HER2结合多肽及其用途
文献发布时间：2023-06-19 19:28:50
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种HER2结合多肽及其用途。
背景技术
人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor receptor 2，HER2)，为表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)家族成员之一，在多种肿瘤组织中均有不同程度的表达。HER2扩增或过表达与肿瘤高侵袭性、易复发、死亡率增加密切相关。
癌症的治疗常规治疗方法包括手术、放化疗等方式，在产生一定治疗效果的同时也对其他正常细胞产生了杀伤毒性。虽然在近年出现了靶向治疗，也在一定程度上延长了患者的生存时间，但靶向治疗容易出现耐药性，比如乳腺癌采用曲妥珠单抗治疗后一年左右会出现比较明显的耐药性。因此需要一种有不同杀伤机制的放射性靶向治疗药物作为另一种治疗选择。在靶向结合到肿瘤部位后，放射性靶向治疗药物可通过放射性核素释放的射线对肿瘤细胞进行放射性物理杀伤。
本领域需要能够用于检测表达HER2的细胞的检测剂以及靶向HER2阳性肿瘤的治疗剂，为HER2阳性肿瘤患者提供有效的分子影像学手段和靶向治疗手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种HER2结合多肽，以及进一步得到的诊疗核素标记物及制备方法与应用。
一方面，本申请提供了一种HER2结合多肽，其与参比抗体竞争结合HER2蛋白，其中所述参比抗体包含重链可变区(VH)；其中所述VH包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其在ELISA试验中，所述的HER2结合多肽能够以不超过约1.20E-09的K
在某些实施方式中，其中所述HER2结合多肽具有以下性质中的一种或多种：
(i)其能够与A3亲和层析柱的填料结合；
(ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其能够以相同或更高的亲和力与HER2结合；
(iii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其具有增加的表达量；和
(iv)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其等电点提高。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、VHH和/或dAb。
在某些实施方式中，其中所述VHH是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方式中，其包含SEQ ID NO:158，SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:12中任一项所示氨基酸序列中的至少一个CDR。
在某些实施方式中，其包含SEQ ID NO:158，SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:12中任一项所示氨基酸序列中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:86和SEQ IDNO:87所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:88和SEQ IDNO:89所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:90、SEQ IDNO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95或SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:160所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:161所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45中任一项所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:86或SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQID NO:38，SEQ ID NO:90，SEQ ID NO:91，SEQ ID NO:92，SEQ ID NO:93，SEQ ID NO:94，SEQID NO:95或SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含SEQ ID NO:158，SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:118至SEQ ID NO:157中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包含至少一个VH。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包括纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ IDNO:158，SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包括纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:118至SEQ ID NO:157中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的HER2结合多肽。
另一方面，本申请提供了一种构建体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的构建体。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请所述的HER2结合多肽的方法，包括在允许所述HER2结合多肽表达的条件下培养本申请所述的细胞。
在某些实施方式中，所述方法还包括回收由所述细胞表达的HER2结合多肽。
在某些实施方式中，所述方法还包括纯化和/或修饰所述HER2结合多肽。
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含本申请所述的HER2结合多肽。
在某些实施方式中，所述免疫缀合物包含：
i)本申请所述的HER2结合多肽；
ii)选自下组的缀合部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记物选自下组的一种或多种试剂：放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子和酶。
在某些实施方式中，其中所述放射性核素适用于医学成像和/或治疗。
在某些实施方式中，其中所述放射性核素包括
在某些实施方式中，其中所述HER2结合多肽直接或间接与所述可检测标记物缀合。
在某些实施方式中，其中所述HER2结合多肽通过螯合剂与所述可检测标记物缀合。
在某些实施方式中，其中所述螯合剂选自DTPA、EDTA、NOTA、DOTA、TRAP、TETA、NETA、CB-TE2A、Cyclen、Cyclam、Bispidine、TACN、ATSM、SarAr、AmBaSar、MAG3、MAG2、HYNIC、DADT、EC、NS3、H2dedpa、HBED、DFO、PEPA、HEHA及它们的衍生物中的一种或多种。
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的构建体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
在某些实施方式中，所述组合物包含本申请所述的HER2结合多肽或本申请所述的免疫缀合物，所述组合物为检测剂或治疗剂。
在某些实施方式中，其中所述检测剂为用于检测HER2蛋白的试剂。
在某些实施方式中，其中所述检测剂为造影剂。
在某些实施方式中，其中所述造影剂为检测HER2蛋白的造影剂。
在某些实施方式中，其中所述治疗剂用于治疗肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述治疗剂用于治疗HER2阳性肿瘤。
另一方面，本申请提供了本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的构建体、本申请所述的细胞、本申请所述的免疫缀合物和/或本申请所述的组合物在制备药剂、试剂、检测板或试剂盒中的用途；
其中所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中HER2蛋白；
其中所述药剂用于检测HER2蛋白的表达和/或治疗表达HER2的肿瘤。
另一方面，本申请提供了重组蛋白，所述的重组蛋白包含本申请所述的HER2结合多肽。
在某些实施方式中，其中所述的重组蛋白包含：(i)本申请所述的HER2结合多肽；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
另一方面，本申请提供了一种检测生物学样品中HER2的存在和/或量的方法，包括：使所述生物学样品接触本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的组合物。
在某些实施方式中，其中所述接触在体外或离体进行。
在某些实施方式中，其中所述生物学样品为组织。
在某些实施方式中，其中所述组织选自血液组织、淋巴组织和肿瘤组织。
在某些实施方式中，所述方法包括检测生物学样品中HER2阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中通过成像确定生物学样品中HER2阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中通过流式细胞术确定生物学样品中HER2阳性细胞的存在和/或量。
另一方面，本申请提供了一种检测和/或诊断与HER2表达异常相关的疾病或病症方法，包括向有此需要的受试者施用本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物。
在某些实施方式中，其中所述方法还包括对所述受试者进行成像。
在某些实施方式中，其中所述成像包括ECT成像。
在某些实施方式中，其中所述ECT成像包括SPECT成像或PET成像。
在某些实施方式中，其中所述与HER2表达异常相关的疾病或病症包括肿瘤。
另一方面，本申请提供了一种治疗和/或预防肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于监测抗肿瘤疗法在受试者中的功效的方法，所述方法包含：
(i)给患有肿瘤且采用抗肿瘤疗法治疗的受试者施用本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物；和
(ii)确定所述受试者的肿瘤中HER2阳性细胞的量。
在某些实施方式中，通过成像确定所述受试者的肿瘤中HER2阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括HER2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、食管癌、胆管癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、子宫颈鳞状细胞癌、唾液腺瘤、膀胱癌、肺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、骨肉瘤、儿童成神经管细胞瘤等肿瘤中的至少一种。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-1C显示的是本申请所述抗Her2抗体与N87细胞的结合情况；
图2显示的是本申请所述抗Her2抗体H1的KD亲和力检测结果；
图3显示的是本申请所述抗Her2抗体H2的KD亲和力检测结果；
图4A-4B显示的是本申请所述抗Her2抗体与Herceptin的表位竞争结果；
图5显示的是本申请所述抗Her2抗体H1(Her2-Nb1)与BT474细胞的结合情况；
图6显示的是本申请所述抗Her2抗体H1与MCF7细胞的结合情况；
图7显示的是本申请所述抗Her2抗体H1与BT474细胞的单点结合情况；
图8显示的是本申请所述抗Her2抗体H1的内化结果；
图9显示的是本申请所述
图10显示的是本申请所述
图11显示的是本申请所述
图12显示的是本申请所述
图13显示的是本申请所述
图14显示的是本申请所述
图15A-15B显示的是本申请所述H1抗体突变前后抗体纯化后SDS-PAGE分析结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“HER2”通常指属于表皮生长因子受体家族的I型跨膜蛋白，又称为c-erbB2、ErbB2或Neu。术语“HER2”还涵盖HER2的同系物、变体和同等型，包括剪接同等型。HER2与人乳腺癌细胞中的肿瘤转化相关，如已在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、腹膜癌或结肠肠癌的患者中检测到HER2蛋白的过量表达。术语“HER2阳性”和“表达HER2”在本申请中可互换使用。“HER2阳性”肿瘤包含具有高于正常水平的HER2的肿瘤细胞。HER2阳性肿瘤的实例包括HER2阳性乳腺癌和HER2阳性胃癌。任选地，HER2阳性是过度表达HER2的癌症，并且在某些实施方案中，HER-2阳性癌症具有2+或3+的免疫组织化学(IHC)评分和/或原位杂交(ISH)扩增率≥2.0。
