一种妇科肿瘤微肿瘤模型的培养方法及其使用的培养基

技术领域

本发明属于医学领域，具体涉及一种妇科肿瘤微肿瘤模型的培养方法及其使用的培养基。

背景技术

常见的妇科肿瘤有乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等。妇科肿瘤是一类复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用形成一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。随着肿瘤诊断技术的进步、外科技术的发展和抗肿瘤治疗新方法的问世，妇科肿瘤的总体治疗效果已经获得了很大程度的改善，但是人类对妇科肿瘤的发生、发展、复发转移等生物学过程，还有异质性、耐药性、肿瘤免疫相应机制仍然知之甚少。妇科肿瘤的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此，将妇科肿瘤实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是妇科肿瘤研究领域乃至妇科肿瘤诊断治疗领域的趋势。

现有的原代肿瘤细胞培养方法主要包括2D培养、3D培养、重编程培养等，但这些培养方法都面临不同程度的问题，如培养周期长、培养成功率低、杂细胞难以去除、无法重现肿瘤微环境等。开发一种能准确反应妇科肿瘤患者原病灶特性的肿瘤模型(即妇科肿瘤微肿瘤模型)显得至关重要。

发明内容

本发明的目的是开发一种能准确反应妇科肿瘤患者原病灶特性的肿瘤模型(即妇科肿瘤微肿瘤模型)。

本发明首先保护一种用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基，具体可由三抗P/S、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白Follistatin、人重组蛋白IL-2、人重组蛋白IL-15、LY2109761、PEG2、Progesterone、β-Estradiol、B27、ITS-X、Y-27632和Advanced DMEM/F12培养基组成。用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基中，三抗P/S的浓度可为0.8-1.2％(如0.8-1.0％、1.0-1.2％、0.8％、1.0％或1.2％)。HEPES的浓度可为8-12mM(如8-10mM、10-12mM、8mM、10mM或12mM)。GlutaMax的浓度可为0.8-1.2％(如0.8-1.0％、1.0-1.2％、0.8％、1.0％或1.2％)。人重组蛋白EGF的浓度可为10-100ng/mL(如10-50ng/mL、50-100ng/mL、10ng/mL、50ng/mL或100ng/mL)。人重组蛋白bFGF的浓度可为10-50ng/mL(如10-20ng/mL、20-50ng/mL、10ng/mL、20ng/mL或50ng/mL)。人重组蛋白HGF的浓度可为5-25ng/mL(如5-20ng/mL、20-25ng/mL、5ng/mL、20ng/mL或25ng/mL)。人重组蛋白Follistatin的浓度可为100-200ng/mL(如100-150ng/mL、150-200ng/mL、100ng/mL、150ng/mL或200ng/mL)。人重组蛋白IL-2的浓度可为10-100ng/mL(如10-20ng/mL、20-100ng/mL、10ng/mL、20ng/mL或100ng/mL)。人重组蛋白IL-15的浓度可为10-100ng/mL(如10-20ng/mL、20-100ng/mL、10ng/mL、20ng/mL或100ng/mL)。LY2109761的浓度可为0.5-2μM(如0.5-1μM、1-2μM、0.5μM、1μM或2μM)。PEG2的浓度可为50-200nM(如50-100nM、100-200nM、50nM、100nM或200nM)。Progesterone的浓度可为50-100nM(如50-75nM、75-100nM、50nM、75nM或100nM)。β-Estradiol的浓度可为10-50nM(如10-30nM、30-50nM、10nM、30nM或50nM)。B27的浓度可为1.8-2.2％(如1.8-2.0％、2.0-2.2％、1.8％、2.0％或2.2％)。ITS-X的浓度可为0.8-1.2％(如0.8-1.0％、1.0-1.2％、0.8％、1.0％或1.2％)。Y-27632的浓度可为5-20μM(如5-10μM、10-20μM、5μM、10μM或20μM)。

上述三抗P/S为用于防止细菌和真菌污染的抗生素-抗真菌剂。三抗P/S由青霉素、链霉素和两性霉素B组成。具体的，三抗P/S可为Gibco公司的产品，产品目录号为#15240062。

上述HEPES具体可为Gibco公司的产品，产品目录号为#15630080。

上述GlutaMax具体可为Gibco公司的产品，产品目录号为#35050061。

上述B27具体可为Gibco公司的产品，产品目录号为#12587010。

上述ITS-X具体可为Gibco公司的产品，产品目录号为#51500056。

上述Advanced DMEM/F12培养基具体可为Gibco公司的产品，产品目录号为#12634010。

上述人重组蛋白EGF具体是以1000×人重组蛋白EGF储液形式的添加。1000×人重组蛋白EGF储液(5mL)的具体配方如表5所示。其中100×BSA溶液(1mL)的具体配方如表4所示。

