一种高山被孢霉诱变菌发酵生产的Sn-2位ARA油脂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物油脂营养制品技术领域，具体而言，涉及一种利用高山被孢霉诱变菌株发酵生产的Sn-2位ARA油脂及其制备方法。

背景技术

ARA(AA)学名二十碳四烯酸，又名花生四烯酸，属Omega6族长链多不饱和脂肪酸。ARA在血液、肝脏、肌肉和其他器官系统中作为磷脂结合的结构脂类物质，具有非常重要的作用。此外，ARA是许多循环二十烷酸衍生物的生物活性物质，如前列腺素E2(PGE2)、前列腺环素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)和白细胞三烯和C4(LTC4)的直接前体，这些生物活性物质对脂质蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。由于婴幼儿期体内合成ARA的能力较低，因此在婴幼儿时期ARA属于必需脂肪酸。一方面，对于正处于身体发育黄金期的婴幼儿来说，在食物中提供一定的ARA，会更有利于其体格的发育。另一方面，ARA的缺乏对于人体组织器官的发育，尤其是大脑和神经系统发育可能产生严重不良影响。

鉴于婴幼儿体内无法合成ARA，只能通过外界获取，因此通过发酵制备高含量的ARA油脂成为了一种工业化生产手段。通过发酵工艺获取的ARA油脂为甘油三酯型油脂，甘油三酯类油脂的结构分为Sn-1、Sn-2、Sn-3位脂肪酸。科学研究表明，人体内的特异性胰脂酶会选择性水解Sn-1、Sn-3位脂肪酸，从而生成Sn-2位脂肪酸单甘酯和游离脂肪酸，Sn-2位脂肪酸单甘酯可在小肠黏膜上被吸收，代谢合成甘油三酯、磷脂，而从Sn-1、Sn-3位水解出来的游离脂肪酸，一部分被吸收，一部分氧化分解成能量，由此可知Sn-2位ARA比Sn-1、Sn-3位ARA更有利于人体吸收。因此，通过微生物发酵工艺提高微生物油脂中Sn-2位ARA含量，从而增强人体对ARA的吸收利用率成为了一个急需攻克的难题。

目前，花生四烯酸油脂的发酵菌种是高山被孢霉，然而现有的高山被孢霉菌种的油脂转化产率较低，给工业化生产ARA带来了较高的成本问题。另外，文献报道以葡萄糖、酵母抽提物、谷氨酸等原料作为培养基成分，该培养基不能有效提高相对产量。就现在的技术而言，目前还没有将玉米浆作为培养基成分应用于高山被孢霉的发酵技术中，由于微生物发酵过程中有很多不确定性，对于高山被孢霉在玉米浆发酵培养基中是否能够正常地生长还处于未知状态。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用高山被孢霉诱变菌株发酵生产的Sn-2位ARA油脂及其制备方法，从而提高ARA油脂在人体内的吸收率，以及有效率降低了生产成本。

为了实现上述技术目的，本发明人通过大量试验研究并不懈努力，从高盐渍地区的土壤中筛选出了一种ARA高产型高山被孢霉，并通过在实验室诱变和驯化，以及种子培养、发酵培养、油脂提取实现了Sn-2位ARA油脂的工业化生产。

具体地，本发明人从高盐渍地区的土壤中筛选出一种ARA高产型高山被孢霉菌株，并按如下方法对该菌株进行诱变和驯化：

(1)取OD

(2)选用30W的紫外灯管提前照射30min，取OD

(3)菌种挑取：挑取抑制平板上较大的菌株作为待选菌种进发酵培养(发酵容器可用微孔板或者锥形瓶，为提高诱变效率可以尽量缩小发酵体积)。

(4)磷酸香草醛测定油脂含量的标准曲线绘制：去释放发酵液(提前算出含油量)：经过数倍稀释(使含油量保持在0～10g/L内)测定OD

(5)磷酸香草醛反应法快速测定菌体油脂含量：取均匀发酵液0.5mL，加入1.5mL无菌水洗涤，8000r/min离心5min，重复2次。2mL无菌水稀释后，振荡均匀，取0.1mL菌悬液置于25mL具塞试管中(蒸馏水为对照样)，加入2mL浓度为98％的H

