一种层层自组装组织工程膜片的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药制剂技术领域，更具体的说是涉及一种层层自组装组织工程膜片的制备方法及其应用。

背景技术

壳聚糖(Chitosan，CS)是甲壳素的脱乙酞基产物，是一种天然可生物降解的聚阳离子多糖。壳聚糖具有无毒、良好的生物相容性、可生物降解性等优点，在生物医学及制药等方面的应用极其广泛。CS分子内富含氨基和羟基，可形成氢键，因此CS不溶于水和有机溶剂，但可溶于(稀)酸溶液中。

海藻酸钠(Sodium alginate，SA)是一种从海洋褐藻中提取的阴离子多糖，主要由1-4连接的α-L-甘露糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸残基组成。由于海藻酸钠的生物相容性、生物降解性、低成本、无毒和良好的成膜性，已被广泛使用和研究。然而，沿海藻酸钠主链分布的大量游离羟基(-OH)和羧酸盐(-COO-)导致了海藻酸钠的高亲水性，使海藻酸钠由于其刚性和脆性而表现出较差的机械性能和热稳定性。因此，需要将海藻酸钠与其他材料相互作用来改善水敏感性和机械性能。

氨基使CS带有正电荷，而在中性和弱碱性条件下，羧基使SA带有大量负电荷，这是CS与SA能够进行静电吸附自组装的基础。层层自组装是一种有效的提高膜力学性能的技术，以离子间的静电作用作为成膜的驱动力。利用这种方法可以控制自组装膜片的结构和厚度，并且由于静电相互作用的非特异性，可以轻易地将生物功能大分子引入膜片。

因此，如何提供一种具体的层层自组装组织工程膜片的制备方法及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种层层自组装组织工程膜片的制备方法及其应用，如该膜片在获取组织工程体外单层细胞中的用途。

层层自组装的CS/SA膜是水溶性的，当用Ca

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种层层自组装组织工程膜片的制备方法，包括以下步骤：

(1)在磁力搅拌条件下，将SA，甘油和明胶溶解在蒸馏水中，得SA/甘油/明胶溶液，备用；

(2)将CS，氯化钠，甘油和明胶溶解在HAc溶液中，搅拌，得CS/NaCl/甘油/明胶溶液；

(3)将载玻片置于步骤(1)制备的SA/甘油/明胶溶液后取出，干燥，得具有SA膜的载玻片；

(4)将具有SA膜的载玻片浸入CS/NaCl/甘油/明胶溶液后取出，烘干；

(5)重复步骤(1)～(4)组装和干燥步骤，直到达到设计的层数，得到水溶性层层自组装组织工程膜片的载玻片；

(6)将含水溶性层层自组装组织工程膜片的载玻片浸入CaCl

(7)将从载玻片上取下的膜片干燥并保存，得层层自组装组织工程膜片。

优选的：步骤(1)磁力搅拌条件：150～250rpm；SA，甘油、明胶、蒸馏水的质量体积比：1.5g：1mL：1mL：100mL，明胶浓度：0.1g/mL，持续搅拌4h。

优选的：步骤(2)CS，氯化钠，甘油、明胶和HAc溶液的质量体积比：1.5g：1g：1mL：0.1mL：100mL，明胶浓度：0.1g/mL，HAc溶液：1％，v/v；搅拌：温度：20～30℃4h。

优选的：步骤(3)载玻片置于步骤(1)制备的SA/甘油/明胶溶液中的时间为10min；干燥：置于37℃生化培养箱中；

步骤(4)具有SA膜的载玻片浸入CS/NaCl/甘油/明胶溶液中的时间为10min；烘干：置于37℃的生化培养箱中。

优选的：步骤(6)CaCl

本发明还提供了任一上述方法制备得到的层层自组装组织工程膜片。

本发明还提供了上述的层层自组装组织工程膜片在培养、分离单层细胞中的应用。

优选的：包括以下步骤：当细胞在膜片上贴壁且生长，期间每16h为一次处理循环，共4～6次处理循环，每一个循环内按照0.9％NaCl处理后，再用0.5％CaCl

优选的：处理循环为6次；0.9％NaCl处理的时间：4h；CaCl

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种层层自组装组织工程膜片的制备方法及其应用，取得的技术效果为本发明以壳聚糖(CS)和海藻酸钠(SA)为主要原料，通过自组装和离子替换的方法制备了一种可变形组织工程膜片，能够通过Ca