在本申请中，术语“HER2结合多肽”意指任何能够特异性结合HER2的多肽。在一些实施方案中，结合多肽是抗体。在其它实施方案中，结合多肽是例如抗体模拟物、细胞因子或生长因子。例如本申请的特异性结合HER2的单域抗体。“HER2结合多肽”或者可以指结合HER2的单价多肽(即与HER2的一个表位结合的多肽)，以及二价或多价结合多肽(即结合一个以上表位的结合多肽)。本申请的“HER2结合多肽”可以包含至少一个结合HER2的可变结构域。在一些实施方案中，本申请的“HER2结合多肽”可以包含2、3、4或更多个结合HER2的可变结构域。本申请的HER2结合多肽除结合HER2的可变结构域外也可包含接头和/或具有效应器功能的部分，例如半衰期延长部分(如结合血清白蛋白的可变结构域)、和/或融合配偶体(如血清白蛋白)和/或缀合的聚合物(如PEG)和/或Fc区。在一些实施方案中，本申请的“HER2结合多肽”还涵盖双特异性抗体，其含有结合不同抗原的可变结构域。
在本申请中，术语“抗体”是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Milleretal(2003)Jour.ofImmunology170:4854-4861)，即结合HER2。抗体可以是鼠、人、人源化、嵌合抗体，或源于其它物种。
全长抗体典型地是指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。
“全长抗体重链”通常是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。在一些实施方式中，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”通常是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE)。
在本申请中，术语“抗原结合片段”通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。Fd片段例如具有两个VH区并且通常保留完整抗原结合结构域的一些抗原结合功能。抗体的抗原结合片段的实例包括(1)Fab片段，具有VL、VH、恒定轻链(CL)和CH1结构域的单价片段；(2)F(ab’)
在本申请中，术语“可变结构域”通常是指能够特异性结合抗原表位的抗体的可变结构域。例如，抗体可变结构域VH及VL(VH结构域及VL结构域)。可变结构域的另一实例为“VHH结构域”(或简称为“VHH”)。“VHH结构域”，亦称为重链单域抗体、VHH、V
在本申请中，“可变结构域”通常具有相同的大体结构，每个结构域包含4个序列高度保守的框架(FR)区，其中，FR区包括“框架区1”或“FR1”、“框架区2”或“FR2”、“框架区3”或“FR3”、及“框架区4”或“FR4”的四个“框架区”，FR区“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”、及“互补决定区3”或“CDR3”的三个“互补决定区”或“CDR”连接。可变结构域的一般结构或序列可表示为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗体可变结构域因具有抗原结合位点而赋予抗体对抗原的特异性。
在本申请中，术语“CDR”通常是指抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDR，对于每个可变区，其称为CDR1、CDR2和CDR3。这些CDR的精确界限已经根据不同系统进行了不同定义。Kabat描述的系统(Kabat等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且还提供了定义这三个CDR的精确残基界限。这些CDR可称为Kabat CDR。Chothia及其同事(Chothia&；Lesk，J.MoI.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等人，Nature 342:877-883(1989))发现，Kabat CDR内的一些亚部分几乎采取了相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大差异。这些亚部分指定为L1、L2和L3，或者H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别是指轻链和重链区域。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的界限。Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(JMoI Biol 262(5):732-45(1996))中已经描述了定义与Kabat CDR重叠的CDR的其他界限。其他CDR界限可能没有严格遵照一个上述系统，但是仍然与Kabat CDR重叠，尽管根据以下预测或实验发现，他们可以被缩短或延长，特定残基或残基组或甚至整个CDR没有显著影响抗原结合。除非在说明书中另有明确说明，如本申请所用，术语“CDR”、“HCDR1”、“HCDR2”、“HCDR3”、“LCDR1”、“LCDR2”和“LCDR3”包括上文所述的任何方法(Kabat、Chothia或IMGT)所定义的CDR。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即集群中的个别抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点在于它们可以通过杂交瘤培养合成，不受其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，本申请使用的单克隆抗体可以在杂交瘤细胞中制备，或者可以通过重组DNA方法制备。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指非人抗体(例如小鼠抗体)的CDR区以外的部分或全部有的氨基酸被源自人免疫球蛋白的相应的氨基酸置换的抗体。在CDR区中，氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰也可以是允许的，只要它们仍保留抗体结合特定抗原的能力。人源化抗体可任选地包含人类免疫球蛋白恒定区的至少一部分。“人源化抗体”保留类似于原始抗体的抗原特异性。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式可以最低限度地包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白(受体抗体)中的CDR区残基用具有所期望性质、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠，大鼠，家兔或非人灵长类动物)的CDR区残基替换。在某些情形中，可以将人免疫球蛋白的FR区残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有的氨基酸修饰。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能，诸如结合亲和力。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指将人类编码抗体的基因转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达的抗体。抗体所有部分(包括抗体的可变区和恒定区)均由人类来源的基因所编码。全人源抗体可以大大减少异源抗体对人体造成的免疫副反应。本领域获得全人源抗体的方法可以有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽技术等。
在本申请中，术语“参比抗体”通常是指本申请所述抗原结合蛋白与之竞争结合抗原(例如HER2)的抗体。
当在竞争相同表位的抗原结合蛋白上下文中使用的术语“竞争”通常表示抗原结合蛋白之间的竞争，如通过其中被测试的抗原结合蛋白(例如，抗体或其免疫功能片段)预防或抑制(例如，减少)参比抗原结合蛋白(例如，配体或参比抗体)与共同抗原(例如，HER2或其片段)特异性结合的测定所确定的。许多类型的竞争性结合测定可用于确定一个抗原结合蛋白是否与另一个竞争，例如：固相直接或间接放射性免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如，Stahli等人，1983，Methods inEnzymology9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Kirkland等人，1986，J.Immunol.137：3614-3619)固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如，Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见例如，Morel等人，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如，Cheung等人，1990，Virology176：546-552)；和直接标记RIA(Moldenhauer等人，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，这种测定涉及与固体表面结合的纯化抗原或者携带这些任何一个的单元、未标记的测试抗原结合蛋白和标记的参比抗原结合蛋白的使用。竞争性抑制通过测定在测试抗原结合蛋白存在下于固体表面或单元结合的标记的量来测量。通常，测试抗原结合蛋白过量存在。通过竞争测定鉴定的抗原结合蛋白(竞争抗原结合蛋白)包括与参比抗原结合蛋白结合相同表位的抗原结合蛋白和与参比抗原结合蛋白结合的表位足够靠近而发生空间位阻的相邻表位结合的抗原结合蛋白。通常，当竞争抗原结合蛋白过量存在时，它使参比抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合抑制(例如，减少)至少约40-45％、约45-50％、约50-55％、约55-60％、约60-65％、约65-70％、约70-75％或约75％或更多。在一些情况下，结合被抑制至少约80-85％、约85-90％、约90-95％、约95-97％或约97％或更多。
在本申请中，术语“序列同一性”通常是指是使用序列比对程序比对时，两个或多个比对的序列相同的核酸或氨基酸序列。在此的术语“％序列同一性”通常指的是使用序列比对程序比对时，两个或多个比对序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。用于评价氨基酸或核苷酸之间的序列相同性程度的方法是本领域技术人员已知的。例如，氨基酸序列相同性通常使用序列分析软件来测量。例如，可使用NCBI数据库的BLAST程序来确定相同性。对于序列相同性的确定，可以参见例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics andGenome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993；Computer Analysisof Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,NewJersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,20von Heinje,G.,AcademicPress,1987和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,MStockton Press,New York,1991。
在本申请中，氨基酸残基将根据如本领域中公知且达成一致的标准三字母或一字母氨基酸编码加以表示。在比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”通常是指与另一序列相比，在参考序列某一位置处指定数目氨基酸残基的插入、缺失或取代。在一些实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。在一些实施方式中，所述取代为非保守氨基酸取代，例如，Ala被Asp、Asn、Glu或Gin取代。
在本申请中，术语“亲和力”通常是指分子(例如，多肽或抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，靶标或抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的的常用方法测量，诸如表面等离子体共振，并且还包括本申请所报道的那些方法。分子X对其结合配偶体Y的较高的亲和力可见于较低的Kd值和/或EC
在本申请中，术语“分离的”通常是指至少部分从在其天然状态中通常与其结合的其他分子中分离的分子(例如抗体、核酸等)。“分离的多肽”基本上没有其他生物分子，如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物、细胞碎片和生长培养基。“分离的核酸”通常以不同于其天然发现的形式或背景存在。
在本申请中，术语“构建体”通常是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列或“编码核酸序列”可包括与调控元件可操作地连接的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用了所述核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和聚腺苷酸化信号。实例包括但不限于环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。