另外，本发明提供一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂，所述微生物油脂由高山被孢霉诱变菌发酵制得，所述高山被孢霉诱变菌为高山被孢霉(Mortierella alpine)A1.0其保藏编号为CCTCC:M20222092。

再者，本发明提供一种富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，该方法包括将高山被孢霉诱变菌通过种子培养和发酵培养制得富含Sn-2位ARA的微生物油脂，所述高山被孢霉诱变菌为高山被孢霉(Mortierella alpine)A1.0，其保藏编号为CCTCC：M20222092。

进一步优选地，如上所述富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，其中所述种子培养是将所述高山被孢霉诱变菌经活化后制作成摇瓶种子液接种到种子培养基中培养；所述种子培养的培养基组成为：葡萄糖47-53g/L、谷氨酸钠2.5-3.5g/L、玉米浆9-11g/L、硫酸镁2.5-3.5g/L、磷酸二氢钾0.15-0.25g/L、氯化钠1.2-1.6g/L。在本发明最优选的一个实施例中，所述种子培养的培养基组成为：葡萄糖50g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠1.4g/L。需要说明的是，本发明所用的玉米浆中的固形物浓度为45～50％，氨基氮含量4.0～4.5％。

再进一步优选地，如上所述富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，其中所述种子培养的培养条件为：搅拌转速80～120r/min，通气量0.6～1.0m

进一步优选地，如上所述富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，其中所述发酵培养的培养基组成为：葡萄糖55-63g/L/L、谷氨酸钠4.5-5.5g/L、玉米浆9-11g/L、硫酸镁4.5-5.5g/L、磷酸二氢钾0.15-0.25g/L、氯化钠1.2-1.6g/L。在本发明最优选的一个实施例中，所述发酵培养的培养基组成为：葡萄糖60g/L、谷氨酸钠5g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾0.2g/L；氯化钠1.4g/L。

再进一步优选地，如上所述富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，其中所述发酵培养的培养条件为：搅拌转速50～80r/min，培养温度27～29℃，通气量700～800m

进一步优选地，如上所述富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，其中该方法还包括对所述发酵的产物进行提取分离得到微生物油脂，步骤为：将发酵液进行过滤，烘干，然后用食品级正丁烷浸泡8～16h，最后将溶剂与油脂分离，回收溶剂，得到微生物油脂。

再进一步优选地，如上所述富含Sn-2位ARA的微生物油脂的制备方法，其中所述微生物油脂中ARA含量不低于60％，所述ARA中Sn-2位ARA的比例不低于55％。

与现有技术相比，本发明采用一种高山被孢霉发酵法生产高含量的ARA油脂以及高含量的Sn-2位ARA油脂，其具有如下优点和显著进步性：

(1)本发明生产的Sn-2位ARA油脂工艺流程简单，适宜于工业化规模生产，减少环境污染等问题，填补了纯天然Sn-2位ARA油脂的空白。

(2)本发明生产的ARA油脂中的Sn-2位ARA含量可高达55.1％。

(3)本发明生产ARA油脂中ARA平均含量高达60％，具有很好的稳定性和营养价值。

(4)本发明缩短了发酵周期，降低生产成本。

附图说明

图1为高山被孢霉菌在显微镜下形态图；

图2为Sn-2位ARA油脂脂肪酸组成气相色谱图；

图3为ARA油脂脂肪酸组成气相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1Sn-2位ARA油脂生产用菌种的诱变

