一株能降解PAEs的反硝化无色杆菌LJC-02及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。更具体地，涉及一株能降解PAEs的反硝化无色杆菌LJC-02及其应用。

背景技术

塑化剂广泛用作塑料工业的增塑剂和软化剂，是塑料的重要组成成分。PAEs作为外增塑剂，与塑料基质间以氢键与范德华力结合而不是化学键，因此易于释放出塑料制品之外，在河口处水体、沉积物和动植样品中广泛检出。PAEs结构稳定、不易降解，具有“致畸、致癌、致突变”等毒性和累积性，严重破坏水体中微生物群落结构和功能多样性，抑制水环境中多种污染物的自净能力。

微生物降解是PAEs自净的重要途径。众所周知，PAEs污染环境中自身蕴含着多种降解微生物，已报道的PAEs降解微生物主要为细菌和真菌，如：细菌普罗威登斯菌属(Providencia)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，分枝杆菌属 ()Mycobacterium和真菌毛霉(Mucor)，亚粘团镰孢霉(Fusarium Subglutinans)，绳状青霉(PenicilliumFuniculosum)等。细菌由于强适应能力和多样性，在PAEs 生物降解中发挥主要作用。目前，已有一定量的PAEs降解菌被分离报道(分离于城市废水、土壤、淤泥等)。然而，陆海交汇区中PAEs降解微生物却鲜有报道。目前已知分离于高盐胁迫下的降解菌仅有燕井鞘鞘氨醇单胞菌 (Sphingomonas yanoikuyae)DOS01，粘质红酵母(Rhodotorula mucilaginosa) Mar-Y3及海洋丝状真菌花斑曲霉(Aspergillus versicolor)IR-M4等。但不同的环境条件，微生物降解PAEs方式亦不相同。好氧条件下，PAEs水解生成单酯和相应的醇化合物，接着在酶催化下将中间产物代谢为邻苯二甲酸(PA)，同时生成醇类物质(上游途径)。邻苯二甲酸开环形成相应的有机酸，再转化成丙酮酸、琥珀酸和延胡索酸等进入三羧酸循环，最后降解为CO

入海河口处有机污染常常伴随着氨氮超标等水体富营养化问题。长期以来厌养反硝化菌被认为是唯一能够进行反硝化作用的细菌。由于现实环境复杂，厌养反硝化在真实的生态系统中，是比较难实现的。好氧反硝化菌是上世纪80年代发现的可同时进行氧气和硝酸盐呼吸的功能微生物。好氧反硝化菌打破了传统厌氧反硝化的壁垒，在水体溶解氧存在条件下可将亚硝态氮、硝态氮代谢为氮气。好氧反硝化菌是自然环境中常见的细菌之一，环境适应性强、生长速率快、繁殖周期短，具有较高的遗传适应性，在多种不同自然水生态环境的脱氮自净过程中起到关键作用。目前从环境中分离出来的好氧反硝化菌主要有假单胞菌 (Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、芽孢杆菌(Bacillus)、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)、硫杆菌(Thiobacillus)等。近年来更多的高效好氧反硝化菌株得到分离，并因其工艺简单、脱氮效果好、不需补加酸碱等优势，被广泛应用于大面积污染水域修复。

截至目前，单一可降解PAEs或进行反硝化作用的无色杆菌已有大量的研究报道，然而在好氧条件下能同时将水体中的PAEs和硝酸盐氮同步去除且能够耐受较高盐浓度的降解菌报告相对较少。针对入海河口处水体PAEs和硝酸盐氮共存的问题，如何有效的同时去除这两种污染物成为人们关注的焦点。因此，发掘兼具PAEs去除能力和好氧反硝化性能的细菌，并将其应用于入海河口处生活和工业污水排放口，将会有效削减二者对环境污染的毒害，为正在开展的污染物入海总量控制的陆海统筹污染防治和生态环境保护提供科学支撑。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述的缺陷和不足，提供一株能降解PAEs 的反硝化无色杆菌LJC-02及其应用。

本发明的第一个目的是提供一株反硝化无色杆菌LJC-02。

本发明的第二个目的是提供所述反硝化无色杆菌LJC-02菌株的新应用。

本发明的第三个目的是提供一种降解邻苯二甲酸酯和/或废水脱氮的菌剂。

本发明的第四个目的是提供一种降解邻苯二甲酸酯和/或脱氮的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明在广东省湛江市霞山区入海河口沉积物中分离得到一株兼具DEHP 去除和好氧反硝化能力的无色杆菌(Achromobacter denitrificans)LJC-02，该菌株已于2021年9月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100大院59号楼5楼，保藏号为GDMCC No：61971。LJC-02菌株的菌落形态呈圆形，表面隆起，乳白色，不透明，湿润、光滑且突起。菌株经革兰氏染色为阴性；过氧化氢酶活性、氧化酶活性、淀粉水解酶活性、明胶液化和脲酶反应均为阳性；葡萄糖和麦芽糖水解、吲哚反应均呈阳性。LJC-02菌株的适宜生长条件为：温度范围为20-40℃，pH范围为5-8，盐浓度范围为0-4％，接种量范围为1-7％。LJC-02菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明研究显示，LJC-02菌株可在高盐度及好氧条件下进行好氧反硝化作用，当硝酸盐含量为100-400mg/L时，LJC-02的脱氮性能较好，NO