在本申请中，术语“免疫缀合物”通常是指抗体或其抗体片段与其它活性剂连接而形成的缀合物，诸如化疗剂，毒素，免疫治疗剂，放射性元素、成像探针，光谱探针等等。所述连接可以是共价键，或例如通过静电力的非共价相互作用。可以使用本领域中已知的多种接头以形成免疫缀合物。该缀合物可以通过所述抗体或其抗原结合片段与靶细胞上的抗原特异性结合，将所述其他试剂递送至靶细胞(例如，肿瘤细胞)。此外，该免疫缀合物可以以融合蛋白的形式提供，所述融合蛋白可以从编码该免疫缀合物的多核苷酸表达。
在本申请中，术语“螯合剂”通常是指能够与金属离子形成络合物的有机分子。螯合剂常用来标记物蛋白质或肽。金属离子缀合物的终产物用于放射免疫检测、放射免疫疗法、磁共振成像、光动力疗法或其他相似的模式。螯合剂或络合剂的非限制性例子是DTPA(二亚乙基三胺五乙酸酐)和其衍生物，NOTA(1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N’,N”-三乙酸)和其衍生物如NODA-GA(NODAGA)、Maleimide-NODAGA，DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸)(结合放射性金属离子)和其衍生物，TETA(1,4,8,11-四氮杂环十四烷-N,N’,N”,N”’-四乙酸)和其衍生物，DTTA(N-(对-异硫氰酸苄基)-二亚乙基三胺-N,N’,N”,N”’-四乙酸)。这些和其他螯合剂从商业来源轻易可获得。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。适合用于在此所描述的配制品中的这些和另外已知的药物载体、赋形剂和/或添加剂是本领域中已知的，例如，如“雷明顿药物科学与实践(Remington:The Science&；Practice of Pharmacy)”，第21版，利平科特威廉斯与威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&；Wilkins)(2005)以及“医师案头参考(Physician’sDesk Reference)”，第60版，医药经济出版社(Medical Economics)，蒙特维尔(Montvale)，新泽西(2005)中所列出。可以常规地选择对于所希望或所要求的给予方式、溶解度和/或稳定性来说合适的药学上可接受的载体。
在本申请中，术语“施用(administer)”和类似术语通常不限于身体施用，合适的方法包括体外、先体外后体内或体内方法。例如，可以采用本领域技术人员已知的用于使细胞、器官或组织与组合物接触的任何施用方法。例如，可以通过任意引入或递送途径将所述化合物引入需要治疗的受试者的身体中。在一些实施方案中，本申请的组合物可以口服、局部、鼻内、肌内、皮下、皮内、鞘内、腹膜内或经皮施用。
在本申请中，术语“离体”与“体外”可互换，通常是指在受控的环境中在已从受试者体内移除的细胞、组织和/或器官中进行的活动。
在本申请中，术语“诊断”通常是指检测疾病或病症，或测定疾病或病症的状态或程度。术语“诊断”也可以包括检测疾病或病症的诱因，测定药物治疗的治疗效果，或预测对药物治疗的响应模式。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“肿瘤”和“癌症”可互换使用，通常是指赘生性或恶性细胞生长。本申请的肿瘤可能是良性的，也可能是恶性的。本申请的肿瘤可能是实体的，也可能是非实体的。
在本申请中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物，包括但不限于猫、狗、马、猪、奶牛、羊、兔、小鼠、大鼠或猴等。
在本申请中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。在某些情况下，也表示“为”、“由……组成”的含义。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、或约10％的范围内变动。
在本申请中，术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包括”等其它形式，通常是指包含其它组分、元素、数值、步骤等。
在本说明书和权利要求书中，除非上下文另外明确说明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“该(the)”包括复数参考对象。术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、以及术语“一个或多个/一种或多种(one or more)”和“至少一个/至少一种(atleast one)”可以在此可互换地使用。例如，一个细胞可以是指一个单一细胞或一个细胞群。
发明详述
HER2结合多肽
一方面，本申请提供了一种HER2结合多肽，其与参比抗体竞争结合HER2蛋白，其中所述参比抗体包含重链可变区(VH)；其中所述VH包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其在ELISA试验中，所述的HER2结合多肽能够以不超过约1.20E-09、约1.10E-09、约1.0E-09、约9.0E-10、约8.0E-10、约7.0E-10、约6.0E-10、约5.0E-10、约4.0E-10、约3.0E-10、约2.0E-10、约1.0E-10、约9.0E-11的K
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、VHH和/或dAb。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以为VHH。
在某些实施方式中，所述VHH不局限于特定的生物学来源或特定的制备方法。举例来说，所述VHH一般可以通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过编码此类人源化VHH结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，如来自哺乳动物物种，如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(5)通过如本领域中描述的“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(6)通过使用合成或半合成技术来制备本领域中已知的蛋白质、多肽或其它氨基酸序列；(7)通过使用本领域中已知的核酸合成技术来制备编码VHH的核酸，随后表达如此获得的核酸；和/或(8)通过上述一项或多项的任何组合。
在某些实施方式中，其中所述VHH是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方案中，所述HER2结合多肽可以包含已经“人源化”，即通过将天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(且具体来说是构架序列中)的一个或多个氨基酸残基置换为来自人类的常规4链抗体的VH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。这可以使用本领域中已知的人源化技术来进行。在一些实施方案中，可能的人源化取代或人源化取代的组合可以通过本领域中已知的方法来确定，例如，通过在VHH的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间进行比较。在一些实施方案中，对所述人源化取代进行选择，以使所得人源化VHH仍保留有利的功能性质。一般来说，作为人源化的结果，本申请的VHH相较于对应的天然存在的VHH结构域可以变得更“像人的”，同时仍保留有利性质，如降低的免疫原性。本申请的人源化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式来获得，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始物质的多肽获得的多肽。
在某些实施方式中，其包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中任一项所示氨基酸序列中的至少一个CDR。
在某些实施方式中，其包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中任一项所示氨基酸序列中的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:21中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:34中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR2包含SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36和SEQ ID NO:37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQID NO:46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述HCDR3包含SEQ ID NO:47或SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45中任一项所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:40所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:41所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:42所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:45所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列；或
所述HCDR1包含SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:47所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述可变结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列相比，可以具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加；所述取代、缺失或添加基本上不降低本申请的HER2结合多肽特异性地结合至HER2的能力。
在某些实施方案中，氨基酸突变可以在靶向部分的CDR(例如，CDR1区、CDR2区或CDR3区)中。在另一个实施方案中，氨基酸变化可以在靶向部分的构架区(FR)(例如，FR1区、FR2区、FR3区或FR4区)中。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包含至少一个VH。例如，所述HER2结合多肽可以包含一个、或两个、或三个可变结构域。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包括纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:12中任一项所示的氨基酸序列。
变体
本申请的HER2结合多肽还包括具有与本申请HER2结合多肽相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，1-30个，1-20个，或1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，10个以内，或5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本申请还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本申请的HER2结合多肽的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本申请中，“保守性变异体”通常是指与本申请的HER2结合多肽的氨基酸序列相比，有至多10个，至多8个，至多5个，或至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所取代而形成多肽。
在一些实施方式中，所述取代为保守氨基酸取代，所述保守氨基酸是指氨基酸残基被化学结构类似的另一氨基酸残基置换，且其对多肽的功能、活性或其他生物性质影响较小或基本上无影响。所述保守氨基酸取代在本领域中是公知的，例如保守氨基酸取代是以下组(i)-(v)内的一个氨基酸被同一组内的另一氨基酸残基所取代：(i)较小脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(ii)极性带负电残基及其(不带电)酰胺：Asp、Asn、Glu及Gln；(iii)极性带正电残基：His、Arg及Lys；(iv)较大脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(v)芳族残基：Phe、Tyr及Trp。特别优选的保守氨基酸取代如下：Ala被Gly或Ser取代；Arg被Lys取代；Asn被Gln或His取代；Asp被Glu取代；Cys被Ser取代；Gln被Asn取代；Glu被Asp取代；Gly被Ala或Pro取代；His被Asn或Gln取代；Ile被Leu或Val取代；Leu被Ile或Val取代；Lys被Arg、Gln或Glu取代；Met被Leu、Tyr或Ile取代；Phe被Met、Leu或Tyr取代；Ser被Thr取代；Thr被Ser取代；Trp被Tyr取代；Tyr被Trp或Phe取代；Val被Ile或Leu取代。在一些实施方式中，所述取代为非保守氨基酸取代，例如，Ala被Asp、Asn、Glu或Gin取代。