(1)从高盐渍地区的土壤中筛选出一种ARA高产型高山被孢霉，取OD

(2)选用30W的紫外灯管提前照射30min，取OD

(3)菌种挑取：挑取抑制平板上较大的菌株作为待选菌种进发酵培养(发酵容器可用微孔板或者锥形瓶，为提高诱变效率可以尽量缩小发酵体积)。

(4)磷酸香草醛测定油脂含量的标准曲线绘制：去释放发酵液，经过数倍稀释(使含油量保持在0～10g/L内)测定OD

(5)磷酸香草醛反应法快速测定菌体油脂含量：取均匀发酵液0.5mL，加入1.5mL无菌水洗涤，8000r/min离心5min，重复2次。2mL无菌水稀释后，振荡均匀，取0.1mL菌悬液置于25mL具塞试管中(蒸馏水为对照样)，加入2mL浓度为98％的H

实施例2Sn-2位ARA油脂生产

1.种子培养基的配制：葡萄糖50g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠1.4g/L。

2.发酵培养基的配制：葡萄糖60g/L、谷氨酸钠5g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾0.2g/L；氯化钠1.4g/L。

3.种子培养：将本发明的高山被孢霉菌种A1.0(CCTCC：M20222092)摇瓶种子培养液按照10％的接种比例加入到一级发酵种子罐中，搅拌转速为110r/min，通气量0.9m

4.发酵培养：将一级种子液按照10％的比例接种至发酵罐中进行发酵培养，在培养过程中搅拌转速为70r/min，培养温度28.5℃，通气量控制在750m

5.油脂提取：当发酵培养结束后，将发酵液进行过滤，烘干，然后用食品级正丁烷进行浸泡12h，最后将溶剂与油脂分离，回收溶剂，得到ARA油脂。

对比例1Sn-2位ARA油脂生产(培养基配方不同于实施例2)

1.种子培养基配制：葡萄糖50g/L、酵母浸膏20g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠1.4g/L。

2.发酵培养基配制：葡萄糖45g/L、蛋白胨10g/L、玉米浆干粉10g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠1.4g/L。

3.种子培养：将本发明的高山被孢霉菌种A1.0(CCTCC：M20222092)摇瓶种子培养液按照10％的接种比例加入到一级发酵种子罐中，搅拌转速为110r/min，通气量0.9m

4.发酵培养：将一级种子液按照10％的比例接种至发酵罐中进行发酵培养，在培养过程中搅拌转速为70r/min，培养温度28.5℃，通气量控制在750m

5.油脂提取：当发酵培养结束后，将发酵液进行过滤，烘干，然后用食品级正丁烷进行浸泡12h，最后将溶剂与油脂分离，回收溶剂，得到了ARA油脂。

对比例2Sn-2位ARA油脂生产(发酵工艺参数不同于实施例2)

1.种子培养基的配制：葡萄糖50g/L、谷氨酸钠3g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁3g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、氯化钠1.4g/L。

2.发酵培养基的配制：葡萄糖60g/L、谷氨酸钠5g/L、玉米浆10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾0.2g/L；氯化钠1.4g/L。

3.种子培养：将本发明的高山被孢霉菌种A1.0(CCTCC：M20222092)摇瓶种子培养液按照10％的接种比例加入到一级发酵种子罐中，搅拌转速为180r/min，通气量控制在0.65vvm，培养温度29℃、pH为7.5的条件下进行一级种子培养，使Sn-2位ARA菌种生长到达对数期，获得一级种子液。

4.发酵培养：将一级种子液按照10％的比例接种至发酵罐中进行发酵培养，在培养过程中搅拌转速为90r/min，培养温度29℃，通气量控制在0.9vvm，通过采用间歇式添加氨水的方式来控制发酵液的pH为7.5，发酵过程前期将葡萄糖的浓度控制在50g/L～63g/L，当糖浓度低于50g/L时采用50～60％的葡萄糖溶液进行补糖，发酵至90h后停止流加补糖，直至葡萄糖消耗完全，发酵周期为120h。

5.油脂提取：当发酵培养结束后，将发酵液进行过滤，烘干，然后用食品级正丁烷进行浸泡12h，最后将溶剂与油脂分离，回收溶剂，得到了ARA油脂。

实施例3不同处理的发酵结果比较

按照实施例2的步骤，以实施例1诱变前高山被孢霉和诱变后的高山被孢霉A1.0(CCTCC：M20222092)作为发酵菌株，分别发酵并得到了相应的ARA油脂。分别检测产品的Sn-2ARA含量、ARA含量、总油。