因此，本发明提供所述反硝化无色杆菌LJC-02菌株在降解邻苯二甲酸酯和/ 或脱氮、在修复邻苯二甲酸酯污染环境或在制备降解邻苯二甲酸酯和/或废水脱氮的菌剂中的应用。

进一步地，所述邻苯二甲酸酯污染环境为土壤或水体污染。

优选地，为入海河口处污染。

优选地，所述邻苯二甲酸酯为邻苯二甲酸二酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二烯丙酯、邻苯二甲酸二辛酯或邻苯二甲酸二乙酯中的一种或多种。

本发明提供一种降解邻苯二甲酸酯和/或废水脱氮的菌剂，含权反硝化无色杆菌LJC-02菌株或其菌液。

优选地，所述菌液浓度不低于2.0×10

本发明提供一种降解邻苯二甲酸酯和/或脱氮的方法，其特征在于，采用反硝化无色杆菌LJC-02菌株对待处理样本进行处理。

优选地，所述LJC-02菌株接种量为1-7％，处理时盐浓度范围为0-4％，硝酸盐含量为100-400mg/L，邻苯二甲酸二酯浓度为100-500mg/L。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明提供的反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)LJC-02 能够有效将降解不同PAEs(DEHP、DMP、DBP、DAP、DOP、DEP)污染物，降解率均能达到80％以上，其中对长酯链的PAEs的降解效果最佳，属于高效降解菌，对于PAEs的降解和修复PAEs污染环境方面具有重要的现实意义和价值。

(2)本发明提供的LJC-02菌株在使用过程中无污染，无公害，能以硝酸盐氮或DEHP为唯一碳源进行好氧反硝化作用，进行脱氮，同时能将DEHP去除，在好氧阶段即可实现DEHP和硝酸盐氮的同步去除。同时，对盐度具有较好的耐受能力，使其在高盐、高硝态氮和高DEHP环境中依然具有较高的降解效率。本发明提供的LJC-02菌株具有良好的PAEs去除能力和好氧反硝化性能，可广泛应用于入海河口处PAEs污染的修复和治理，具有较好的经济价值和应用前景。

附图说明

图1为LJC-02菌株的形态特征；

图2为LJC-02菌株的系统发育树；

图3为LJC-02菌株的最佳生长条件；

图4为LJC-02菌株在不同硝酸盐浓度下的脱氮性能；

图5为LJC-02菌株对不同PAEs的降解性能；

图6为LJC-02菌株对不同浓度DEHP的降解性能；

图7为LJC-02菌株在高硝酸盐条件下同步去除DEHP和脱氮的性能。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中采用的培养基如下所示：

反硝化培养基：4.72g/L CH

高硝酸盐培养基：4.72g/L CH

无机盐培养基：(NH

LB培养基组成如下：10.0g/L蛋白胨，5.0g/L NaCl，10.0g/L酵母提取物， pH＝7.0±0.2。

采用的平板固体培养基为相应的培养基中加入20g的琼脂。

LJC-02菌株的16S rDNA的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO:1：TTATGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGGA TGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGA TAACTACGCGAAAGCGTAGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGC AGGGGATCGCAAGACCTTGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAG AGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCCAT CCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGGCAGGAA AGAAACGTCGCGGGTTAATACCTCGCGAAACTGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAG CGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGC GTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCTTCGGGCCTTGGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGC AAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATG ATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATGCCGAAGAGATTTGGCAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACA GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAAT GAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCT CATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTCGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCCCAGAAACCCGATCGTAGTC CGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGC CCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACT

实施例1菌株的富集、分离、纯化和特性鉴定

(1)降解菌的富集

从广东省湛江市霞山区入海河口沉积物中采集沉积物样品，在无菌操作下，准确称取10g沉积物样品放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中(加玻璃珠)，摇床振荡30min，使样品与水充分混合，将细胞分散，形成均匀的菌悬液。静置 20-30s，再吸取2mL上清液到含有100mg/L的DEHP无机盐培养基中(以DEHP 作为唯一氮源)，在30℃，180rpm条件下避光震荡培养。培养5d后，再次以 2％接种量接种于200mg/L DEHP的无机盐培养基中，在相同条件下培养，依次类推，直至无机盐培养基中DEHP浓度为500mg/L。每次富集培养都有不加菌液的空白对照。

(2)降解菌的分离和纯化

将DEHP驯化浓度为500mg/L时的富集培养物分别稀释为10

(3)反硝化性能测定

将已纯化的单一高效DEHP降解菌接种于反硝化鉴定培养基培养2-3d，菌株因其反硝化作用导致培养基pH升高，由于BTB的酸碱指示剂特性，培养基将由绿色变蓝色，可初步筛选出确定具有反硝化性能的菌株，并可根据变色程度初步推断其反硝化能力大小。此外，对BTB的硝态氮和亚硝态氮进行检测，以硝态氮和亚硝态氮清除率最高为主要指标，筛选出兼具去除DEHP和高效好氧反硝化能力的菌株，将菌株命名为LJC-02。

