一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌、筛选方法及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌、筛选方法及其应用。

背景技术

祁术(Atractylodes macrocephala Koidz.)别名于术、冬祁术等，隶属于菊科(Compositae)菜蓟族(Cynareae)苍术属(Atractylodes DC.)，为多年生草本植物。祁术以根状茎入药，是一种常用重要的大宗中药材；最初记载于《神农本草经》中，其味甘、苦，性温，入脾、胃经，列为上品，集中分布于安徽、浙江、江西等地，其中以祁祁术的品质和药效最好。祁祁术(简称祁术)为安徽黄山特有种，是安徽省著名的道地药材。

现有研究表明，祁术主要含有挥发油、内酯类、多糖等药用成分，具有治疗糖尿病、抗衰老、抗肿瘤、抗炎症、抗菌等多种药用功能。因此，祁术具有很好的药用价值及开发前景。但祁术主要以野生资源为主，生长环境苛刻；同时，随着人类对于野生祁术的大量挖掘且长期缺乏保护，造成祁术野生种群处于极度濒危状态，亟需保护。因此，在保护祁术资源的同时开发其药用价值迫在眉睫。

植物内生菌定植于宿主体内，种类丰富，可产生与宿主植物相同或相似的代谢产物，成为筛选具有抑菌活性次级代谢产物的重要资源。近年来，利用植物内生菌防治病害的研究也得到较多关注，如毕江涛等探究沙冬青植株中内生细菌的生防潜力，发现分离的内生细菌AMER007和AMER008对枸杞黑果病菌和小麦全蚀病菌有明显的拮抗作用(毕江涛,杨薇,李萍,贺达汉.濒危药用植物沙冬青内生细菌分离及其抑菌活性初步分析[J].天然产物研究与开发,2013,25(12):1621–1626.)；丁婷等对杜仲植物中的内生真菌进行分离纯化，共得到32株菌株，通过离体拮抗筛选试验发现22株内生真菌对玉米纹枯病菌有抑菌作用(丁婷,孙微微,王帅,江海洋.杜仲内生真菌中抗玉米纹枯病活性菌株的筛选[J].植物保护,2014,40(6):29–35.)。然而，目前对于祁术的研究主要集中于营养成分、生长繁殖、活性成分等，关于祁术内生菌方面的研究目前尚无报道。

针对上述情况，本发明从安徽祁门野生祁术中分离筛选出具有生防效果的菌株，利用形态学及分子生物学方法对其进行鉴定，并对其次级代谢产物进行抑菌活性研究。

发明内容

本发明从传统中药材祁术中分离得到内生菌株HSU–3，通过形态学及分子生物学方法，鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并通过抑菌活性实验发现主要的抑菌物质存在于发酵产物中；该发酵产物中的抗菌物质对蛋白酶K和胰蛋白酶具有很强的稳定性，且有很好的热稳定性和紫外稳定性，在偏碱性环境中，具有很好的抑菌能力。

本发明的第一方面是：提供一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌，分离自采集于安徽省黄山市祁门县的祁术中；命名为祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌已于2022年10月26日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M20221664。

经过分离纯化后，该祁术内生贝莱斯芽孢杆菌菌株呈圆形单菌落，边缘不规则，表面较为粗糙不透明，菌落中心颜色较深呈浅黄色；利用扫描电镜进一步观察，该菌体呈杆状、圆端，菌体大小为1.5～2.0×0.8～1μm。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌对植物病原真菌具有拮抗作用。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌发酵产物对植物病原真菌具有拮抗作用。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌发酵产物对水稻弯孢叶斑病菌具有拮抗作用。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌发酵产物的提取方法包括：将祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3接种于培养基培养，取80-120μL接种到培养基继续培养，将发酵液进行离心，取上清液备用。

进一步地，通过平板对峙试验可知，祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3对水稻弯孢叶斑病病菌、小麦赤霉病病菌、玉米茎基腐病病菌、棉花枯萎病病菌、苹果炭疽病病菌、番茄枯萎病病菌、稻瘟病病菌、枣炭疽病病菌、辣椒疫霉病病菌、油菜菌核病病菌均具有拮抗活性。