上述人重组蛋白bFGF具体是以1000×人重组蛋白bFGF储液形式的添加。1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)的具体配方如表6所示。

上述人重组蛋白HGF具体是以1000×人重组蛋白HGF储液形式的添加。1000×人重组蛋白HGF储液(5mL)的具体配方如表7所示。

上述人重组蛋白Follistatin具体是以1000×人重组蛋白Follistatin储液形式的添加。1000×人重组蛋白Follistatin储液(1mL)的具体配方如表8所示。

上述人重组蛋白IL-2具体是以1000×人重组蛋白IL-2储液形式的添加。1000×人重组蛋白IL-2储液(5mL)的具体配方如表9所示。

上述人重组蛋白IL-15具体是以1000×人重组蛋白IL-15储液形式的添加。1000×人重组蛋白IL-15储液(5mL)的具体配方如表10所示。

上述LY2109761具体是以1000×LY2109761储液形式的添加。1000×LY2109761储液(11.32mL)的具体配方如表11所示。

上述PEG2具体是以10000×PEG2储液形式的添加。10000×PEG2储液(14.19mL)的具体配方如表12所示。

上述Progesterone具体是以100000×Progesterone储液形式的添加。100000×Progesterone储液(15.9mL)的具体配方如表13所示。

上述β-Estradiol具体是以100000×β-Estradiol储液形式的添加。100000×β-Estradiol储液(18.36mL)的具体配方如表14所示。

上述Y-27632具体是以1000×Y-27632储液形式的添加。1000×Y-27632储液(3.125mL)的具体配方如表15所示。

所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基在培养妇科肿瘤微肿瘤模型中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述妇科肿瘤微肿瘤模型具体为能准确反应妇科肿瘤患者原病灶特性的肿瘤模型。

上述应用中，所述妇科肿瘤微肿瘤模型具体可采用下述培养方法制备。

本发明还保护一种用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的试剂盒，可包括上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基。

所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的试剂盒还可包括样本解离液；

每10ml样本解离液由0.8-1.2mL(0.8-1.0mL、1.0-1.2mL、0.8mL、1.0mL或1.2mL)10×胶原酶I储液、0.8-1.2mL(0.8-1.0mL、1.0-1.2mL、0.8mL、1.0mL或1.2mL)10×胶原酶III储液、0.8-1.2mL(0.8-1.0mL、1.0-1.2mL、0.8mL、1.0mL或1.2mL)10×胶原酶IV储液和PBS缓冲液组成；每100ml 10×胶原酶I储液由20U胶原酶I和PBS缓冲液组成；每100ml 10×胶原酶III储液由20U胶原酶III和PBS缓冲液组成；每100ml 10×胶原酶IV储液由20U胶原酶IV和PBS缓冲液组成。

所述10×胶原酶I储液(100mL)的具体配方如表1所示。

所述10×胶原酶III储液(100mL)的具体配方如表2所示。

所述10×胶原酶IV储液(100mL)的具体配方如表3所示。

表1、表2和表3中，可用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(胶原酶I、胶原酶IV或胶原酶III)的单位U：在37℃、pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(胶原酶I、胶原酶IV或胶原酶III)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。即在37℃、pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶I 5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol，胶原酶I即为1U。在37℃、pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶III 5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol，胶原酶III即为1U。在37℃、pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶IV5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol，胶原酶IV即为1U。

所述样本解离液(10mL)的具体配方如表19所示。

上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的试剂盒具体可由上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基组成。

上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的试剂盒具体可由上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基和上述任一样本解离液组成。

上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的试剂盒在培养妇科肿瘤微肿瘤模型中的应用。

上述应用中，所述妇科肿瘤微肿瘤模型具体为能准确反应妇科肿瘤患者原病灶特性的肿瘤模型。

上述应用中，所述妇科肿瘤微肿瘤模型具体可采用下述培养方法制备。

本发明还保护一种妇科肿瘤微肿瘤模型的培养方法，包括如下步骤：

(a1)取妇科肿瘤组织样本，解离，得到肿瘤细胞；

(a2)采用上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基对步骤(1)得到的肿瘤细胞进行悬浮培养，直至细胞形成细胞团(癌组织来源的多种不同类型细胞自发聚集而成)；

细胞团即为妇科肿瘤微肿瘤模型。

上述方法中，所述步骤(1)中，解离可为采用上述任一所述样本解离液进行解离。

上述方法中，所述解离的步骤可如下：

(1-1)向妇科肿瘤组织样本中加入上述任一所述样本解离液，37℃解离时间0.5-2h(如0.5-1h、1-2h、0.5h、1h或2h)；妇科肿瘤组织样本和样本解离液的比例为0.1-0.5mg：1mL(如0.1-0.3mg：1mL、0.3-0.5mg：1mL、0.1mg：1mL、0.3mg：1mL或0.5mg：1mL)；