一方面，本申请提供了一种HER2结合多肽，所述HER2结合多肽可以包含至少一个VH，所述VH的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，可以具有一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽可以包含一个、或两个、或三个VH。
在某些实施方式中，所述VH可以包含相对于SEQ ID NO:1具有一个、或两个、或三个、或四个、或五个、或六个、或七个、或八个、或九个、或十个、或十一个、或十二个、或十三个、或十四个、或十五个、或十六个、或十七个、或十八个、或十九个、或二十个氨基酸取代、缺失或添加的氨基酸序列。
在某些实施方案中，所述VH的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，可以具有一个或几个氨基酸的取代，并且可以包括保守和/或非保守取代。
在某些实施方案中，氨基酸突变可以在靶向部分的CDR(例如，CDR1区、CDR2区或CDR3区)中。在另一个实施方案中，氨基酸变化可以在靶向部分的构架区(FR)(例如，FR1区、FR2区、FR3区或FR4区)中。
可以使用本领域中的任何已知技术，例如定点诱变或基于PCR的诱变来实现对氨基酸序列的修饰。此类技术描述于例如以下文献中：Sambrook等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,N.Y.,1989；和Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1989。
在某些实施方案中，所述取代、缺失或添加基本上不降低本申请的HER2结合多肽特异性地结合至HER2的能力。
可以用平衡解离常数(KD)来描述本申请的HER2结合多肽对人HER2的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其它天然存在或合成类似物、变体或突变体(包括单体、二聚、异源二聚、多聚和/或相关形式)的结合亲和力。所述HER2结合多肽可以包含靶向部分，所述靶向部分结合至人HER2的全长和/或成熟形式和/或同种型和/或剪接变体和/或片段和/或任何其它天然存在或合成的类似物、变体或突变体(包括单体、二聚、异源二聚、多聚和/或相关形式)，其中KD低于约1uM、约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约200nM、约100nM、约90nM、约80nM、约70nM、约60nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、或约5nM、或约1nM。
在某些实施方式中，其中所述HER2结合多肽具有以下性质中的一种或多种：
(i)其能够与A3亲和层析柱的填料结合；
(ii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其能够以相同或更高的亲和力与HER2结合；
(iii)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其具有增加的表达量；和
(iv)与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其等电点提高。
在某些实施方式中，本申请的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，其表达可以是约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高。
在某些实施方式中，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体(命名为H1)的等电点(PI)值为5.3，所述HER2结合多肽的PI值不小于5.3。例如，所述HER2结合多肽的PI值可以为约5.5，约6.0，约6.5，约6.6，约6.7，约6.8，约6.9，或约7。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗体可以包括单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体和/或全人源抗体。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段可以包括Fab、Fab’、Fv片段、F(ab’)2、scFv、di-scFv、VHH和/或dAb。例如，所述抗体或其抗原结合片段可以为VHH。
在某些实施方式中，所述VHH不局限于特定的生物学来源或特定的制备方法。举例来说，所述VHH一般可以通过以下方式获得：(1)通过分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)通过表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)通过天然存在的VHH结构域的“人源化”或通过编码此类人源化VHH结构域的核酸的表达；(4)通过来自任何动物物种，如来自哺乳动物物种，如来自人类的天然存在的VH结构域的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(5)通过如本领域中描述的“结构域抗体”或“Dab”的“骆驼化”，或通过编码此类骆驼化VH结构域的核酸的表达；(6)通过使用合成或半合成技术来制备本领域中已知的蛋白质、多肽或其它氨基酸序列；(7)通过使用本领域中已知的核酸合成技术来制备编码VHH的核酸，随后表达如此获得的核酸；和/或(8)通过上述一项或多项的任何组合。
在某些实施方案中，所述HER2结合多肽可以包含已经“骆驼化”，即通过将来自常规4链抗体的天然存在的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基置换为骆驼重链抗体的VHH结构域中对应位置上存在的一或多个氨基酸残基的VHH。在一些实施方案中，此类“骆驼化”取代被插入在形成和/或存在于VH-VL界面上的氨基酸位置上和/或在所谓的骆驼科标志残基上(参见例如WO9404678，所述文献的全部内容以引用的方式并入本申请)。在一些实施方案中，用作起始物质或起始点以供产生或设计骆驼化VHH用的VH序列是来自哺乳动物的VH序列，例如，人类的VH序列，如VH3序列。所述骆驼化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式获得(即，如以上第(1)至(8)点所指示)，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VH结构域作为起始物质的多肽而获得的多肽。
在某些实施方式中，其中所述VHH可以是骆驼科的、嵌合的、人类的、部分人源化的或完全人源化的。
在某些实施方案中，所述HER2结合多肽可以包含已经“人源化”，即通过将天然存在的VHH序列的氨基酸序列中(且具体来说是构架序列中)的一个或多个氨基酸残基置换为来自人类的常规4链抗体的VH结构域中对应位置上存在的一个或多个氨基酸残基的VHH。这可以使用本领域中已知的人源化技术来进行。在一些实施方案中，可能的人源化取代或人源化取代的组合可以通过本领域中已知的方法来确定，例如，通过在VHH的序列与天然存在的人VH结构域的序列之间进行比较。在一些实施方案中，对所述人源化取代进行选择，以使所得人源化VHH仍保留有利的功能性质。一般来说，作为人源化的结果，本申请的VHH相较于对应的天然存在的VHH结构域可以变得更“像人的”，同时仍保留有利性质，如降低的免疫原性。本申请的人源化VHH可以用本领域中已知的任何合适的方式来获得，并且因此不严格限于已经使用包含天然存在的VHH结构域作为起始物质的多肽获得的多肽。
在某些实施方式中，其中所述VH可以包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的CDR1、CDR2和CDR3。所述CDR可以是Kabat CDR、AbM CDR、Chothia CDR或Contact CDR。在一些实施方案中，所述CDR是Chothia CDR。
一方面，本申请提供了一种HER2结合多肽，其包含VH，当与包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VH的抗体相比时，所述HER2结合多肽在VH的下述一个或多个位置处包含氨基酸取代：L2、I28、V31、A41、E43、Q44、R45、A57、D61、V67、D73、A74、S76、V78、N84、D98、W101、D103、D104、F106、E107和Q117。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：
(a)L2V，A41P，E43K，Q44G，R45L，A57T，V67F，D73N，A74S，S76N，V78L，N84S和/或Q117L；
(b)D61A，D103A，D104A，D98A和/或E107S；
(c)I28T，V31G，A57T，N84S，W101G，W101S和/或F106Y；和
(d)Y37V，A41P，R45L，A57T，D73N，A74S，N84S，K86R和/或P87A。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:159所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:160所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:161所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1包含SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:87中任一项所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:25，SEQ ID NO:88，SEQ ID NO:89中任一项所示的氨基酸序列，所述HCDR3包含SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:90-SEQ ID NO:96中任一项所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:38所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:92所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH包含：HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述HCDR1可以包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述HCDR2可以包含SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列，所述HCDR3可以包含SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1包含SEQ ID NO:162所示的氨基酸序列，所述HFR2包含SEQ ID NO:163所示的氨基酸序列，所述HFR3包含SEQ ID NO:164所示的氨基酸序列，，所述HFR4包含SEQ ID NO:165所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1包含SEQ ID NO:49或SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HFR2包含SEQ ID NO:55，SEQ ID NO:97-SEQ ID NO:106中任一项所示的氨基酸序列，所述HFR3包含SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:107-SEQ ID NO:116中任一项所示的氨基酸序列，所述HFR4包含SEQ ID NO:70或SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55中任一项所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:60中任一项所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:97所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:99所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:107所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:108所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:110所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:111所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:112所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:70所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:55所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:60所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQID NO:117所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQ ID NO:117所示的氨基酸序列。
