一种提高赖氨酸发酵转化率的方法

技术领域

本发明涉及发酵工程领域，具体地说，涉及一种提高赖氨酸发酵转化率的方法。

背景技术

L-赖氨酸是一种碱性氨基酸，是仅次于谷氨酸的第二大氨基酸产品，是谷物蛋白的第一限制性氨基酸，在谷物食料中添加适量的赖氨酸，可使其蛋白质的生物价值大大提高。

赖氨酸的应用很广，作为食品强化剂，作为药品可用作肝细胞再生剂，对改善肝功能，治疗肝硬化，高氨症，增进食欲，改善营养状况有明显疗效。作为饲料添加剂在畜、禽类的饲料中添加少许的赖氨酸，对家禽、家畜的日增重，料肉比，家禽的产卵量等方面效果尤为显著。通过微生物发酵方法生产赖氨酸是一种可行方式。

发明内容

本发明的目的是提供一种提高赖氨酸发酵转化率的方法。

本发明构思如下：在大肠杆菌菌体内，葡萄糖经过糖酵解等一系列的酶促反应生成草酰乙酸。草酰乙酸一方面作为三羧酸循环的前体参与细胞供能，另一方面草酰乙酸进一步转化生成L-天冬氨酸，然后经过生物反应生成L-赖氨酸。

赖氨酸的前体物质天冬氨酸与乙酰辅酶A的生成形成平衡合成。丙酮酸转变成乙酰辅酶A，经过丙酮酸脱氢酶在内的多酶复合体作用。

呋喃唑酮能抑制丙酮酸到乙酰辅酶A的酶促过程，阻碍丙酮酸进入三羧酸循环。丙酮酸转变成乙酰辅酶A减弱，排出的二氧化碳下降，进入天冬氨酸方向碳增强，赖氨酸合成增加，转化率升高。

但是，当菌体对数生长期时，添加呋喃唑酮会影响菌体生长，削弱三羧酸循环，虽然对发酵转化率起到了正向影响，但影响到发酵强度的高效实现。发明人通过大量研究发现，呋喃唑酮在发酵过程中通过合理的添加时间，不影响菌体生长，平衡流量分布的优化，是实现高转化率和发酵强度的关键。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供呋喃唑酮在赖氨酸发酵生产中的应用。

第二方面，本发明提供一种提高赖氨酸发酵转化率的方法，微生物发酵过程中，当微生物进入生长稳定期时，向发酵液中添加呋喃唑酮，培养至发酵结束。

所述微生物为具有赖氨酸生产能力的微生物。优选大肠埃希氏菌Escherichiacoli)，更优选大肠埃希氏菌MHZ-0914，保藏编号CGMCC No.22648，可参见CN114875090A。

进一步地，发酵液中添加的呋喃唑酮的浓度为5-10μg/L。

进一步地，所述方法包括以下步骤：

1)一级种子液的制备；

2)二级种子液的制备；

3)发酵培养：将OD

从流加开始直至发酵结束，在温度36-38℃，发酵罐压力0.06-0.08MPa，通气量0.5-0.8vvm，转速300-700rpm，溶氧18-22％，pH7.0-7.2的条件下继续发酵到发酵总周期36h，结束发酵；

其中，流加使用的葡萄糖溶液的浓度为550-650g/L，硫酸铵溶液的浓度为450-550g/L，氨水的浓度为25％-28％，苏氨酸溶液的浓度为3-5g/L。优选地，流加使用的葡萄糖溶液的浓度为600g/L，硫酸铵溶液的浓度为500g/L，氨水的浓度为26％，苏氨酸溶液的浓度为4g/L，呋喃唑酮溶液的浓度为10μg/L。

所述发酵培养基为：葡萄糖19-21g/L、H

用于制备一级种子液、二级种子液的种子培养基为：葡萄糖39-41g/L、KH

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供一种新的赖氨酸发酵生产方法，通过优化培养基配方调控三羧酸循环，平衡菌体生长和产物代谢之间的关系。在优化流量分布的同时，使菌体生长不受影响，以达到更好地提升糖酸转化率的目的。添加呋喃唑酮与不添加呋喃唑酮的发酵方法相比，赖氨酸产量提高了3.6％，糖酸转化率提高了1％。

具体实施方式

本发明提供一种可提升赖氨酸发酵生产转化率的方法，发酵过程中，在微生物进入稳定期时，补加呋喃唑酮，提高碳进入天冬氨酸合成的方向，减少进入三羧酸循环的碳的消耗。

本发明采用如下技术方案：

一方面，通过考察所添加的呋喃唑酮的浓度对发酵指标的影响，确定最佳的添加浓度，实现发酵转化率和发酵强度都有提高。另一方面，考虑呋喃唑酮对菌体生长有影响，选择合适的添加时机使其对发酵有利。

研究发现，如果在发酵开始加入呋喃唑酮，菌体生长变慢，耗糖速率下降，对整体的发酵强度影响较大。说明在长菌体时，需要三羧酸循环给菌体提供能量。当菌体生长到最大值时，开始流加呋喃唑酮，通过降低这个时间段的二氧化碳的排放来提升发酵转化率。减弱三羧酸循环和乙醛酸支路，可以使更多的碳架流转向氨基酸的合成，提高发酵过程中氨基酸产酸水平。

本发明通过优化培养基配方调控三羧酸循环，平衡发酵中后期菌体生长和产物代谢之间的关系，进而进一步提升了发酵生产赖氨酸的转化率。具体通过控制呋喃唑酮的添加时间，控制流加浓度和比例，降低发酵中后期二氧化碳的排放，进而达到提升转化率的目的。