(1-2)终止解离反应；之后去除组织残片和粘连细胞，收集细胞沉淀。

所述步骤(1-2)中，终止解离反应可通过加入消化终止液实现。消化终止液(100mL)的具体配方如表21所示。

上述方法中，所述步骤(2)中，悬浮培养的条件可为37℃、5％CO

所述步骤(2)中，每2-3天更换一次用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基以维持妇科肿瘤微肿瘤生长状态。

所述步骤(2)中，上述任一所述用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基和肿瘤细胞进行悬浮培养的比例可为2-3mL：10

本发明还保护一种获得妇科肿瘤实体瘤原代细胞的方法，可包括如下步骤：

(b1)将上述任一所述培养方法制备的妇科肿瘤微肿瘤模型进行消化，得到单细胞；

(b2)从(b1)得到的单细胞中分选出CD326阳性细胞，即妇科肿瘤实体瘤原代细胞。

所述步骤(b1)中，消化通过加入细胞消化液实现。细胞消化液(10mL)的具体配方如表20所示。

所述步骤(b2)中，所述从(b1)得到的单细胞中分选出CD326阳性细胞可通过利用CD326磁珠阳选试剂盒(美天旎，#130-061-101)进行细胞磁珠分选，得到CD326阳性的肿瘤细胞。

上述方法还包括将妇科肿瘤实体瘤原代细胞进行传代的步骤。所述传代使用的培养基可为含有10％胎牛血清的用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的培养基。

上述任一所述妇科肿瘤具体可为原发性妇科肿瘤。上述任一所述妇科肿瘤的病理分期可为II期或III期。上述任一所述妇科肿瘤的病理分型可为非小细胞妇科肿瘤或小细胞妇科肿瘤。

上述任一所述妇科肿瘤可为原发性卵巢癌、乳腺癌癌或子宫内膜癌。

本发明提供的妇科肿瘤微肿瘤模型的培养方法的技术核心是：用温和的样本解离液处理妇科肿瘤实体瘤组织，最大程度的保证了组织中各种类型细胞的活力；配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系使妇科肿瘤组织中分离得到的各类型细胞自组装形成具有多种细胞成分的细胞团结构，称之为“妇科肿瘤微肿瘤模型”。本发明提供的方法具有以下优点：1、组织样本用量少，仅需20mg左右的妇科肿瘤手术样本；2、周期短，仅需3-5天即可获得10

附图说明

图1为妇科肿瘤微肿瘤模型形成过程前48小时的明场图片。标尺为200μm，100倍放大。

图2为妇科肿瘤微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本HE染色效果对比图。标尺为50μm，400倍放大。

图3为妇科肿瘤微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本多重免疫荧光染色效果对比图。标尺为50μm，400倍放大。

图4为分离纯化得到的卵巢癌实体瘤原代细胞明场图及免疫荧光染色结果。

图5为培养基A、培养基B、培养基C和培养基D培养得到的妇科肿瘤微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本拷贝数变异分析(CNV)对比结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

10×胶原酶I储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装，每管1mL。分装后，可在-20℃长期保存。10×胶原酶I储液(100mL)的具体配方如表1所示。

表1

10×胶原酶III储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装，每管1mL。分装后，可在-20℃长期保存。10×胶原酶III储液(100mL)的具体配方如表2所示。

表2

10×胶原酶IV储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装，每管1mL。分装后，可在-20℃长期保存。10×胶原酶IV储液(100mL)的具体配方如表3所示。

表3

表1、表2和表3中，可用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(胶原酶I、胶原酶IV或胶原酶III)的单位U：在37℃、pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(胶原酶I、胶原酶IV或胶原酶III)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。

100×BSA溶液现配现用。100×BSA溶液(1mL)的具体配方如表4所示。

表4

1000×人重组蛋白EGF储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白EGF储液(5mL)的具体配方如表5所示。

表5

1000×人重组蛋白bFGF储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)的具体配方如表6所示。

表6

1000×人重组蛋白HGF储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白HGF储液(5mL)的具体配方如表7所示。

表7

1000×人重组蛋白Follistatin储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白Follistatin储液(1mL)的具体配方如表8所示。

表8

1000×人重组蛋白IL-2储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白IL-2储液(5mL)的具体配方如表9所示。

表9

1000×人重组蛋白IL-15储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白IL-15储液(5mL)的具体配方如表10所示。

表10

1000×LY2109761储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×LY2109761储液(11.32mL)的具体配方如表11所示。