例如，所述HER2结合多肽包含VH，其中所述VH还包含：HFR1、HFR2，HFR3和HFR4，所述HFR1可以包含SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，所述HFR2可以包含SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列，所述HFR3可以包含SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列，所述HFR4可以包含SEQ ID NO:70所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：L2V，A41P，E43K，Q44G，R45L，A57T，V67F，D73N，A74S，S76N，V78L，N84S和Q117L。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：A41P，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:122所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-A41P。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：E43K，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:125所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-E43K。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：Q44G，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:123所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-Q44G。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：R45L，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:124所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-R45L。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：A57T，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:126所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-A57T。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：V67F，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-V67F。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：D73N，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:118所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-D73N。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：A74S所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:119所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-A74S。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：S76N，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:120所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-S76N。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：V78L，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:128所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-V78L。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：N84S，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:129所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-N84S。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：L2V和Q117L，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:121所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-VL。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：D61A，D103A，D104A，D98A和E107S。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：D61A，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:140所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-D61A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：D103A，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:141所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-D103A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：D104A，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:142所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-D104A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：D98A，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:143所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-D98A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：E107S，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:144所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-E107S。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：I28T，V31G，A57T，N84S，W101G，W101S和F106Y。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：A57T和N84S，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:145所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-AN-TS。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：V31G，A57T和N84S，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:146所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-VG。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：：I28T，A57T和N84S，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:147所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-IT。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：：A57T，N84S和W101G，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:148所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-WG。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：A57T，N84S和W101S，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:149所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-WS。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含选自以下氨基酸取代：：A57T，N84S和F106Y，所述的HER2结合多肽的VH可以包含SEQ ID NO:150所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-FY。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：P41A，K43E，G44Q，L45R，T57A，F67V，L78V，S84N，V2L和L117Q。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：P41A，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:131所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-P41A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：K43E，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:132所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-K43E。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：G44Q，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:133所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-G44Q。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：L45R，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:134所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-L45R。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：T57A，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:131所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-T57A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：F67V，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:136所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-F67V。