按照对比例1的步骤，以诱变后的高山被孢霉菌株CCTCC：M20222092为发酵菌株，以不同于实施例2发酵配方的培养基为原料以及相同的发酵控制参数进行发酵培养并得相应的ARA油脂，检测其Sn-2ARA含量、ARA含量、总油。

按照对比例2的步骤，以诱变后的高山被孢霉菌株CCTCC：M20222092为发酵菌株，以相同发酵配方的培养基为原料，但是选择不同于实施例2的发酵过程控制参数进行发酵培养并得相应的ARA油脂，检测其Sn-2ARA含量、ARA含量、总油。

总油：指每100g发酵干菌体中总脂肪的重量。

ARA含量：指每100g油脂中ARA的重量。

Sn-2 ARA含量：指Sn-2ARA含量占ARA含量的比值。

本发明中ARA含量的测定可参照GB5009.168方法进行测定。

本发明中Sn-2位ARA含量的测试方法如下：

1)称取0.1g试样于10mL离心管中，加入约30mg脂肪酶(猪胰脂酶)和2mL 1mol/L三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，振摇均匀，然后加入0.5mL 1‰胆酸钠溶液和0.2mL氯化钙溶液，盖上塞子小心摇匀，立即将离心管放入40℃的水浴锅中，保持振摇1min。从水浴锅中取出离心管，在40℃下，用振荡器剧烈震荡2min，立即加入1ml盐酸和1ml二氯甲烷，用振荡器剧烈震荡，离心分离，用注射器将有机层转移，并用0.45um的滤膜过滤到液相色谱样品中备用。

2)液相色谱分离：流动相为乙腈(含0.1％冰乙酸):二氯甲烷＝50:50；色谱柱为氨基柱4.6mm×250mm,5um；柱温40℃；流速1ml/min；蒸发光散射检测器，偏移管70℃，雾化气压力0.3Mpa.

3)色谱柱分离单甘脂：注入40ul单甘脂标准品于液相色谱仪中，确定单甘脂的保留时间，然后注入40ul样品于液相色谱仪，根据单甘脂保留时间收集单甘脂馏分。

4)将收集的单甘脂用氮吹仪吹干，加入1ml正己烷溶解，加入0.2ml氢氧化钾甲醇(2mol/L)溶液，剧烈振摇2min，静置分层，将正己烷层转移至气相色谱样品瓶中备用。

5)参照GB5009.168方法进行脂肪酸测定。

本发明中总油的测定方法如下：

1)取一定量的发酵液，过滤，烘干，粉粹备用；

2)称取4～5g(精确到0.001g)粉粹后的粉末于滤纸筒中，然后将滤纸封紧，勿使菌粉漏出。

3)将滤纸筒放入直滴式脂肪抽提器的抽提室中，在下面接上已经恒重的250ml平底烧瓶，并在平底烧瓶中加入适量(约30ml)的石油醚，然后将平底烧瓶接在冷凝管上，使其保持垂直。

4)回流提取2h后，将平底烧瓶中的石油醚脱溶回收，然后将油脂105℃恒温干燥2h称重。

5)称量瓶前、后两次重量的绝对差值除以取样量等于菌体中的总油含量。

表1诱变前、后菌株的发酵结果比较

由表1的试验结果可以看出，诱变后的菌株产Sn-2ARA的含量明显要高于诱变前。另外，同样是采用了诱变后的菌株，但是实施例2制备的ARA油脂中Sn-2ARA大幅度提高，原因可能在于适量含固量的玉米浆中不仅含有氨基态氮，还含有其它有助于高山被孢霉生长的营养物质，以及生产过程中大通气量给微生物创了一个良好的有氧化环境，促进其加速代谢以及脂肪的积累，同时促进了Sn-2ARA的富集。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方法，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。