表11

10000×PEG2储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。10000×PEG2储液(14.19mL)的具体配方如表12所示。

表12

100000×Progesterone储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。100000×Progesterone储液(15.9mL)的具体配方如表13所示。

表13

100000×β-Estradiol储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。100000×β-Estradiol储液(18.36mL)的具体配方如表14所示。

表14

1000×Y-27632储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×Y-27632储液(3.125mL)的具体配方如表15所示。

表15

1％甲基纤维素溶液可在4℃长期保存。1％甲基纤维素溶液(10mL)的具体配方如表16所示。

表16

实施例1、用于培养妇科肿瘤微肿瘤模型的试剂的配制

一、样本保存液的配制

配制样本保存液。样本保存液可用规格为15mL的离心管进行分装，每管5mL。分装后，可于4℃保存1个月。

样本保存液(100mL)的具体配方如表17所示。

表17

二、样本清洗液的配制

配制样本清洗液。样本清洗液需现配现用。

样本清洗液(100mL)的具体配方如表18所示。

表18

三、样本解离液的配制

配制样本解离液。样本解离液现配现用。

样本解离液(10mL)的具体配方如表19所示。

表19

四、细胞消化液的配制

配制细胞消化液。细胞消化液现配现用。

细胞消化液(10mL)的具体配方如表20所示。

表20

五、消化终止液的配制

配制消化终止液。消化终止液可于4℃保存1个月。

消化终止液(100mL)的具体配方如表21所示。

表21

六、妇科肿瘤微肿瘤模型培养基的配制

1、配制培养基。培养基(100mL)的具体配方如表22所示。

表22

2、取步骤1配制的培养基，用0.22μM针头式滤器(MilliporeSLGP033RS)过滤除菌，得到妇科肿瘤微肿瘤模型培养基。妇科肿瘤微肿瘤模型培养基可在4℃保存两周。

七、细胞冻存液的配制

配制细胞冻存液。细胞冻存液现配现用。

细胞冻存液(23mL)的具体配方如表23所示。

表23

实施例2、妇科肿瘤微肿瘤模型的获得

一、妇科肿瘤术后标本(即妇科肿瘤组织样本)的获取

妇科肿瘤组织样本的获取的步骤如下：

1、与三甲医院合作，通过研究者发起的临床研究形式获取样本，合作的开展通过正规的医学伦理审查。

2、主治医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养。样本的选取标准为：原发性卵巢癌、乳腺癌癌或子宫内膜癌；病理分期为II期或III期；妇科肿瘤标本重量超过20mg的样本。

3、所有入组案例统一采用样本采集日期+患者住院号后四位的方式编码，例如2020年1月1日提供的样本，患者住院号为T001537474，则样本实验编号为202001017474。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息。医院提供样本时同时提供患者的病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。

4、主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、吸烟史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验编号的命名原则为采集样本的八位数字日期+患者住院号后四位。

5、手术中肿瘤组织离体后，由样本采集专员在手术室无菌环境中采集新鲜标本，采集样本需要选取新鲜血管丰富的部位，避免坏死组织、脂肪组织、纤维化组织等细胞活性差的部位。采集的样本置于事先4℃预冷的样本保存液中。包含样本的样本保存管在冰上暂存，12小时内运输到实验室进行下一步操作，运输过程控制温度2-8℃。

二、妇科肿瘤组织样本的解离前处理

1、样本称重后用医用酒精(体积百分含量为75％)清洗样本(即妇科肿瘤组织样本)表面10-30秒。

2、用样本清洗液清洗样本5次，用无菌的PBS溶液清洗样本5次。

3、用眼科剪、眼科镊、手术刀等器材，小心将样本中的脂肪组织、结缔组织、坏死组织剥离。

上述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。

上述操作中用到的手术器材，均需事先高温蒸汽灭菌(120℃，20分钟)，烘干后才能使用。

三、妇科肿瘤组织样本的解离

1、用眼科剪将组织剪碎成0.5mm

2、用样本解离液处理组织，样本大小不超过0.5mg的组织用1mL样本解离液，样本大小超过0.5mg的组织，组织重量每增加0.1mg需要增加0.1mL样本解离液。样本解离液处理条件为37℃、解离时间0.5-2小时。解离过程中每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大部分细胞从组织中脱落。