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：L78V，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:137所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-L78V。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：S84N，所述HER2结合多肽包含SEQ IDNO:138所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-S84N。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:130所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代：V2L和L117Q，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:139所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-V2L-L117Q。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：A41P，E43K，Q44G，R45L，R66V，D73N，A74S，S76N，K86R和P87A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含以下氨基酸取代：A41P，Q44G，R45L，R66V，D73N，A74S和S76N，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:151所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-H。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含以下氨基酸取代：A41P，E43K，Q44G，R45L，R66V，D73N，A74S和S76N，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-3KE。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含以下氨基酸取代：A41P，D73N，A74S，S76N，K86R和P87A，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为hH1-AN-TS。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含以下氨基酸取代：A41P，K86R和P87A，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:154所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为hH1-DA。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:145所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含以下氨基酸取代：A41P，E43K和Q44G，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:155所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为hH1-KP。
在某些实施方式中，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH包含选自下组的一个或多个氨基酸取代：Y37V，A41P，R45L，A57T，D73N，A74S，N84S，K86R和/或P87A。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代Y37V，A41P，R45L，D73N，A74S，K86R和P87A，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:156所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为FH1-N。
例如，所述的HER2结合多肽与氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的参比抗体相比，所述的HER2结合多肽的VH可以包含以下氨基酸取代R45L，A57T和N84S，所述HER2结合多肽包含SEQ ID NO:157所示的氨基酸序列，所述HER2结合多肽命名为H1-RL-VH。
核酸、构建体和细胞
另一方面，本申请提供了一种分离的一种或多种核酸分子，其编码本申请所述的HER2结合多肽。
在某些实施方案中，所述核酸可以编码包含抗体的VHH的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供了编码抗HER2抗体重链可变区的分离的核酸，其中该核酸包含与编码SEQ IDNO:74至SEQ ID NO:84中任一项所示的核酸序列具有至少约90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列。
另一方面，本申请提供了一种构建体，其包含本申请所述的核酸分子。
另一方面，本申请提供了一种细胞，其包含本申请所述的核酸分子或本申请所述的构建体。
编码本申请的HER2结合多肽的核酸可以并入(连接)至构建体中，所述构建体可以通过转染、转化或转导技术而引入宿主细胞中。举例来说，可以通过反转录病毒转导将编码本申请的HER2结合多肽的核酸引入至宿主细胞中。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，宿主细胞是原核的，例如大肠杆菌细胞。
另一方面，本申请提供了一种制备本申请所述的HER2结合多肽的方法，包括在允许所述HER2结合多肽表达的条件下培养本申请所述的细胞。
具体的表达和纯化条件将取决于所采用的表达系统而变化。举例来说，如果在大肠杆菌中表达基因，那么首先通过将工程化的基因置于合适的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游而将它克隆至表达载体中。在另一个实例中，如果将要在真核细胞，例如CHO细胞中表达工程化的基因，那么首先将它插入含有例如合适的真核启动子、分泌信号、增强子和各种内含子的表达载体中。可以使用转染、转化或转导技术将基因构建体引入至宿主细胞中。
在某些实施方式中，所述方法还包括回收由所述细胞表达的HER2结合多肽。
在某些实施方式中，所述方法还包括纯化和/或修饰所述HER2结合多肽。
本申请的HER2结合多肽也可以在体内例如患者中表达。举例来说，在某些实施方案中，本申请的HER2结合多肽可以呈编码本申请的HER2结合多肽的核酸形式施用。所述核酸可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，本申请的HER2结合多肽是由经修饰的mRNA，即包含一个或多个经修饰的核苷酸的mRNA编码。在一些实施方案中，本申请涉及包含所述经修饰的mRNA的基因治疗载体。在一些实施方案中，本申请涉及包括所述基因治疗载体的基因治疗方法。在某些实施方案中，所述核酸呈溶瘤病毒，例如腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹、新城疫病毒或牛痘的形式。
免疫缀合物
另一方面，本申请提供了一种免疫缀合物，其包含本申请所述的HER2结合多肽。
在某些实施方式中，所述免疫缀合物包含：
i)本申请所述的HER2结合多肽；
ii)选自下组的缀合部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
在某些实施方式中，其中所述可检测标记物选自下组的一种或多种试剂：放射性核素、荧光剂、化学发光剂、生物发光剂、顺磁离子和酶。
在某些实施方式中，其中所述放射性核素适用于医学成像和/或治疗。
可用于缀合的荧光剂包括但不限于异硫氨酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺；可用于缀合的化学发光剂包括但不限于鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯；可用于缀合的生物发光剂包括但不限于荧光素、荧光素酶和水母发光蛋白。可用于缀合的顺磁离子包括但不限于铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钻(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)，或者是不透辐射的材料，如坝、泛影酸盐、乙碘油、柠檬酸镓、碘卡酸、碘因他酸、碘达胺、胆影酸、碘沙酸、碘古酰胺、碘海醇、碘帕醇、碘番酸、碘普西酸、碘西法酸、碘丝酸、碘砜葡胺、碘酞硫、碘替酸、碘他拉酸、碘曲西酸、碘克沙酸、羟泛影酸、碘泊酸盐、葡甲胺、甲泛葡胶、甲泛影盐、丙碘酣和氧化亚铊。可用于缀合的酶包括但不限于辣根过氧化物酶等。
在某些实施方式中，所述可检测标记可以是放射性核素。可用于缀合的放射性核素可以是能量在20-4000KeV之间的放射性核素，包括但不限于
例如，所述放射性核素可以为
在某些实施方式中，其中所述HER2结合多肽直接或间接与所述可检测标记物缀合。将可检测标记于多肽缀合的方法是本领域技术人员熟知的。例如，所述HER2结合多肽可以通过螯合剂与所述可检测标记缀合。
在某些实施方式中，其中所述螯合剂选自DTPA、EDTA、NOTA、DOTA、TRAP、TETA、NETA、CB-TE2A、Cyclen、Cyclam、Bispidine、TACN、ATSM、SarAr、AmBaSar、MAG3、MAG2、HYNIC、DADT、EC、NS3、H2dedpa、HBED、DFO、PEPA、HEHA及它们的衍生物中的一种或多种。
在另一方面，本申请提供一种制备本申请的放射性核素如
在一些实施方案中，所述螯合剂是NOTA，所述步骤1)中通过使所述HER2结合多肽与p-SCN-Bn-NOTA或p-NH2-Bn-NOTA反应而生成所述HER2结合多肽与NOTA的缀合物前体。
本申请还可以采用IODO-BEADS固相标记法，用放射性核素如
组合物
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的构建体、本申请所述的细胞和/或本申请所述的免疫缀合物，以及任选地药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本申请描述的组合物呈药学上可接受的盐的形式。本申请描述的HER2结合多肽可以具有能与无机或有机酸反应的充分碱性的官能团，或能与无机或有机碱反应的羧基，以形成药学上可接受的盐。
本申请描述的任何组合物都可以作为包含药学上可接受的载体的组合物的组分施用至受试者。此类组合物可以任选地包含适量的药学上可接受的赋形剂，以便提供用于适当施用的形式。
药物赋形剂可以是液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些液体，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。所述药物赋形剂可以是例如生理盐水、阿拉伯树胶、明胶、淀粉糊、滑石、角蛋白、胶体二氧化硅、脲等等。另外，可以使用助剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂。在一个实施方案中，当施用至受试者时，所述药学上可接受的赋形剂是无菌的。当本申请描述的任何剂经静脉内施用时，水是可用的赋形剂。还可以采用生理盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为液体赋形剂，具体来说，用于可注射溶液。合适的药物赋形剂还包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。合适的药物赋形剂的其它实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676(AlfonsoR.Gennaro编,第19版,1995)中，所述文献以引用的方式并入本申请。
本申请包括所描述的组合物(和/或其它治疗剂)的各种调配物形式。本申请描述的任何发明组合物(和/或其它治疗剂)可以呈溶液、悬浮液、乳液、滴剂、片剂、丸剂、丹剂、胶囊剂、含有液体的胶囊剂、明胶胶囊、粉剂、持续释放调配物、栓剂、乳液、气雾剂、喷雾剂、悬浮液、冻干粉剂、冷冻悬浮液、干燥粉剂的形式或任何其它合用的形式。在一个实施方案中，所述组合物呈胶囊剂形式。在另一个实施方案中，所述组合物呈锭剂形式。在另一个实施方案中，所述组合物被配制呈软凝胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述组合物被配制呈明胶胶囊形式。在另一个实施方案中，所述组合物被配制为液体。
本申请描述的任何组合物根据常规程序配制为适合于本申请描述的施用模式的组合物。
施用途径包括例如：口服、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、叶鞘内、经皮、直肠、通过吸入或局部。施用可以是局部的或全身的。在一些实施方案中，所述施用是通过口服实现。在另一个实施方案中，所述施用是通过肠胃外注射。施用模式可以留给医师判断，并且部分取决于医学病状的部位。