进一步地，所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌的分离方法包括：取新鲜根茎，无菌水洗净后并进行预处理，剪切为2-5mm左右的小片段；在无菌环境下将上述组织片段定植于PDA培养基，恒温培养根茎切口处长出菌落后，将其转接至新鲜PDA培养基上进行纯化；将纯化后的菌株转接到PDA斜面培养基上，保存备用

其中，所述PDA培养基包括：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加双蒸水定容至1000mL。

本发明的第二方面是：

本发明采取平板划线法得到祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3单菌落，利用通用引物进行16S rRNA扩增，构建系统进化树，明确该菌株的分类地位。

更进一步的，使用16S rRNA序列，构建系统进化树，发现该菌株与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strain FZB42位于同一分支，且自展支持率为89％。因此，进一步确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，命名为B.velezensis strain HSU–3。

其中，祁术内生贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三方面是：提供所述祁术内生贝莱斯芽孢杆菌的应用，包括以下应用：

作为水稻弯孢叶斑病病菌拮抗菌的应用；

作为小麦赤霉病病菌拮抗菌的应用；

作为玉米茎基腐病病菌拮抗菌的应用；

作为棉花枯萎病病菌拮抗菌的应用；

作为苹果炭疽病病菌拮抗菌的应用；

作为番茄枯萎病病菌拮抗菌的应用；

作为稻瘟病病菌拮抗菌的应用；

作为枣炭疽病病菌拮抗菌的应用；

作为辣椒疫霉病病菌拮抗菌的应用；

作为油菜菌核病病菌拮抗菌的应用。

本发明的优点在于：

(1)本发明中祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3具有较为广泛的抗菌特性，该菌株对水稻弯孢叶斑病病菌、玉米茎基腐病病菌、棉花枯萎病病菌和小麦赤霉病病菌的抑菌效果较为明显，抑菌率菌均达到45％以上；

(2)在本发明中首次发现了祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3对于水稻弯孢叶斑病菌的拮抗效果最为显著，且抑菌率达到63.72％；同时其发酵产物同样对水稻弯孢叶斑病菌有非常明显的生防效果，抑菌率进一步得到显著提升高达75.61％。说明祁术内生菌发酵产物可以显著提高对水稻弯孢叶斑病菌的拮抗作用，这也为防治水稻弯孢叶斑病害提供一种重要的新型拮抗菌资源；

(3)本发明中祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液具有较强的热稳定性和耐紫外性，在偏碱环境下具有很好的抑菌活性，具有良好的开发前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3菌落形态；

图2为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3扫描电镜下菌体形态；

图3为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3对水稻弯孢叶斑病菌的拮抗作用图；

图4为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3对小麦赤霉病菌的拮抗作用图；

图5为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3对苹果炭疽病菌的拮抗作用图；

图6为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3对棉花枯萎病菌的拮抗作用图；

图7为基于芽孢杆菌属16S rRNA构建系统进化树；

图8为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵产物对水稻弯孢叶斑病菌的拮抗作用图；

图9为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵产物对小麦赤霉病菌的拮抗作用图；

图10为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵产物对苹果炭疽病菌的拮抗作用图；

图11为贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵产物对棉花枯萎病菌的拮抗作用图；

图12为两种不同蛋白酶对贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵液拮抗活性的影响对比图；

图13为不同pH对贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵液拮抗活性的影响对比图；

图14为不同温度对贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵液拮抗活性的影响对比图；

图15为不同时间紫外线对贝莱斯芽孢杆菌HSU–3发酵液拮抗活性的影响对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

本发明提供的一种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌，其分离自采集于安徽省黄山市祁门县的祁术，样品采集后存放于课题组实验室4℃冰箱备用。

本发明中所使用的主要仪器包括：琼脂、葡萄糖(国药集团)、ZGP-2050型恒温培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)、SW-CJ-ICU型超净工作台(上海新苗有限公司)、DSX-280B型高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械有限公司)、MQD-B2R型振荡培养箱(上海旻泉仪器有限公司)、pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。

