一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺。

背景技术

生物制药技术飞速发展，生物药市场需求也越来越大。其中基于动物细胞培养的重组蛋白(抗体)、生长因子及疫苗等产品已占据主导地位。

常见的动物细胞培养方式包括分批培养，分批补料培养和灌流培养。灌流培养是一种连续培养细胞并持续收获的方法，可以通过不断流加新鲜培养基和排出细胞代谢副产物提供有利于细胞生长和生产目标产物的环境，解决产物质量不稳定或表达量偏低等问题，还可以通过提高单位体积产率来优化产能利用进而提高生产效率，因此灌流培养细胞也越来越受到关注。

在灌流培养细胞工艺中，需使用细胞截留装置将细胞保留在生物反应器等培养体系中。被报道的常见的截留装置为交替式切向流截留装置(ATF)，是一种由切向流截留装置(TFF)优化而来的系统。虽然ATF相比于TFF具有剪切力更低和延缓中空纤维柱污堵的优点，但在一些特定案例中，ATF污堵导致产物截留的缺点依然不可忽视。并且ATF与TFF系统均不能将小颗粒废物(细胞碎片或消泡剂成分等)排出，不利于长期连续培养细胞。

因此，需要提供一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺，以解决上述现有存在的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺，该工艺消除了产物即抗体的截留，并且具有更高的活细胞密度和活性，进而提高了产率。

为达到上述技术效果，本发明提供一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺，采用如下技术方案：

一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺，包括以下步骤：

步骤1、准备种子细胞；细胞株源自中国仓鼠卵巢细胞，即为CHO细胞，可表达特定的目标抗体产物；

步骤2、将步骤1中的种子细胞放入生物反应器培养，获得目标产物；具体的操作步骤如下：步骤2.1、生物反应器的准备，生物反应器中设置声波截留系统，同时配备天平和蠕动泵；步骤2.2、控制反应器内的反应条件，同时设置搅拌装置对反应器内的培养基进行搅拌；步骤2.3、配置培养基；步骤2.4、将步骤2.3中的培养基植入反应器中和步骤1中的种子细胞进行培养，并进行灌流和放流操作，以得到目标产物。

进一步的，所述步骤2.2中，使用碳酸氢钠溶液与二氧化碳气体由反应器自动控制pH在6.30～7.50范围；以培养基过夜通纯净空气后的溶解氧(DO)校准为100％，DO设置范围为15％～80％；DO由反应器自动控制通氧气流量控制，培养起始使用大孔径气体分散器通氧气，适时改用小孔径气体分散器通氧气，起始培养温度为37℃，D3～D7改为34℃。

进一步的，所述搅拌装置包括电机、与电机的输出端连接的连接轴、位于连接轴上的桨叶。

进一步的，所述步骤2.3中，采用两种培养基：基础培养基和生产培养基，基础培养基

进一步的，所述步骤2.4中，D1～D4开启灌流并适时切换为生产培养基；灌流速率为0.5～2.0RV/day；适时开启放流控制细胞密度，放流速率为0.1～0.3RV/day；通过流加葡萄糖溶液控制反应器内糖浓度，将糖浓度控制0.5～8g/L；培养30天结束，获得目标产物。

进一步的，所述步骤1的具体操作步骤如下：

步骤1.1、细胞复苏后，每2～5天传代，传代接种密度为0.3～1×10

步骤1.2、至接种反应器前2～5代，将培养基更换为

进一步的，所述步骤1.1中的二氧化碳摇床的转速80～150rpm，振幅50～100mm，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％；

步骤1.2中的二氧化碳摇床的转速80～150rpm，振幅50～100mm，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％

本发明的上述技术方案至少包括以下有益效果：

1、细胞生长状态更优；本发明可维持更高的活细胞密度(VCD)和活率(VIA)，直至D30培养结束时，活细胞密度(VCD)约为50×10

2、消除了目标产物的截留问题；本发明的反应器内抗体浓度与收获液抗体浓度始终保持一致(相差5％以内)，产物截留率几乎为0％；而交替式切向流截留装置(ATF)工艺抗体截留率不断升高，直至结束培养时收获液中抗体浓度仅为反应器内的50％，产物截留率达到50％；