在某些实施方式中，所述组合物包含本申请所述的HER2结合多肽或本申请所述的免疫缀合物，所述组合物为检测剂或治疗剂。
在某些实施方式中，其中所述检测剂为用于检测HER2蛋白的试剂。
在某些实施方式中，其中所述检测剂为造影剂。
在某些实施方式中，其中所述造影剂为检测HER2蛋白的造影剂。例如，所述造影剂可以是ECT造影剂。又例如，所述ECT造影剂可以包括SPECT造影剂或PET造影剂。
在某些实施方式中，其中所述治疗剂用于治疗肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述治疗剂用于治疗HER2阳性肿瘤。
用途
另一方面，本申请提供了本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的核酸分子、本申请所述的构建体、本申请所述的细胞、本申请所述的免疫缀合物和/或本申请所述的组合物在制备药剂、试剂、检测板或试剂盒中的用途；
其中所述试剂、检测板或试剂盒用于检测样品中HER2蛋白；
其中所述药剂用于检测HER2蛋白的表达和/或治疗表达HER2的肿瘤。
另一方面，本申请提供了重组蛋白，所述的重组蛋白包含本申请所述的HER2结合多肽。
在某些实施方式中，其中所述的重组蛋白包含：(i)本申请所述的HER2结合多肽；以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
另一方面，本申请提供了一种检测生物学样品中HER2的存在和/或量的方法，包括：使所述生物学样品接触本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物、本申请所述的组合物。
在某些实施方式中，其中所述接触在体外或离体进行。
在某些实施方式中，其中所述生物学样品为组织。
在某些实施方式中，其中所述组织选自血液组织、淋巴组织和肿瘤组织。
在某些实施方式中，所述方法包括检测生物学样品中HER2阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中通过成像确定生物学样品中HER2阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中通过流式细胞术确定生物学样品中HER2阳性细胞的存在和/或量。
另一方面，本申请提供了一种检测和/或诊断与HER2表达异常相关的疾病或病症方法，包括向有此需要的受试者施用本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物。
在某些实施方式中，其中所述方法还包括对所述受试者进行成像。
在某些实施方式中，其中所述成像包括ECT成像。
在某些实施方式中，其中所述ECT成像包括SPECT成像或PET成像。
在某些实施方式中，其中所述与HER2表达异常相关的疾病或病症包括肿瘤。
另一方面，本申请提供了一种治疗和/或预防肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物。
另一方面，本申请提供了一种用于监测抗肿瘤疗法在受试者中的功效的方法，所述方法包含：
(i)给患有肿瘤且采用抗肿瘤疗法治疗的受试者施用本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物；和
(ii)确定所述受试者的肿瘤中HER2阳性细胞的量。
在某些实施方式中，通过成像确定所述受试者的肿瘤中HER2阳性细胞的存在和/或量。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括HER2阳性肿瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤包括实体瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤选自乳腺癌、胃癌、食管癌、胆管癌、卵巢癌、胰腺癌、子宫内膜癌、子宫颈鳞状细胞癌、唾液腺瘤、膀胱癌、肺癌、结直肠癌、头颈癌、前列腺癌、骨肉瘤、儿童成神经管细胞瘤等肿瘤中的至少一种。
另一方面，本申请提供了一种试剂盒，其包含本申请所述的HER2结合多肽、本申请所述的免疫缀合物或本申请所述的组合物。
在所述试剂盒中可以包括使用说明书。使用说明书典型地包括有形表示，其描述了使用所述试剂盒的组分实现所期望的治疗结果，诸如治疗癌症时将要采用的技术。任选地，所述试剂盒还含有本领域技术人员容易了解的其他有用组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载体、注射器、导管、敷涂器、吸移工具或测量工具、包扎材料或其他有用的附件。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的HER2结合多肽、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1抗Her2单域抗体筛选及构建
1.1文库的构建
免疫用的Her2-cHis融合蛋白由293F细胞表达，经镍柱亲和层析纯化得到。选取一只羊驼进行免疫。免疫结束后，提取羊驼外周血的淋巴细胞并按照Trizol使用说明提取RNA，取1ug RNA样品进行电泳检测其纯度。使用
利用DNA产物纯化试剂盒纯化VHH片段，将载体与片段分别使用限制性内切酶sifi50℃过夜酶切，对酶切后的片段进行切胶回收，将其克隆进入噬菌体展示用载体pComb3XSS中。产物随后电转化至大肠杆菌电转感受态细胞TG1中，构建针对Her2的重链单域抗体噬菌体展示文库并对文库进行检定。通过梯度稀释铺板，计算库容的大小为5.04×10
1.2针对抗Her2的重链单域抗体淘选
用Her2-cHis融合蛋白5μg/孔包被平板，4℃放置过夜。第二天用3％的BSA 37℃封闭1小时，PBST(PBS中含有0.01％吐温20)洗板3次后，加入100μl噬菌体文库，37℃下孵育1小时。之后用PBST(PBS中含有0.01％吐温20)洗6遍，以洗掉不结合的噬菌体。之后每孔加入100uL的Gly-Hcl(PH＝2.2)37℃作用6-8min，洗脱特异性结合的噬菌体，将该洗脱液转移至一无菌的离心管中，用15uL的Tris-Hcl(PH＝9.0)溶液中和缓冲液。取10uL进行梯度稀释，测定滴度并计算淘选回收率，并取中和后的噬菌体感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选。相同筛选过程重复几轮，每一轮淘选需改变淘选条件。由此，阳性的克隆被富集，达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中Her2特异抗体的目的。表1和表2为亲和淘选的条件以及酸洗脱三轮筛选回收量。
表1亲和淘选条件
表2靶分子的酸洗脱三轮筛选回收量
回收率＝回收量/文库投入量；
1.3用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆
经过几轮淘选后，从最后一轮淘选的平板上随机挑取48个克隆进行鉴定。将随机挑选48个单菌落分别培养，生产并纯化噬菌体。分别用Her2-Fc以及Her2-cHis融合蛋白包被平板4℃过夜，2％脱脂牛奶进行封闭，37℃反应1小时，随后每孔加入50uL噬菌体培养菌液上清及50uL 2％的脱脂牛奶，37℃孵育1h。PBST洗涤之后加入辣根过氧化物标记的抗M13二抗(购于北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃反应1小时。洗涤之后加入TMB显色液，450nm波长读取吸收值。选取包被Her2-Fc及Her2-cHis抗原检测OD值均大于阴性对照的样品进行测序。
表3 Her2-cHis抗原phage ELISA鉴定
表4 Her2-FC tag抗原phage ELISA鉴定
其中22号和30号克隆未送测序，其余克隆均送测序，根据序列比对软件DNAMAN分析各个克隆的蛋白序列。把CDR1、CDR2、CDR3序列均相同的克隆视为同一抗体株，而CDR序列不同的克隆视为不同抗体株。最终挑选12条候选序列进行后续实验。
1.4用哺乳动物细胞制备Her2抗体蛋白
将测序分析所获得单域抗体的编码序列亚克隆至表达载体PSNA008中，转染HEK293细胞进行抗体表达。将重组表达质粒用Freestyle293培养基稀释并加入转化所需PEI(Polyethylenimine)溶液，将质粒/PEI混合物分别加入HEK293细胞悬液中，放置在37℃，10％CO
Her2-Fc融合蛋白氨基酸序列为：
MELAALCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASPETHLDMLRHLYQGCQVVQGNLELTYLPTNASLSFLQDIQEVQGYVLIAHNQVRQVPLQRLRIVRGTQLFEDNYALAVLDNGDPLNNTTPVTGASPGGLRELQLRSLTEILKGGVLIQRNPQLCYQDTILWKDIFHKNNQLALTLIDTNRSRACHPCSPMCKGSRCWGESSEDCQSLTRTVCAGGCARCKGPLPTDCCHEQCAAGCTGPKHSDCLACLHFNHSGICELHCPALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFGASCVTACPYNYLSTDVGSCTLVCPLHNQEVTAEDGTQRCEKCSKPCARVCYGLGMEHLREVRAVTSANIQEFAGCKKIFGSLAFLPESFDGDPASNTAPLQPEQLQVFETLEEITGYLYISAWPDSLPDLSVFQNLQVIRGRILHNGAYSLTLQGLGISWLGLRSLRELGSGLALIHHNTHLCFVHTVPWDQLFRNPHQALLHTANRPEDECVGEGLACHQLCARGHCWGPGPTQCVNCSQFLRGQECVEECRVLQGLPREYVNARHCLPCHPECQPQNGSVTCFGPEADQCVACAHYKDPPFCVARCPSGVKPDLSYMPIWKFPDEEGACQPCPINCTHSCVDLDDKGCPAEQRASPLTIEGRMDPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
单域抗体的氨基酸序列为：
/>
注：下划线部分为抗体序列的CDR区
针对筛选得到的抗Her2单域抗体的核苷酸序列设计一对引物，以菌液为模板，通过PCR扩增各抗体的核苷酸序列(包含His标签)，然后克隆至PSNA008【pCDNA4(Invitrogen，Cat V86220)】载体中，经基因序列测定，以确定所获得目的克隆基因序列的正确性。
H1-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H1-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H2-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H2-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H11-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H11-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H12-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H12-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H14-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H14-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H15-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H15-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H27-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H27-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H31-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H31-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H32-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H32-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H36-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H36-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H38-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H38-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
H45-cHis抗体：
上游引物：CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACA
下游引物：CCGGAATTCTTAGTGATGATGGTGGTGGTG
H45-chis的核苷酸序列：
AAGCTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT
实施例2体外筛选
2.1采用羊驼二抗(HRP)进行ELISA活性筛选包被Her2-Fc(PP180524)抗原5ug/mL，封闭后加各抗体5ug/mL，37℃孵育1h；加羊驼二抗(1:10000，Lot#18E001484)37℃孵育1h，450nm检测OD值。
表5羊驼二抗(HRP)ELISA活性筛选
注：
2.2采用His二抗(HRP)进行ELISA活性筛选
包被Her2-Fc(PP180615)5ug/mL，封闭后加样品(1ug/mL起3倍稀释，共12个点)，37℃孵育2h；加入二抗ant-his(HRP)(Lot#GR3248851-4)，37℃孵育1h。
结果显示：以Her2-31为100％，筛选出活性较好的抗体有1#、36#、12#、2#、31#。
表6 His二抗(HRP)进行ELISA活性筛选
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2.3与N87(Her2+)细胞的结合(流式筛选)
包被Her2-Fc(PP180615)5ug/mL，封闭。
收集N87细胞吹打成单细胞悬液，分至2x10^5个/200uL/管；加抗体使其终浓度为5ug/mL，混匀后冰上孵育1h；离心洗涤3次，再加anti-his二抗，混匀后冰上孵育1h；离心洗涤3次后300uL重悬上机。
结果如图1所示：5ug/mL应是饱和浓度，各抗体均对N87细胞有阳性结合，同时也表明N87为Her2+细胞；细胞结合较强的抗体为1#、2#、12#、36#，与ELISA结果基本一致。
2.4 KD亲和力检测(fortebio octet)
用SA sensor(LOT#1906062)load biotin标记的抗体120s；baseline100s后association抗原Her2-chis 180s；dissociation 600s。
表7 KD亲和力检测
如表7，图2-3所示：抗体36#、31#的R
2.5与Herceptin的表位竞争
包被Her2-Fc 0.5ug/well 4℃过夜；封闭后，用1ug/mL biotin-Herceptin作为稀释液稀释Her-31-chis、Her2-2-chis、Her2-12-chis、Her2-36-chis、Her2-1-chis、Her2-11-chis、Her2-45-chis(均10ug/mL起4倍梯度，共12个浓度)，稀释好后以100uL/well加入孔中37℃孵育2h；anti-his(HRP)二抗稀释10000倍、streptavidin(HRP)稀释2000倍后100uL/well 37℃孵育1h；TMB显色并用1M H2SO4终止，450nm读取吸光度。
2.6不同浓度抗体与BT474细胞的结合(vs 2RS15D)
收集BT474细胞，分至2x10^5个/管，200uL/管，冰上孵育30min；分别加入2RS15D-chis、Her2-1-chis(终浓度为5ug/mL、1ug/mL、0.2ug/mL、0.04ug/mL)，冰上孵育1h；离心洗涤2次后，加his-PE二抗(美天旎，批号5200303504)，冰上孵育1h；离心洗涤2次后300uL重悬上机。
图5显示，Her2-1抗体(Her2-Nb1)与Her2抗原结合，优于2RS15D。
2.7与MCF7细胞的结合
MCF7细胞密度调至1*10^6个/mL；每100uL分装到EP管中冰敷20min。5F7-cHis,Her2-1-cHis,2RS15D-cHis反应终浓度为5μg/mL,每管加入对应抗体1.15μL,0.5μL,0.69μL，冰孵30min。加入300μL的1XPBS+0.5％BSA，1200rpm,离心5min，吸去上清，再用300μL的1XPBS+0.5％洗涤。每管加2μL的Anti-His-PE，冰孵30min。加入300μL的1XPBS+0.5％BSA，1200rpm离心5min，吸去上清，再用300μL的1XPBS+0.5％BSA洗涤。用300μL的1XPBS+0.5％BSA重悬，于流式细胞仪上检测。
图6显示，Her2-1也能结合Her2低表达细胞株。
2.8与BT474细胞的单点结合
收集BT474细胞，分至2x10^5个/管，100uL/管，冰上孵育20min；分别加入Her2-1-chis(终浓度为1ug/mL、0.1ug/mL)，冰上孵育30min；离心洗涤3次后，加his-PE二抗，冰上孵育30min；离心洗涤3次后200uL重悬上机。
图7显示，Her2-1抗体与Her2高表达细胞株结合良好。
综合MCF7和BT474数据，Her2-1可特异性结合Her2抗原，且其结合能力与Her2抗原的表达水平呈正相关。
2.9 Her2-Nb1内化(与5F7，2RS15D同期比较)
采用经验证的温控二抗法检测：收集BT474细胞，分至1x10^5个/管，100uL/管，冰上孵育20min；分别加入终浓度为0.1ug/mL的5F7-chis、Her2-1-chis、2RS15D-chis，冰上孵育30min；离心洗涤3次后，分组：冰上放置0、1、2、4h和37℃培养1、2、4h；加his-PE二抗，冰上孵育30min；离心洗涤3次后200uL重悬上机。流式细胞仪分析检测平均荧光强度MFI。同一时间，(MFI
内化结果(图8)显示：
i)亲和力：Her-1＞5F7＞2RS15D；
ii)内化率：5F7呈上升趋势，4h三种抗体内化率无明显差异；
iii)绝对内化量：5F7呈上升趋势，Her2-1稍有上升，2RS15D稍有下降，4h内化量Her2-1＞5F7＞2RS15D；
iv)内化速度：Her2-1与2RS15D在1h即可趋近内化峰值，内化快，5F7内化慢；
v)Her2-1内化效果最佳。
2.10数据汇总
实施例3
3.1核素标记Her2纳米抗体
125
200μL 1×PBS，5μL Na
99m
取500μL
177
将200μg DOTA-HER2-1纳米抗体偶联物与100μL 0.1M HCl和500μL 0.25M乙酸铵混合，最后加入
反应1h后点样进行TLC检测，展开剂为柠檬酸。TLC检测结果，标记率>95％则放行使用。如标记率<95％，使用PD-10柱进行纯化，1％BSA饱和后，以PBS作为洗脱液，每500μL收集并测量放射性活度。合并放射性洗脱液并再次进行TLC检测。放射化学纯度>95％则放行使用。
3.2
SK-OV-3细胞培养于培养皿中，细胞按照约2×10
4℃孵育完成后1×PBS 1mL洗涤每孔细胞1次，收集孵育完后的细胞上清液及PBS洗液至放免管中，检测每管的cpm值。
细胞中添加新的培养基1mL，37℃孵育。Block组孵育1h，实验组分别孵育0h、1h、2h、4h、24h。孵育完成之后用PBS洗涤1次，用1000μL甘氨酸-盐酸缓冲溶液4℃孵育5min，收集酸洗溶液。γ计数仪检测各管酸洗溶液的cpm值。
加入2M NaOH洗涤20min，收集细胞悬液至放免管中，γ计数仪检测各管细胞悬液的cpm值。
从结果(图9)可看出，NO.36#和31#结合较慢，解离较快，相比之下NO.1，2，12#认为是较优抗体。
3.3 Her2-Nb1的分布及体内显影
125
125
结果(图10)显示，
125
BT474-BALB/c-nude裸鼠，i.v给予
99m
取500μL
取出100μl(～5.62mCi)99mTc(H2O)3(CO)3与100μg Her2-1蛋白(溶于PBS中，不少于100μL)混合，37℃孵育约90分钟。
99m
99m
表8
表8和图12显示，
177
177
结果(图13)显示，Her2-Nb1与Her2低表达细胞在体内也有结合。
177
BT474荷瘤鼠，按照分组分别注射给予生理盐水(对照组)、
结果如错误！未找到引用源。所示，与NS组相比，
实施例4
4.1序列优化与鉴定
经过前期筛选与鉴定，在候选抗体中选定H1-cHis为最终的抗体序列，同时构建无标签的重组质粒H1。将上述重组构建的单域抗体H1融合蛋白质粒转染HEK293细胞进行抗体表达。并由A3亲和层析进行纯化，经鉴定发现H1抗体同A3亲和层析填料不结合，为后续纯化得到蛋白增加了困难，因此需要对H1抗体序列进行优化改造，使其可以经由亲和层析进行纯化。
对H1抗体序列的FR(Framework region)框架区进行分析，选取同A3亲和填料结合相关的关键氨基酸进行突变，经过对序列的分析，最终突变体H1-AN-TS可以同A3亲和层析填料进行结合。
H1及其突变体的命名及氨基酸序列
注：划横线部分为突变点
将重组质粒H1以及突变后的重组质粒H1-AN-TS分别经由HEK293细胞进行抗体表达，并通过A3亲和层析填料进行纯化，来验证突变后同亲和填料的结合情况，图15A-15B为突变前后抗体纯化后SDS-PAGE分析结果。图15A显示的是H1抗体同A3填料不结合，蛋白在流穿中，图15B显示的是H1-AN-TS同A3填料结合，蛋白在buffer C中洗脱。
4.2针对H1抗体的结合活性、表达量进行序列优化
对H1抗体序列的FR(Framework region)框架区和CDR(Complementarity-determing region)区进行分析，选取同亲和力、表达量相关的氨基酸进行突变尝试。先选取单个氨基酸进行突变，再进行多个氨基酸突变，在同表达量及结合活性相关的部分单点突变共计进行12组。
突变体的命名及氨基酸序列
注：下划线部分为突变后的氨基酸
分别对各突变体进行表达量和结合活性的检测。为了检测方便，此部分采用带有组氨酸标签的重组质粒进行瞬时转染，瞬转后用相应的Ni+树脂凝胶对重组蛋白进行亲和层析纯化，得到的目的蛋白即可用于表达量及结合活性的检测。
亲和活性的检测：Her2-Fc融合蛋白0.5μg/孔包被平板4℃过夜，PBST洗涤过后加入3％的BSA进行封闭，之后加入各突变体H1单域抗体蛋白的梯度稀释系列，室温下反应1小时。洗涤之后加入anti-his辣根过氧化物酶标记抗体，室温反应1小时。洗涤之后加入显色液，450nm波长读取吸收值。应用软件SotfMaxPro v5.4进行数据处理和作图分析，通过四参数拟合，得到突变后抗体对Her2-Fc结合曲线，并以H1抗体为对照，比较不同突变体的相对活性，以反映抗体对Her2-Fc的亲和能力。
表达量的计算：根据一步亲和层析纯化后得到的目的蛋白总量来计算表达量。
表9各突变体对Her2抗原的结合情况及表达量
综合各个突变体同Her2-Fc抗原的亲和力及表达量进行分析，选择突变后亲和力及表达量都相对较好的位点进行组合突变，此部分共进行9个组合突变。
突变体命名及氨基酸序列
注：下划线部分为突变后的氨基酸
以同样的检测方法对此轮突变的9组抗体进行亲和力及表达量的检测，为方便检测，仍然采用带有组氨酸标签的抗体来进行相应的瞬转、纯化及后期检测。聚体的检测结果如表10所示。
表达量的计算：根据一步亲和层析纯化后得到的目的蛋白总量来计算表达量。
表10各组合突变体对Her2抗原的结合情况及表达量
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4.3针对H1抗体CDR3区负电荷氨基酸进行优化
抗体类分子一般要求等电点高于7，从而保证该分子能够适用于下游纯化工艺平台中的离子交换层析。而且宿主DNA的等电点主要分布在4～4.5，若抗体PI值与其接近，很难达到去除效果。选择CDR3区的负电荷氨基酸进行突变，一方面考虑可以通过突变提高抗体的PI值，另一方面抗体的亲和力同抗体CDR3区有直接的联系，因此希望在改变PI值的同时还能够提高H1抗体的亲和力。综合以上原因，在此部分共进行5个突变体。
突变体命名及氨基酸序列如下：
注：下划线部分为突变后的氨基酸
突变完成后对改造后的抗体进行亲和力、表达量及PI值的检测，具体结果如表11所示：
表11各组合突变体对Her2抗原的结合情况、表达量及PI值
4.4针对H1表面疏水性氨基酸进行优化
纳米抗体在进行放射性显影或治疗时，除肿瘤部位的特异性吸收外，其他非靶器官也会有一定的非特异性吸收，而如果纳米抗体表面存在一些疏水性氨基酸，可能会增加肝脏等器官的摄取，从而在放射性治疗或显影过程中，导致放射性核素在肝脏等器官的聚集，产生肝脏毒性等。为了避免此种情况，对H1抗体的PDB模型进行分析，选取了一些位于抗体表面且疏水性较强的氨基酸进行突变尝试，此部分共进行5个突变体优化。
突变体命名及氨基酸序列如下：
注：下划线部分为突变后的氨基酸
抗体突变完成后，进行表达及纯化得到相应的目的蛋白，并对其进行表达量及亲和力的检测，具体结果如表12所示：
表12各组合突变体对Her2抗原的结合情况及表达量
4.5对H1单域抗体进行人源化
骆驼抗体具有传统抗体不具备的优势，比如分子量小、体内渗透性好，极易穿过血管或者组织到达靶部位，这些优势使得纳米抗体被广泛的用于疾病诊断与检测的工具。但是多价的抗体如果长期用于临床可能会产生不同程度的免疫反应，影响治疗效果，因此需要对H1抗体进行人源化。人源化采用的是蛋白表面氨基酸人源化的方法以及VHH人源化通用框架部分移植法来完成。
人源化步骤如下：获取Cecile Vincke等人根据序列同源性设计完成的通用性人源化VHH框架h-NbBcIII0FGLA(PDB编号为：3EAK)，该框架设计基于纳米抗体NbBcIII0抗体(PDB编号为：3DWT)，参考人源抗体进行蛋白表面氨基酸人源化，根据H1纳米抗体序列的具体情况选择需要人源化的位点。
对H1抗体进行人源化，分为以H1抗体及H1-AN-TS抗体为模板进行突变，共获得7种抗体人源化变体。表13及表14列出了这些人源化变体的氨基酸变化以及突变后抗体的命名，其中氨基酸残基编号比照Kabat编号，具体的命名及突变位置如表所示。
表13氨基酸突变对比表(以H1-AN-TS为模板)
表14氨基酸突变对比表(以H1为模板)
突变体具体命名及氨基酸序列如下
注：划横线部分为突变氨基酸
突变完成后对各突变体进行亲和力以及表达量的分析，具体检测结果如表15所示。
表15人源化变体亲和力及表达量检测
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