一种产气克雷伯氏菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种产气克雷伯氏菌及其应用。

背景技术

微生物与人类长期共存，但对于二者的关系直到近20多年来才受到广泛关注。2000年，Lederberg首次提出了“微生物群”的概念，并同时提出其与人类健康及疾病相关的可能性。人类肠道具有最大量和最丰富的细菌群落，总数约为10

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种产气克雷伯氏菌及其应用。所述技术方案如下：

第一方面，提供一种产气克雷伯氏菌，所述克雷伯氏菌的16S rDNA的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，该菌株命名为Klebsiella aerogenes YJ1(Klebsiella aerogenesYJ1)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为62700，保藏日期为2022年8月15日。

第二方面，提供一种上述第一方面所述的克雷伯氏菌在制备抗炎药物中的应用。

第三方面，提供一种上述第一方面所述克雷伯氏菌在制备治疗免疫性疾病药物中的应用。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明从健康人肠道菌落中筛选出的单一的产气克雷伯氏菌，通过斑马鱼免疫功能检测证明其具有免疫增强作用，具体表现为具有改善T细胞减少功效和巨噬细胞吞噬功能促进功效，可单独使用或与其他免疫活性成分联合应用于炎性或免疫性疾病。本发明克服了FMT法治疗过程中菌群来源及质量监控方面存在的风险，提供了一种可以安全地规范化生产和应用的免疫疾病治疗方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例中菌株X10与相关种的16S rDNA系统发育树图；

图2是本发明实施例中斑马鱼T细胞荧光强度分析示意图；

图3是本发明实施例中样品处理后斑马鱼T细胞荧光强度典型图；

图4是本发明实施例中样品处理后斑马鱼T细胞荧光强度图；

图5是本发明实施例中斑马鱼荧光微球残留数量分析示意图；

图6是本发明实施例中样品处理后斑马鱼荧光微球残留数量典型图；

图7是本发明实施例中样品处理后斑马鱼荧光微球残留数量图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

(一)菌株分离

将健康人的粪便加生理盐水离心后的上清液按不同稀释倍数稀释后铺板，在厌氧环境下培养，挑选菌落检测细菌纯度，经过多轮筛选后获得100％的单一菌株X10(Klebsiella aerogenes YJ1)。

(二)菌株鉴定

(1)菌株X10与相关种的16S rDNA序列系统发育进化树

采用MEGA7软件，临位连接法显示菌株X10与相关种的16S rDNA系统发育树，进行1000次的相似度重复计算，结果如图1所示，图1中发育树节点只显示Bootstrap值大于50％数值，上标的“T”表示模式菌株。

(2)recN基因序列同源性矩阵表

序列同源性数据(同源性＝1-差异率X100％)。

(3)16S rDNA序列

菌株X10的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

(4)微生物生理生化试验

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(三)增强免疫力功效实验

1.检测材料

1.1.样品配制信息

供试品A和供试品B，分别为Klebsiella aerogenes YJ1在LB培养基中培养后的冻干粉，及其与泥鳅多糖按重量比1:1配制的混合物，均用超纯水配制成20.0mg/mL母液，-20℃分装储存。

阳性对照：百令胶囊，胶囊内容物为棕色粉末，批号2111064，杭州中美华东制药有限公司，阴凉、干燥储存，用标准稀释水配制成150mg/mL母液，现配现用。

1.2.实验动物

斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO

转基因T细胞红色荧光品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3天(3dpf)的斑马鱼用于样品改善T细胞减少功效最大检测浓度(MTC)测定及其功效评价。

野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为3dpf的斑马鱼用于样品巨噬细胞吞噬功能促进功效MTC测定及其功效评价。

1.3.仪器、耗材与试剂

解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；电动聚焦连续变倍荧光显微镜(AZ100，Nikon，Japan)；显微注射仪(IM-300，Narishige，Japan)；拉针仪(PC-10，Narishige，Japan)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(批号BB1000324，浙江贝兰伯生物科技有限公司，China)。

酒石酸长春瑞滨注射液(批号190401，江苏豪森药业股份有限公司，China)；氯化钠注射液(批号S21091609，湖南科伦制药有限公司，China)；carboxylate-modifiedpolystyrene，fluirescent red荧光微球(批号MKCB2036V，Sigma，USA)；甲基纤维素(批号C2004046，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)。

2.检测方法

2.1.改善T细胞减少功效MTC测定

随机选取3dpf转基因T细胞红色荧光品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表3)，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼T细胞减少症模型。28℃处理2天后，测定样品对模型斑马鱼的MTC。

表3样品改善T细胞减少功效浓度摸索实验结果(n＝30)

从表3的结果可以看出，供试品A和供试品B改善T细胞减少功效MTC均为125μg/mL。

2.2.改善T细胞减少功效评价

随机选取3dpf转基因T细胞红色荧光品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表4)，阳性对照百令胶囊15.0μg/mL，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均静脉注射酒石酸长春瑞滨注射液建立斑马鱼T细胞减少症模型。28℃处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼T细胞荧光强度，以该指标的统计学分析结果评价样品改善T细胞减少功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

表4样品改善T细胞减少功效评价实验结果(n＝10)

与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

表4的结果显示，供试品A和供试品B均具有改善T细胞减少功效。详见图2、图3和图4。

2.3.巨噬细胞吞噬功能促进功效MTC测定

随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表5)，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。28℃处理2天后，换液。28℃继续处理2天后，测定样品对正常斑马鱼的MTC。

表5样品巨噬细胞吞噬功能促进功效浓度摸索实验结果(n＝30)

表5的结果显示，供试品A和供试品B巨噬细胞吞噬功能促进功效MTC均为62.5μg/mL。

2.4.巨噬细胞吞噬功能促进功效评价

随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予样品(浓度见表6)，阳性对照百令胶囊15.0μg/mL，同时设置正常对照组，每孔容量为3mL。各实验组均静脉注射荧光微球。28℃处理2天后，换液。28℃继续处理2天后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于荧光显微镜下拍照，用Image-J图像处理软件分析并采集数据，分析斑马鱼荧光微球残留数量，以该指标的统计学分析结果评价样品巨噬细胞吞噬功能促进功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

表6样品巨噬细胞吞噬功能促进功效评价实验结果(n＝10)

与正常对照组比较，*p<0.05，***p<0.001。

表6结果显示，供试品A和供试品B均具有巨噬细胞吞噬功能促进功效。详见图5、图6和图7。

本发明从健康人肠道菌落中筛选出的单一的产气克雷伯氏菌，通过斑马鱼免疫功能检测证明其具有免疫增强作用，具体表现为具有改善T细胞减少功效和巨噬细胞吞噬功能促进功效，可单独使用或与其他免疫活性成分联合应用于炎性或免疫性疾病。本发明克服了FMT法治疗过程中菌群来源及质量监控方面存在的风险，提供了一种可以安全地规范化生产和应用的免疫疾病治疗方法。

以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。