3、用10倍体积的消化终止液终止解离反应，细胞悬液经100μm无菌细胞滤网过滤去除组织残片和粘连细胞后，800g室温离心10分钟，弃去上清。

4、用5mL无菌PBS重悬细胞，800g室温离心10分钟，弃去上清。

5、用妇科肿瘤微肿瘤模型培养基重悬细胞沉淀，进行细胞计数，台盼蓝染色测定细胞活率，细胞活率大于70％即可进行细胞接种培养。

上述实验用到的手术器材，均需事先高温蒸汽灭菌(120℃，20分钟)，烘干后才能使用。

四、妇科肿瘤微肿瘤模型培养

1、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行妇科肿瘤微肿瘤模型悬浮培养，所用培养基即为实施例1表22制备的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基(其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL，人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL，人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL，人重组蛋白Follistatin的终浓度为100ng/mL，人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL，人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL，LY2109761的终浓度为1μM，PEG2的终浓度为100nM，Progesterone的终浓度为100nM，β-Estradiol的终浓度为10nM，Y-27632的终浓度为10μM)。以六孔板为例，按每孔10

2、每天观察细胞状态，直至细胞形成直径100μm左右的团块，之后每2-3天更换一次妇科肿瘤微肿瘤模型培养基以维持妇科肿瘤微肿瘤生长状态。

培养的最初48小时的结果见图1。结果表明，在培养的最初48小时内，癌组织来源的多种不同类型细胞自发聚集，自组装形成100μm大小的细胞团块结构，称之为妇科肿瘤微肿瘤模型。妇科肿瘤微肿瘤模型的微肿瘤细胞团总数量可以达到10

本方法经过大量样本测试，所有妇科肿瘤手术样本的微肿瘤模型培养成功率可以达到80％以上。

实施例3、妇科肿瘤微肿瘤模型和原病灶的HE染色对比鉴定

HE染色试剂盒为北京索莱宝生物科技有限公司的产品，产品目录号为#G1285。阳离子防脱玻片为北京中杉金桥生物科技有限公司的产品。二甲苯、甲醇和丙酮均为北京化学试剂公司的分析纯。中性树脂胶为北京益利精细化学品有限公司的产品。

1、收集黄豆粒大小的妇科肿瘤组织样本(即原病灶)。妇科肿瘤为卵巢癌、乳腺癌或子宫内膜癌。

2、取步骤1收集的妇科肿瘤组织样本，按照实施例2的步骤制备妇科肿瘤微肿瘤模型；之后室温、2000rpm离心10min，收集沉淀。

3、将组织(步骤1收集的原病灶或步骤2收集沉淀)进行脱水固定(脱水机标准程序，樱花Tissue0Tek VIP 5Jr1脱水机)。

4、完成步骤3后，进行石蜡包埋(石蜡包埋机标准程序，徕卡Leica EG1150H石蜡包埋机)。

5、完成步骤4后，将包埋好的组织蜡块进行切片，切片厚度5μm(徕卡Leica RM2245半自动转轮式切片机)。

6、完成步骤5后，将切片进行摊片(徕卡Leica HI1210摊片机)，附着在阳离子防脱玻片上进行烤片(徕卡Leica HI1220烤片机)，制成石蜡切片备用。

7、用HE染色试剂盒分别对原病灶和微肿瘤切片进行HE染色：脱蜡梯度乙醇复水后，苏木精染液染色3分钟，自来水清洗玻片3次；100μL分化液分化1分钟，自来水清洗玻片2次，蒸馏水清洗玻片1次。伊红染液染色1分钟后，梯度乙醇脱水。乙醇晾干后每张玻片滴加50μL二甲苯进行通透。等二甲苯晾干完全后，滴加一滴中性树脂胶，用盖玻片封片。

8、镜下观察染色效果，拍照。

图2以卵巢癌为例展示了培养得到的妇科肿瘤微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本HE染色效果对比图。

结果表明，卵巢癌微肿瘤模型可以保持原病灶的病理结构特点，乳腺癌微肿瘤模型可以保持原病灶的病理结构特点，子宫内膜癌微肿瘤模型可以保持原病灶的病理结构特点。即按照实施例2的步骤制备的妇科肿瘤微肿瘤模型可以保持原病灶的病理结构特点。

实施例4、妇科肿瘤微肿瘤模型和原病灶的多重免疫荧光染色鉴定

用超纯水溶解多聚甲醛粉末(北京化学试剂公司，分析纯)，制成4％(4g/100mL)多聚甲醛溶液。

甲醇和二甲基亚砜均为北京化学试剂公司的分析纯。35％双氧水为北京化学试剂公司的产品。

丹氏漂洗液由甲醇、二甲基亚砜和35％双氧水按照4:4:1(体积比)的比例混合而成。

3％BSA溶液：用PBS溶液溶解牛血清白蛋白(Sigma，#A1933)，得到3％(3g/100mL)的BSA溶液。

免疫荧光一抗抗体分别为panCK抗体(Abcam，#ab215838)、Vimentin抗体(abclonal，#A19607)和CD3抗体(Biolegend，#300434)。pan-CK抗体、Vimentin抗体和CD3抗体依次标记上皮来源的肿瘤细胞、间质细胞和T细胞。