所述赖氨酸发酵菌种进入稳定期的时间为16-20h，呋喃唑酮作为一种流加物，呋喃唑酮溶液的添加量与葡萄糖溶液的添加量的质量比为1％。添加到发酵培养基中直至发酵结束，流加的呋喃唑酮的浓度为5-10μg/L。

通过考察呋喃唑酮添加量对发酵结果的影响，结果发现，当培养基中的呋喃唑酮的浓度为10μg/L时，产酸198g/L，转化率70.2％，理论酸(赖氨酸盐酸盐的总和)6960g，最高OD

此外，分析呋喃唑酮的添加时间对发酵结果的影响。当呋喃唑酮浓度为10μg/L时，按糖流量的比例1％，分别在发酵6h，12h，18h，24h开始流加，结果发现，当18h开始流加，产酸200g/L，转化率70.5％，理论酸7180g，最高OD

优选地，发酵培养基中呋喃唑酮10μg/L，开始流加时间选择发酵18h，流加比例为糖流量的1％。

本发明中，所述发酵培养基的碳源可以是葡萄糖和/或蔗糖，氮源可以是硫酸铵和/或氨水。

本发明中，当所述发酵生产赖氨酸时，所述发酵培养基包括：葡萄糖19-21g/L、H

流加使用的葡萄糖溶液的浓度为550-650g/L，硫酸铵溶液的浓度为450-550g/L，氨水的浓度为25％-28％，苏氨酸溶液的浓度为3-5g/L。

优选地，发酵菌为大肠杆菌。

本发明中，当所述发酵生产赖氨酸时，所述种子培养基包括：葡萄糖39-41g/L，KH

本发明中，当所述生产发酵赖氨酸时，发酵培养条件包括：发酵温度36-38℃，发酵压力控制0.07-0.09MPa，通气量0.8-1.2vvm。

控制发酵过程残糖为0.8-1.2g/L，苏氨酸添加量与葡萄糖添加量的质量比为(0.0014-0.0016):1，呋喃唑酮溶液的添加量与葡萄糖溶液的添加量的质量比为1％，发酵氨氮浓度0.8-1.2g/L，以氨水进行pH调控，发酵pH值为6.7-7.1。

流加上述补料液后，继续发酵培养，发酵培养条件包括：通气量0.5-0.8vvm，转速300-700rpm，压力控制0.06-0.08MPa，pH7.0-7.2，温度36-38℃，溶氧18-22％。

待发酵液中残糖量为0.1-0.2g/L时开始流加葡萄糖溶液，使葡萄糖的浓度控制在0.8-1.2g/L，氮源氨水作为pH调节剂。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

以下实施例采用当实验方法如下：

(1)不同呋喃唑酮浓度添加下赖氨酸发酵实验；

(2)不同时间添加赖氨酸发酵实验。

具体流程为：

①将一级种子液接入10L发酵罐内进行二级种子培养；

②将二级种子液接入发酵培养基，50L发酵罐内进行发酵培养。

条件控制：

①氨浓度控制：作为氨基酸生产所需的氮源的氨浓度，在培养基中不能处于低的状态，否则将导致碱性氨基酸生产率降低。在L-赖氨酸的菌株MHZ-0914发酵过程，流加氨水的同时，流加硫酸铵保持发酵液中氨浓度在0.8-1.2g/L，优选1g/L。

②糖浓度和pH控制：通过考察发酵过程中菌体在产酸、糖、氨消耗情况，获得两者间比例关系。据此以pH反馈信号为控制条件，发酵液中以零糖控制，使得pH反馈系统向发酵罐中流加氨的同时实现糖的补加，使用凯氏定氮仪监测发酵过程中游离氨的含量，每6h记录一次。

转化率和发酵强度两个参数直接影响终产品的成本。转化率高可以降低葡萄糖成本，发酵强度高可以提升设备利用率，降低设备及所有物料人工的成本。若转化率和发酵强度均高，则说明方案更优，若两方案比较时出现了这两个参数一高一低的情况，则在理论酸差距不大(±2％)时，转化率高更佳；在转化率相差不大(±1％)时，理论酸高更佳。

实施例1发酵生产赖氨酸的方法

本实施例提供一种发酵生产赖氨酸的方法(不添加呋喃唑酮溶液，作为对照)，发酵菌株为MHZ-0914。具体如下：

种子培养基：葡萄糖40g/L，KH

发酵培养基：葡萄糖20g/L，H

流加使用的葡萄糖溶液的浓度为600g/L，硫酸铵溶液的浓度为500g/L，氨水的浓度为26％，苏氨酸溶液的浓度为4g/L。

上述发酵底物均于121℃灭菌20min。

种子罐中分别接入上述L-赖氨酸生产菌株，待二级种子液的OD

发酵结果表明，转化率69.5％，发酵强度5.79g/L/h，产酸(赖氨酸盐酸盐)197g/L，理论酸6930g，最高OD

实施例2发酵生产赖氨酸的方法

本实施例提供一种发酵生产赖氨酸的方法，具体方法与实施例1相同，区别仅在于，发酵培养基中初始开始流加呋喃唑酮溶液，浓度分别为10μg/L、20μg/L、30μg/L。

在发酵培养基中初始流加呋喃唑酮溶液10μg/L，转化率70.2％，发酵强度5.80g/L/h,发酵产酸198g/L，理论酸6960g，最高OD

实施例3发酵生产赖氨酸的方法

本实施例提供一种发酵生产赖氨酸的方法，具体方法与实施例1相同，区别仅在于，在发酵6h，12h，18h，24h开始流加呋喃唑酮溶液，呋喃唑酮溶液的浓度为10μg/L，呋喃唑酮溶液的添加量与葡萄糖溶液的添加量的质量比为1％。

发酵结果表明：发酵6h开始流加，转化率70.2％，理论酸6845g，发酵强度5.70g/L/h，产酸193g/L，最高OD

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。