(3)菌株特性鉴定

3.1菌株形态特性

LJC-02菌株为革兰氏阴性菌，菌落特征如图1所示，在LB培养基上培养 24h后形成的菌落呈圆形，表面隆起，乳白色，不透明，湿润、光滑且突起。

3.2菌株生理生化特性

LJC-02菌株经革兰氏染色为阴性；过氧化氢酶活性、氧化酶活性、淀粉水解酶活性、明胶液化和脲酶反应均为阳性；葡萄糖和麦芽糖水解、吲哚反应均呈阳性。

3.3分子生物学特性

采用试剂盒法提取细菌总DNA。采用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R， PCR扩增细菌的16S rDNA，在1400bp附近出现明显的条带，将PCR扩增产物回收后进行序列测定，LJC-02菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。将获得的DNA序列在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行 Blast比对分析，并利用MEGA软件(版本：7.0)构建系统发育树如图2所示，结果发现本发明菌株的16S rDNA序列和与GenBank中无色杆菌属(Achromobacter sp.)中反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)具有较高的同源性。结合上述的形态特性、16S rDNA序列的结果，将本发明分离得到的菌株鉴定为反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans)，命名为LJC-02，并于2021年9月30日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No： 61971，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2LJC-02菌株的最佳生长条件实验

(1)温度对菌株生长的影响

将菌株LJC-02的种子液(OD

(2)pH对菌株生长的影响

将菌株LJC-02的种子液(OD

(3)盐浓度对菌株生长的影响

将菌株LJC-02的种子液(OD

(4)接种量对菌株生长的影响

将菌株LJC-02的种子液(OD

结果如图3所示，菌株LJC-02的适宜培养条件为：温度范围为20-40℃，pH 范围为5-8，盐浓度范围为0-4％，接种量范围为1-7％。

实施例3LJC-02在不同硝酸盐浓度条件下的脱氮性能实验

将菌株LJC-02的种子液(OD

结果如图4所示，当硝酸盐含量为100-400mg/L时，菌株LJC-02对脱氮性能较好，NO

实施例4LJC-02对不同PAEs的降解性能实验

将菌株LJC-02的种子液(OD

结果如图5所示，菌株LJC-02对DEHP、DOP和DAP有较好的降解效果，降解率分别为97.20％、91.84％和94.73％，对DMP、DBP和DEP的降解效果略差，降解率分别为88.02％、76.08和82.59％。因此，推测菌株LJC-02偏爱降解具有长酯链的PAEs。

实施例5LJC-02对不同浓度DEHP的降解性能实验

将菌株LJC-02的种子液(OD

结果如图6所示，当DEHP浓度为100-300mg/L时，菌株LJC-02对DEHP 的降解能力较好，DEHP降解率均在80％以上。当DEHP浓度大于300mg/L时，菌株LJC-02对DEHP的降解性能较差。因此，菌株LJC-02可在DEHP浓度为 100-300mg/L存在的条件下有效降解DEHP。

实施例6LJC-02在高硝酸盐存在条件下同步去除DEHP和脱氮性能测试

将菌株LJC-02的种子液(OD

结果如图7所示，当DEHP浓度为100-200mg/L DEHP时，菌株LJC-02去除DEHP和脱氮性能较好，DEHP降解率均在90％以上，NO

实施例7LJC-02在实际入海河口处同步去除DEHP和脱氮性能实验

针对菌株LJC-02的良好的PAEs去除能力和好氧反硝化性能，用于高盐高硝态氮和高DEHP的入海河口污染水体修复治理中。本实施例中使用的入海河口污染水体取自广东省湛江市南流河入海口附近海域。将菌株LJC-02的种子液 (OD

结果如表1所示，在空白处理中，脱氮效果在DEHP存在条件下受到了较大的限制。相反地，在投入菌株LJC-02强化后的处理中，96h后入海河口污染水体的硝酸盐氮去除率为89.62％，总氮去除率为77.85％，DEHP降解率为90.38％。

表1接菌与未接菌对入海河口污染水体的处理情况

综上所述，本发明提供的反硝化无色杆菌(Achromobacter denitrificans) LJC-02能够有效将降解不同PAEs(DEHP、DMP、DBP、DAP、DOP、DEP) 污染物，降解率均能达到80％以上，其中对长酯链的PAEs的降解效果最佳，属于高效降解菌，对于PAEs的降解和修复PAEs污染环境方面具有重要的现实意义和价值。LJC-02菌株在使用过程中无污染，无公害，能以硝酸盐氮或DEHP 为唯一碳源进行好氧反硝化作用，进行脱氮，同时能将DEHP去除，在好氧阶段即可实现DEHP和硝酸盐氮的同步去除。同时，对盐度具有较好的耐受能力，使其在高盐、高硝态氮和高DEHP环境中依然具有较高的降解效率。本发明提供的 LJC-02菌株具有良好的PAEs去除能力和好氧反硝化性能，可广泛应用于入海河口处PAEs污染的修复和治理，具有较好的经济价值和应用前景。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。