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的层层自组装组织工程膜片原理图。

图2附图为本发明提供的层层自组装组织工程膜片的制备流程图。

图3附图为本发明提供的层层自组装组织工程膜片膨胀和收缩性能折线图，其中2+14：NaCl处理2h和CaCl

图4附图为本发明提供的不同时期的扩张和收缩图。

图5附图为本发明提供的CA膜、CS膜和层层自组装组织工程膜片的溶胀比图。

图6附图为本发明提供的CA膜、CS膜和层层自组装组织工程膜片的水蒸气渗透性图。

图7附图为本发明提供的第1、3、5天CCK-8测定肾上皮细胞活性图。

图8附图为本发明提供的AM/PI染色肾上皮细胞的荧光图像图。

图9附图为本发明提供的不同组不同时间肾上皮细胞的PCNA测定图。

图10附图为本发明提供的不同时间组肾上皮细胞β-Catenin测定图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种层层自组装组织工程膜片的制备方法及其应用。实施例中未提及的实验材料、实验步骤均为市售材料或常规实验步骤，对其厂家来源没有限定。

实施例1

层层自组装组织工程膜片的制备(参见图1、2)

(1)在磁力搅拌(200rpm)下，将1.5g SA，1mL甘油和1mL明胶(0.1g/mL)溶解在100mL蒸馏水中，持续搅拌4h，得SA/甘油/明胶溶液，备用；

(2)将1.5g CS，1g氯化钠，1mL甘油和0.1mL明胶(0.1g/mL)溶解在100mL HAc溶液(1％，v/v)中，并在室温下搅拌4h；

(3)将载玻片放入步骤(1)制备的SA/甘油/明胶溶液中10min后拿出，将其放入37℃的生化培养箱中干燥，得具有SA膜的载玻片；

(4)将具有SA膜的载玻片浸入CS/NaCl/甘油/明胶溶液中10min，随后取出将其放置37℃的生化培养箱中烘干；

(5)重复步骤(1)～(4)组装和干燥步骤，直到达到设计的层数，得到水溶性层层自组装组织工程膜片的载玻片；

(6)将含水溶性层层自组装组织工程膜片的载玻片浸入1.5％(w/w)的CaCl

(7)将从载玻片上取下的膜片干燥并保存，得层层自组装组织工程膜片(最终材料)。

实施例2

基于实施例1制备的层层自组装组织工程膜片上培养单层上皮细胞并分离单层细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将制备得到的层层自组装组织工程膜片进行湿热灭菌处理(121℃，0.10MPa，20min)后，将膜片置入无菌蒸馏水中待用。

(2)选取正常生长的牛肾上皮细胞进行传代处理，处理约48h、贴壁率在80％以上时作为实验用细胞，对细胞进行消化处理，调整细胞浓度为1×10

(3)先将膜片置于48孔板或96孔板中，再向每孔的膜片上加入200μL的牛肾上皮细胞悬液，置于含有5％CO

(4)细胞在膜片上贴壁且生长，期间每16h为一次处理循环，每一个循环内按照0.9％NaCl处理一定时间后再用0.5％CaCl

(5)待细胞融合率达到95％以上时，弃去原有DMEM培养基，使用PBS缓冲液对每个膜片进行清洗，至少洗涤3次。

(6)向含有膜片的培养孔中加入200μL、质量分数为0.5％的无菌CaCl

(7)镜下观察膜片及细胞。待膜片收缩且单层细胞从膜片上分离后，弃去CaCl

对比试验1

层层自组装组织工程膜片中的海藻酸高分子在NaCl和CaCl

首先，将层层自组装组织工程膜片切成直径10mm的圆形膜，在室温下浸入0.9％NaCl溶液中数小时后测量膜的直径。然后，再将层层自组装组织工程膜片浸入0.5％CaCl