免疫荧光二抗抗体为Alexa

当免疫荧光一抗抗体为panCK抗体时，免疫荧光二抗抗体为Alexa

当免疫荧光一抗抗体为Vimentin抗体时，免疫荧光二抗抗体为Alexa

Hoechst染液为北京索莱宝生物科技有限公司的产品，产品目录号为#C0021。

以实施例3中步骤6获得的石蜡切片为材料，进行多重免疫荧光染色。具体步骤依次如下：

1、取实施例3中步骤6获得的石蜡切片，先脱蜡复水，再用PBS清洗一遍，最后预冷的甲醇溶液(浓度为3％(v/v)，溶剂为PBS)处理1小时。

2、完成步骤1后，取所述石蜡切片，用丹氏漂洗液室温处理2小时，之后依次用75％(v/v)PBS稀释的甲醇溶液、50％(v/v)PBS稀释的甲醇溶液和25％(v/v)PBS稀释的甲醇溶液处理，每次10分钟。

3、完成步骤2后，取所述石蜡切片，3％BSA溶液室温封闭2小时。

4、完成步骤3后，取所述石蜡切片，加入免疫荧光一抗抗体稀释液(用3％BSA溶液稀释)，4℃过夜。

5、完成步骤4后，取所述石蜡切片，用PBS溶液清洗切片5次，每次20分钟。

6、完成步骤5后，取所述石蜡切片，加入免疫荧光二抗抗体稀释液(按1：2000的比例，用3％BSA溶液稀释)，室温孵育2小时。

7、完成步骤6后，取所述石蜡切片，用PBS溶液清洗切片5次，每次20分钟。

8、完成步骤7后，取所述石蜡切片，加入Hoechst染液，室温染色20分钟。

9、完成步骤8后，放淬灭封片剂封片，使用激光共聚焦显微镜观察染色情况并拍照。

图3展示了培养得到的妇科肿瘤微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本多重免疫荧光染色的效果图，可以看到妇科肿瘤微肿瘤模型中，不但保留了原病灶中panCK阳性(绿色荧光)的肿瘤细胞，同时还保存了Vimentin阳性的间质细胞(白色)和CD3抗体阳性的免疫细胞(T细胞红色)，最大程度的再现了原病灶的细胞多样性和微环境。

对15个妇科肿瘤组织样本(卵巢癌、乳腺癌和子宫内膜癌各5例)及其对应的原病灶组织块进行多重免疫荧光染色鉴定，统计结果见表24。

表24.妇科肿瘤微肿瘤模型及其对应的原病灶组织样本多重免疫荧光染色鉴定

由此可见，按照实施例2的步骤制备的妇科肿瘤微肿瘤模型和原病灶在细胞组成方面的高度相似性。

实施例5、妇科肿瘤实体瘤原代细胞的分离、传代、冻存和复苏

本实施例中妇科肿瘤微肿瘤模型培养基如实施例1表22所示，其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL，人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL，人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL，人重组蛋白Follistatin的终浓度为100ng/mL，人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL，人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL，LY2109761的终浓度为1μM，PEG2的终浓度为100nM，Progesterone的终浓度为100nM，β-Estradiol的终浓度为10nM，Y-27632的终浓度为10μM。

一、从妇科肿瘤微肿瘤模型中分离妇科肿瘤实体瘤原代细胞

1、取按照实施例2的步骤制备妇科肿瘤微肿瘤模型，室温、800g离心10分钟，弃上清，收集沉淀1。

2、完成步骤1后，用无菌的PBS溶液清洗沉淀1一次，室温、800g离心10分钟，收集沉淀2。

3、完成步骤2后，用细胞消化液重悬沉淀2，之后37℃消化5-30分钟。消化过程中每5分钟在显微镜下观察细胞团块消化情况，直到多数细胞团被消化为单细胞。

4、完成步骤3后，用10倍体积的消化终止液终止消化，室温、800g离心10分钟，弃上清，得到沉淀3。

5、完成步骤4后，将沉淀3用CD326磁珠阳选试剂盒(美天旎，#130-061-101)进行细胞磁珠分选，得到CD326阳性的肿瘤细胞：用分选缓冲液重悬沉淀3，细胞量少于10

分选缓冲液(50mL)的具体配方如表25所示。

表25.分选缓冲液

注：现配现用。

6、完成步骤5后，取分选得到的CD326阳性细胞，室温、800g离心10分钟，弃上清。之后用含有10％胎牛血清的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基，以10