实施例1

1、祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3的分离及纯化：

运用组织块分离法进行祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3的分离及纯化，具体步骤包括：取新鲜根茎，无菌水洗净后，用5％的NaClO溶液和75％乙醇溶液进行预处理，剪切为3mm左右的小片段；在无菌环境下将上述组织片段定植于PDA培养基，并设置对照组。于28℃恒温培养3～5d，待实验组根茎切口处长出菌落后，将其转接至新鲜PDA培养基上进行纯化；将纯化后的菌株转接到PDA斜面培养基上，并于4℃冰箱保存备用。

其中，PDA培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加双蒸水定容至1000mL。

2、形态学观察：经分离纯化获得祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3菌株，其生长状况如图1所示。该菌株呈圆形单菌落，边缘不规则，表面较为粗糙不透明，菌落中心颜色较深呈浅黄色；利用扫描电镜进一步观察，如图2所示，该菌体呈杆状、圆端，菌体大小为1.5～2.0×0.8～1μm。

3、祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3对病原真菌的拮抗作用：

采用平板对峙法对祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3拮抗作用进行测定，具体方法包括：将各供试植物病原真菌菌饼(5mm)分别转接至PDA培养基中央，待病原菌长出后，利用十字对称法，距病原真菌30mm处，接入同等大小的4块祁术内生菌菌饼(5mm)进行对峙实验。每组重复5次，同时以只接种供试病原真菌的平板作为空白对照组，于28℃恒温培养箱中进行培养。每24h观察病原真菌的生长状态，测量病原真菌菌落直径计算抑菌率。

采取前述平板对峙法，测定祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3对水稻弯孢叶斑病病菌、小麦赤霉病病菌、玉米茎基腐病病菌等10种植物病原真菌的抑菌情况，结果如表1所示：

表1菌株HUS-3抑菌普

需要指明的是，表中误差线所示为标准差，不同字母表示经Duncan’s氏新复极差法检验显著性差异(P<0.05)。

另外，该菌株对水稻弯孢叶斑病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌和棉花枯萎病菌4种植物病原真菌对峙作用，结果如图3-图6所示。

结果表明，祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3对水稻弯孢叶斑病病菌、玉米茎基腐病病菌、棉花枯萎病病菌和小麦赤霉病病菌的抑菌效果较为明显，抑菌率菌均达到45％以上。

需要强调的是，祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3对水稻弯孢叶斑病菌的抑菌效果最高，抑菌率高达63.72％，拮抗作用优异。

因此，该种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3具有较为广泛的抗菌特性，具有应用开发潜力。

4、对该种祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3的菌种进行鉴定：

采取平板划线法得到祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3单菌落，进行菌落形态特征观察，并用电镜对菌体进行观察。

祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3全基因组DNA用细菌基因组DNA试剂盒进行提取，用通用引物27F(5'–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3')/1492R(5'–TACGGTTACCTTGTTACGACTT–3')进行16S rRNA扩增，送通用生物(安徽)股份有限公司进行测序。在NCBI的GenBank数据库中用BLAST比对得到该菌株序列的同源序列，用ClustalX软件获得的序列与搜索到的同源序列进行序列比对，并用MEGA软件根据最大似然法(Maximum Likelihood)构建系统进化树，以自展法(Bootstrap)进行检测，循环1000次。

利用分子系统学分析，获得祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3的16S rRNA序列，构建系统进化树如图7所示，发现该菌株与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strainFZB42位于同一分支，且自展支持率为89％。

因此，进一步确定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌，命名为B.velezensis strain HSU–3。

祁术内生贝莱斯芽孢杆菌的16S rRNA基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2

1、祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵产物的提取：

将祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3接种于PD液体培养基，28℃、180rpm培养24h，取100μL接种到100mL PD液体培养基继续培养3d。将内生菌发酵液于9500rpm离心25min，取上清液备用。

其中，PD培养基为PDA培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加双蒸水定容至1000mL)相应的液体培养基，不加琼脂。

2、祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵产物对植物病原真菌的拮抗作用测试：

将祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液与培养基按1:9体积比充分混合，制成含内生菌无菌发酵液的培养基，以无菌水作空白对照。在平板中心分别接入4种供试植物病原真菌水稻弯孢叶斑病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌、棉花枯萎病菌，菌饼为5mm，每个处理重复5次。并将各供试真菌置于28℃培养。待对照组菌落生长状况适宜，测量对照组和处理组菌落的生长直径，计算内生菌发酵液的抑菌率。