结果表明：经0.5％CaCl

此外，层层自组装组织工程膜片的初始网络结构比较松散，因此在Na

图4显示了0.9％NaCl和0.5％CaCl

对比实验2

在体外培养细胞时，组织工程膜片的吸水能力和水蒸气透过能力，都会影响细胞的生长。因此，评价膜片的吸水溶胀能力和水蒸气透过能力，将有助于评价膜片的细胞生长能力。

将CA、CS膜和实施例1制备的层层自组装组织工程膜片(LBLSM)切成相同质量的样品。将这些样品在25℃的PBS中浸泡24h，然后除去膜表面游离水，最后称取样品。膜片的初始重量为W0。PBS浸泡后的膜重量为W1。膜在PBS中的溶胀率计算公式如下：溶胀率(％)＝(W1-W0)/W0×100％。为避免误差，所有样品平行三份。

另外，根据重量分析法测定样品的水蒸气渗透率。在12个15mL离心管中加入10mL去离子水，并随机分为四组：空白对照组，CA组，CS组和层层自组装组织工程膜片组。对于CA组，CS组和层层自组装组织工程膜片组，离心管管口分别用CA膜，CS膜和层层自组装组织工程膜片密封。然后，将所有离心管放置在37℃生化培养箱中，并在24h后准确记录每个离心管的重量变化。水蒸气渗透率计算公式如下：WVP＝(Wx-Wx’)/(W1-W1’)×100％。其中Wx是CA，SA和层层自组装组织工程膜片密封离心管的初始质量；Wx’是24h后CA，SA和层层自组装组织工程膜片密封离心管的质量；W1是对照离心管的初始质量；W1’为24h后对照组的离心管质量。

结果表明：层层自组装组织工程膜片比CA和CS膜具有更优异的吸水能力，且水蒸气的传输能力相同(图5～6)，说明层层自组装组织工程膜片不仅能更好地吸收多余水分，维持细胞湿润环境，还能促进多余水分和其他分泌液的蒸发，为细胞生长提供良好的环境。

对比实验3

选择肾上皮细胞评价交替离子激活和膜控制变形对层层自组装组织工程膜片上生长的细胞增殖的影响。

肾上皮细胞在含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中，并置于CO

具体步骤：将100μL细胞悬液(1×10

另外，采用钙黄绿素(AM)/碘化丙啶(PI)双染色试剂盒对层层自组装组织工程膜片上培养的肾上皮细胞进行细胞活力和形态分析。

将层层自组装组织工程膜片切割成圆形膜，高压灭菌，然后转移到6孔板上。将膜分为空白对照、层层自组装组织工程膜片和层层自组装组织工程膜片+NaCl+CaCl

具体步骤：细胞(1×10

处理方法如下：(1)细胞贴壁后弃去培养液，加入100μL生理盐水，孵育4h；(2)丢弃0.9％NaCl溶液，培养皿中加入0.5％CaCl

结果表明：CCK-8检测结果(图7)和AM/PI染色(图8)显示，与对照组相比，层层自组装组织工程膜片(未变形)处理的细胞绿色荧光更强，细胞生长更快，表明层层自组装组织工程膜片本身能显著促进细胞生长。大部分上皮细胞呈梭形，非常适合在材料定向表面铺展生长，因此层层自组装组织工程膜片的高亲水性、高定向性和适当的表面粗糙度可以为上皮细胞的生长提供更好的环境条件。同时，经NaCl/CaCl

对比实验4

增殖细胞核抗原(PCNA)与细胞DNA合成密切相关，在细胞增殖中起着重要作用。β-catenin(β-连环素)作为一种广泛存在于各种类型细胞中的多功能蛋白，对细胞增殖、分化和凋亡也至关重要。通过对不同处理组的PCNA和β-catenin表达的分析，来进一步证明层层自组装组织工程膜片对细胞增殖的促进作用。

采用PCNA ELISA试剂盒和β-Catenin ELISA试剂盒检测层层自组装组织工程膜片对细胞增殖的影响。将层层自组装组织工程膜片切成圆形膜，高压灭菌，然后转移到96孔板上。将膜分为空白对照、层层自组装组织工程膜片和层层自组装组织工程膜片+NaCl+CaCl

具体步骤：每96孔加入100μL细胞悬液(1×10

结果表明：从图9和图10的结果看，层层自组装组织工程膜片组和层层自组装组织工程膜片+NaCl+CaCl

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。