二、传代

1、取步骤一贴壁培养的细胞，弃培养基，用无菌的PBS溶液清洗细胞。

2、完成步骤1后，用0.05％胰蛋白酶室温消化细胞30-300s。期间观察细胞状态，直到大部分细胞被消化为球形。

3、完成步骤2后，用10倍体积含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化反应，收集细胞悬液，室温、800g离心10分钟，弃上清。

4、完成步骤3后，室温、800g离心10分钟，收集沉淀。

5、完成步骤4后，用含有10％胎牛血清的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基重悬细胞沉淀，细胞计数。以10

将步骤5得到的高纯度的妇科肿瘤实体瘤原代细胞进行多重免疫荧光染色鉴定。部分鉴定结果见图4(由卵巢癌微肿瘤模型分离、传代获得的妇科肿瘤实体瘤原代细胞)。

三、妇科肿瘤实体瘤原代细胞的冻存

将步骤二纯化培养后的妇科肿瘤实体瘤原代细胞经过2-3次传代扩增后，可以进行冻存，具体步骤如下：

1、取妇科肿瘤实体瘤原代细胞，去培养基，用无菌的PBS溶液清洗。

2、完成步骤1后，用0.05％胰蛋白酶室温消化细胞30-300s。期间观察细胞状态，直到大部分细胞被消化为球形。

3、完成步骤2后，用10倍体积含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化反应，收集细胞悬液；室温、800g离心10分钟，弃上清。

4、完成步骤3后，室温、800g离心10分钟，收集沉淀。

5、完成步骤4后，用细胞冻存液按10

四、妇科肿瘤实体瘤原代细胞的复苏

液氮中保存的妇科肿瘤实体瘤原代细胞可以进行复苏，具体步骤如下：

1、提前5分钟准备37℃无菌水。

2、将冻存管从液氮中取出，在37℃无菌水中迅速融化细胞。

3、将冻存管中的细胞转移至15ml离心管，加入10倍体积含有10％胎牛血清的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基充分混匀，室温、800g离心10分钟，收集沉淀。

4、用含有10％胎牛血清的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基重悬沉淀，细胞计数。以10

实施例6、不同培养基对妇科肿瘤微肿瘤模型的影响

一、不同培养基对妇科肿瘤微肿瘤模型结构形成能力的比较

培养基A(100mL)的具体配方如表26所示。其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL ng/mL；人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；Y-27632的终浓度为10μM，Progesterone的终浓度为100nM，β-Estradiol的终浓度为10nM。

表26

1000×人重组蛋白MSP储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白MSP储液(2.5mL)的具体配方如表27所示。

表27

1000×N-acetyl-L-cysteine储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×N-acetyl-L-cysteine储液(5mL)的具体配方如表28所示。

表28

培养基C(100mL)的具体配方如表29所示。其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL ng/mL；人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；Forskolin的终浓度为5μM；Y-27632的终浓度为10μM。

表29

1000×Forskolin储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×Forskolin储液(2.44mL)的具体配方如表30所示。

表30

培养基D(100mL)的具体配方如表31所示。其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白FGF-10的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白Wnt-3a的终浓度为200ng/mL；人重组蛋白Noggin的终浓度为100g/mL；人重组蛋白R-spondin的终浓度为400ng/mL；人重组蛋白IL-2的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白IL-15的终浓度为20ng/mL；CHIR99021的终浓度为3μM；SB202190的终浓度为10μM；A83-01的终浓度为1μM；N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；Nicotinamide的终浓度为10mM；Cholera Toxin的终浓度为1nM；Y-27632的终浓度为10μM；Gastrin的终浓度为10nM。

表31

1000×人重组蛋白FGF-10储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白FGF-10储液(5mL)的具体配方如表32所示。

表32

1000×人重组蛋白Wnt-3a储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白Wnt-3a储液(2.5mL)的具体配方如表33所示。

表33

1000×人重组蛋白Noggin储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白Noggin储液(5mL)的具体配方如表34所示。

表34

1000×人重组蛋白R-spondin储液可用规格为1.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-80℃长期保存。1000×人重组蛋白R-spondin储液(4mL)的具体配方如表35所示。

表35

10000×CHIR99021储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×CHIR99021储液(1.16mL)的具体配方如表36所示。

表36

1000×SB202190储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×SB202190储液(1.51mL)的具体配方如表37所示。

表37

1000×A83-01储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。100000×A83-01储液(1.05mL)的具体配方如表38所示。

表38

1000×Nicotinamide储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×Nicotinamide储液(4mL)的具体配方如表39所示。

表39

1000×Cholera Toxin储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。10000×Cholera Toxin储液(1.17mL)的具体配方如表40所示。