采用无菌水为空白对照，发酵液为实验组，分别将水稻弯孢叶斑病菌、小麦赤霉病菌、苹果炭疽病菌和棉花枯萎病菌4种供试菌接入无菌水与发酵液平板中，并测定祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液对4种常见病原真菌的相对抑菌活性，具体拮抗作用图如图8-图11所示。

结果发现，祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液对水稻弯孢叶斑病菌、小麦赤霉病菌的抑菌效果较好，对水稻弯孢叶斑病菌的相对抑菌率可达75.61％，对小麦赤霉的相对抑菌率可达42.42％，对棉花枯萎病菌和苹果炭疽病菌的抑菌效果较差。

3、祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵产物的稳定性

通过改变处理条件来验证祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵产物对水稻弯孢叶斑病原菌抑制效果稳定性的影响，具体试验如下：

(1)酶稳定性

将浓度为5μg/mL的胰蛋白酶和蛋白酶K分别与内生菌发酵液混合，于28℃、180rpm摇床反应2.5h，未经蛋白酶处理的无菌水作为空白对照，以水稻弯孢叶斑病菌作为供试菌，接种于蛋白酶处理后的发酵液平板中。每个处理重复5次。计算祁术内生菌发酵液的相对抑菌率。

利用蛋白酶处理对祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液抑菌活性的影响结果：用蛋白酶K和胰蛋白酶来处理祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液，测定发酵液的酶稳定性，结果如图12所示。由该结果可知，菌株HSU–3发酵产物的抑菌活性无明显影响，表明对蛋白酶具有较强的耐受性。

(2)酸碱稳定性

用pH计和酸碱缓冲液将祁术内生菌发酵液pH值分别调整为2、4、6、8、10、12，静置24h后，调整pH值为初始值7.3。以未经处理的无菌水为空白对照，未经酸碱处理的发酵液为对照，以水稻弯孢叶斑病菌作为供试菌，实验处理方法及相对抑菌率计算方法同上。

酸碱处理对祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液抑菌活性的影响：发酵液经不同pH梯度处理，测定发酵液的酸碱稳定性，结果如图13所示。

结果表明，当pH 8.0时，相对抑菌率最大，为105.3％。但在强酸强碱处理下抑菌活性均呈下降趋势，且pH 2.0时，抑菌活性最低，相对抑菌率为45％；表明在强酸或者强碱条件下，该发酵产物的抗菌物质的抑菌活性显著降低，该抗菌物质在偏碱性条件下稳定性较好。

(3)热稳定性

将内生菌发酵液分别在40℃、60℃、80℃、100℃水浴锅中处理30min，待温度降至室温后，以未经处理的发酵液为对照，未经温度处理的无菌水为空白对照，以水稻弯孢叶斑病菌作为供试菌，实验处理方法及相对抑菌率计算方法同上。

热处理对祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液抑菌活性的影响：发酵液经40～100℃的不同温度处理30min，测定发酵液的热稳定性，结果如图14所示。

从该实验结果发现，该发酵液经不同温度处理后，其相对抑菌率均能达到100％以上，尤其需要强调的是，本发明中祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵上清液在100℃处理后，相对抑菌率仍达到100％以上，说明该发酵产物中的抑菌活性物质对不同温度均有较强耐受性。

(4)紫外稳定性

将内生菌发酵液正上方放置1个紫外灯管(UV–C，30W)，灯管与培养皿中液面之间的垂直距离为15cm，照射时间为1h、2h和3h。以未经处理的发酵液为对照，未经温度处理的无菌水为空白对照，以水稻弯孢叶斑病菌作为供试菌，实验处理方法及相对抑菌率计算方法同上。

紫外线对祁术内生贝莱斯芽孢杆菌HSU-3发酵液抑菌活性的影响：发酵液经1～3h的紫外照射，测定不同紫外照射时间对发酵液稳定性的影响，结果如图15所示。

从实验结果知，该发酵液经不同时间梯度紫外线照射后，其抑菌活性没有明显变化；虽然3h后抑菌活性略有下降，但相对抑菌率仍达到98.06％，说明发酵液中的抑菌物质在紫外照射下仍具有较强的抑菌作用，稳定性较高。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。