0.8g且颗粒大小控制在10目，振荡操作持续4min；离心处理转速控制在12000rpm，时间为1min；静置时间控 制在5min，且室温需控制在20摄氏度；离心处理转速控制在10000rpm， 时间为1min，冰浴处理时间控制在10min；初次离心处理转速控制在 10000rpm，时间为1min，弃上清后二次离心处理转速控制在5000rpm，时 间为0.5min，沉淀过程持续10min，且室温控制在20摄氏度。

实施例二，一种微藻菌细胞总RNA的提取方法，其特征在于：包括如 下步骤：

步骤一：取直径较细的玻璃管，在火焰上进行加热处理，加热完成的 玻璃管，快速拉成口径极细的微吸管；

步骤二：将稀释适度的藻液水样，置放在凹载玻片上，进行镜检；

步骤三：通过微吸管挑选需要分离的藻体，放在另一块玻片上，进行 镜检，待镜检合格后，移入经灭菌处理的培养液中培养，待分离出的少量 细胞扩大培养到200mL的培养量时，将分离而得的藻种用青霉素处理后， 即可得到较纯藻种；

步骤四：将含有较纯藻种的藻液由培养池引入至浓缩池中；

步骤五：首先将氢氧化钠导入至浓缩池中，随后将碳酸钠导入至浓缩 池中，进行搅拌，随后完成静置，将制备而成的微藻浓缩液由浓缩池底部 移出；

步骤六：将10mL藻液浓缩收集的微藻细胞导入至10mL离心管中；

步骤七：将1.2mL植物RNA提取辅助液以及1.0g石英砂导入至离心 管中，随后进行振荡操作；

步骤八：振荡完成后，将离心管置放入离心机中，进行离心处理，以 此制得上清液，完成收集；

步骤九：将上清液导入至2mL离心管中，随后加入1mL的Trizol后 进行混匀处理，静置后加入250μL氯仿，进行剧烈振荡；

步骤十：待溶液充分乳化后，再次进行离心处理，将上清液转移至一 组新的2mL离心管中，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后进行冰浴处理；

步骤十一：用1mL75％的乙醇悬浮沉淀后，进行离心处理，处理完成 后弃上清，再次进行短暂离心，沉淀于室温下晾干；

步骤十二：随后加入50μLDEPC处理的水溶解RNA。

需要注意的是：玻璃管取直径为5毫米玻管；镜检过程中，检测由微 吸管导入的液体，检测液体是否能够达到纯分离的要求，该过程可重复进 行多次，直至达到分离目的；氢氧化钠对藻液PH值进行调节，其PH值控 制在10，碳酸钠浓度控制在35mmol，搅拌过程持续3min，浓缩池内藻液 静置时间控制在45min；石英砂取1.0g且颗粒大小控制在10目，振荡操作持续6min；离心处理转速控制在14000rpm，时间为1min；静置时间控 制在5min，且室温需控制在25摄氏度；离心处理转速控制在12000rpm， 时间为1min，冰浴处理时间控制在20min；初次离心处理转速控制在 12000rpm，时间为1min，弃上清后二次离心处理转速控制在7000rpm，时 间为0.5min，沉淀过程持续10min，且室温控制在25摄氏度。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于 限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领 域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修 改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之 内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围 之内。