表40

1000×Gastrin储液可用规格为0.5mL的离心管进行分装。分装后，可在-20℃长期保存。1000×Gastrin储液(48mL)的具体配方如表41所示。

表41

按照实施例2的方法制备妇科肿瘤微肿瘤模型，其中两个不同之处如下：将实施例2中步骤四的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基替换为培养基A(对应方案A)、培养基B即表22制备的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基(对应方案B)、培养基C(对应方案C)或培养基D(对应方案D)，实施例2中步骤四的步骤“每天观察细胞状态，直至细胞形成直径100μm左右的团块，之后每2-3天更换一次妇科肿瘤微肿瘤模型培养基以维持妇科肿瘤微肿瘤生长状态”替换为“培养3天，观察细胞状态”。每个方案处理10例卵巢癌样本、10例乳腺癌样本和10例子宫内膜癌样本。

培养3天后培养体系中形成的细胞团结构的情况如表42所示。

表42

可以看到，利用培养基A、培养基B和培养基C都可以进行妇科肿瘤微肿瘤模型的培养，而培养基D并不适合妇科肿瘤微肿瘤模型的形成。培养基B中形成的妇科肿瘤微肿瘤模型的成功率更高，获得微肿瘤的数量和体积更大，较培养基A和培养基C更有优势。

二、不同培养基形成的妇科肿瘤微肿瘤模型遗传背景比对

1、取待测样本，采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(天根，DP304)进行DNA提取；之后采用DNA测序建库试剂盒(NEB，E7645)进行建库；最后用Illumina HiSeq X-ten测序平台进行全基因组高通量测序(WGS)，测序深度30×。

待测样本分别为步骤一中一例卵巢癌原发手术病灶样本(原病灶)10mg以及利用该样本使用方案A、B、C培养得到的卵巢癌微肿瘤模型(约10

2、完成步骤1后，将原病灶和卵巢癌微肿瘤模型的测序结果分别进行拷贝数变异分析(CNV)，比较原病灶与卵巢癌微肿瘤模型之间的拷贝数变异。

结果如图5所示。结果显示，三种培养基培养得到的卵巢癌微肿瘤模型均可以很好的保留原病灶的拷贝数变异特征。在维持原病灶遗传背景方面，三种培养基并无显著差异。

三、不同培养基形成的妇科肿瘤微肿瘤模型细胞构成比对

取步骤一中的两例卵巢癌原发手术病灶样本、两例乳腺癌原发手术病灶样本、两例子宫内膜癌原发手术病灶样本以及利用该样本使用方案A、B、C培养得到的妇科肿瘤微肿瘤模型，按照实施例4的方法进行多重免疫荧光染色鉴定其细胞组成。

结果如表43所示。结果表明，培养基A、培养基B和培养基C都可以很好的保留原病灶中的肿瘤细胞，其形成的妇科肿瘤微肿瘤模型以较高纯度的肿瘤细胞组成。培养基B除了能够维持原病灶中肿瘤细胞的活性以外，还可以很好的保存组织中存在的成纤维细胞和T细胞，在维持细胞多样性方面相较培养基A和培养基C具有更大的优势。培养基C虽然也能在一定程度上维持细胞多样性，但在妇科肿瘤的微肿瘤培养中，其与培养基B相比存在较大劣势。

表43

因此，培养基B即表22制备的妇科肿瘤微肿瘤模型培养基可以最大程度的保护原病灶中的多种细胞类型，并在悬浮条件下促使其自发形成多细胞结构，构建极其接近原病灶特征的体外细胞模型。

实施例7、不同样本解离液培养成功率比较

配制样本解离液A、样本解离液B、样本解离液C和样本解离液D(表19所示)。样本解离液A、样本解离液B、样本解离液C和样本解离液D均现配现用。

样本解离液A(10mL)、样本解离液B(10mL)和样本解离液C(10mL)的具体配方如表44所示。

表44

按照实施例2的方法制备妇科肿瘤微肿瘤模型，其中不同之处如下：将样本解离液分别替换为样本解离液A、样本解离液B、样本解离液C和样本解离液D。每个样本解离液处理4例卵巢癌样本、4例乳腺癌样本和4例子宫内膜癌样本。培养3天后观察并统计培养体系中形成细胞团结构的情况。

结果见表45和表46。

表45.不同样本解离液妇科肿瘤微肿瘤形成数量统计

表46.不同样本解离液妇科肿瘤微肿瘤细胞团大小统计(以长径计单位μm)

结果表情，样本解离液的配方对妇科肿瘤微肿瘤模型的形成能力以及微肿瘤细胞团的大小有一定的影响。本发明使用的样本解离液(表19所示)可以温和解离组织中的细胞，最大程度的保持细胞活性，提高微肿瘤模型的形成效率和质量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。