3、提高产量；本发明的单细胞日产率(QP)及收获液中抗体日平均浓度分别是交替式切向流截留装置(ATF)工艺的1.2倍和1.5倍。

附图说明

图1为本发明实施例与对比例中细胞密度与活率数据图；

图2为本发明实施例与对比例中产物截留率的数据图；

图3为本发明实施例与对比例中单细胞日产率(QP)的数据图；

图4为本发明实施例与对比例中收获液抗体浓度的数据图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图1-4，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

如图1-4所示：一种使用声学截留装置灌流培养细胞生产抗体的工艺，包括以下步骤：

步骤1、准备种子细胞；细胞株源自中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)，可表达特定的目标抗体产物；所述步骤1的具体操作如下：步骤1.1细胞复苏后，每2～5天传代，传代接种密度为0.3～1×10

所述步骤1.1中的二氧化碳摇床的转速80～150rpm，振幅50～100mm，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％；步骤1.2中的二氧化碳摇床的转速80～150rpm，振幅50～100mm，培养温度37℃，二氧化碳浓度5％。

步骤2、将步骤1中的种子细胞放入生物反应器培养：具体的操作步骤如下：步骤2.1、生物反应器的准备，生物反应器中设置声波截留系统，同时配备天平和蠕动泵；生物反应器选用规模为体积3L，培养体积为1～2L，

步骤2.2、控制反应器内的反应条件，同时设置搅拌装置对反应器内的培养基进行搅拌；使用碳酸氢钠溶液与二氧化碳气体由反应器自动控制pH在6.30～7.50范围；以培养基过夜通纯净空气后的溶解氧(DO)校准为100％，DO设置范围为15％～80％；DO由反应器自动控制通氧气流量控制，培养起始使用大孔径气体分散器通氧气，适时改用小孔径气体分散器通氧气，起始培养温度为37℃，D3～D7改为34℃。

所述搅拌装置包括电机、与电机的输出端连接的连接轴、位于连接轴上的桨叶，适时调整转速，可接受范围为80～400rpm。

步骤2.3、配置培养基；采用两种培养基：基础培养基和生产培养基，基础培养基

步骤2.4、将步骤2.3中的培养基植入反应器中和步骤1中的种子细胞进行培养，并进行灌流和放流操作，以得到目标产物，D1～D4开启灌流并适时切换为生产培养基；灌流速率为0.5～2.0RV/day；适时开启放流控制细胞密度，放流速率为0.1～0.3RV/day；通过流加葡萄糖溶液控制反应器内糖浓度，将糖浓度控制0.5～8g/L；培养30天结束，获得目标产物。

具体的实施过程如下：

a.D0：细胞以0.6～1.4×106cells/mL的密度接种于生物反应器，使用基础培养基培养，接种日记为第0天(D0)。

b.D1：开启灌流培养，灌流速率为0.5RV/day。声波截留装置功率设置为2W，每运行10min间断3s。灌流培养基为基础培养基。

c.D2：灌流速率提高至0.8RV/day。

d.D3：灌流速率提高至1.0RV/day。

e.D6：声波截留装置功率设置为3W，每运行5min间断3s。灌流培养基更换为生产培养基，灌流速率为1.0RV/day。培养温度改为34℃。开启放流，放流速率0.25RV/day。

f.D8：放流速率改为0.2RV/day。

g.D10：放流速率改为0.15RV/day。

h.D30：培养结束。

对比例

对比例中除截留装置使用交替式切向流截留装置(ATF)，其它内容均与实施例中的内容一致。

试验结论

如图1所示，从细胞密度与活率的数据可知，BioSep工艺中的VCD与VIA均优于ATF工艺。

如图2所示，从产物截留率的数据可知。BioSep工艺产物截留率始终几乎为0，ATF工艺产物截留率不断上升直至50％左右。

如图3所示，从单细胞日产率(QP)的数据可知，BioSep工艺的QP优于ATF工艺，并呈上升趋势。

如图4所示，从收获液抗体浓度的数据可知，BioSep工艺的收获液抗体浓度高于ATF工艺。

以上是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。