一株发酵粘液乳杆菌CYQ09及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株发酵粘液乳杆菌CYQ09及其应用。

背景技术

放疗是治疗盆腔恶性肿瘤最有效的手段之一，约35％～61％的盆腔恶性肿瘤患者接受过放疗。虽然放疗可提高肿瘤的局部控制率，但正常组织在辐射暴露后不可避免地会出现放射损伤。此外，未暴露在辐射条件下的组织由于辐射诱发旁观者效应也将表现出类似于辐射暴露的损伤情况。据报道，约75％～81％的患者进行盆腔放疗后会出现放射性肠损伤，且放射性肠损伤常导致患者生活质量下降，治疗依从性差，延长治疗疗程，影响整体生存预后。因此，有效缓解放射性肠损伤，从而改善患者生活治疗和整体生存预后，是全球肿瘤治疗需要。

目前国内针对放射性肠损伤的治疗仅存在专家共识，尚无具有较高证据级别的指南可供参考，临床上常采用药物治疗。然而以非甾体类消炎药、类固醇类激素、抗生素为首的药物治疗只能改善局部炎症而无法改善肠道菌群紊乱，总体治疗效果不佳；同时，上述药物本身亦会引起各种不良反应，如恶心、呕吐等，限制了其广泛应用。肠道菌群在放射性肠损伤的发生、发展中发挥重要作用。低剂量辐射即可引起肠黏液层变薄及通透性增加；辐射还通过活性氧直接引起厌氧细菌死亡，导致菌群紊乱，加速细菌异位，加重局部炎症。近年来，已有不少学者通过基础研究发现补充益生菌可缓解放射性肠损伤，这为治疗急性放射性肠损伤提供了一条新的策略。

发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum)为乳杆菌属、发酵粘液乳杆菌种，是无质粒、厌氧耐酸、不产芽孢的革兰氏阳性菌，大多存在于人和动物肠道内，具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素、产短链脂肪酸等生物学特点。有大量的实验表明，发酵粘液乳杆菌能长期定植于宿主肠道内，并发挥重要的调节肠道菌群功能。同时，发酵粘液乳杆菌具有治疗炎症性肠病、缓解腹泻、减少肥胖和调节宿主免疫力等作用，已成为国际上文献记载多、应用广的益生菌之一。然而，现有的发酵粘液乳杆菌对人体的胃液和肠液的耐受性较差，导致发酵粘液乳杆菌在宿主胃肠道中发挥作用有限，且产短链脂肪酸含量低，进而影响发酵粘液乳杆菌的治疗效果。因此，寻找一种能够耐受宿主胃液和肠液的发酵粘液乳杆菌具有极其重要的意义。

发明内容

本发明提供一株发酵粘液乳杆菌CYQ09及其应用，该发酵粘液乳杆菌菌株能够通过产生大量短链脂肪酸抑制射线诱发的炎症反应，且具有耐受人体的胃液和肠液的特性，可用于预防和治疗放射性肠损伤。

根据本发明的第一个方面，提供一株发酵粘液乳杆菌CYQ09，该发酵粘液乳杆菌菌株于2022年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC 62346。

本发明从来源于广东省广州市的健康成年人的鲜粪便中分离得到一株新的发酵粘液乳杆菌菌株，分类命名为Limosilactobacillus fermentum CYQ09。与现有的发酵粘液乳杆菌相比，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09为本土来源的优良菌株，具体体现为：该菌株能够产生短链脂肪酸等细菌培养产物，能够改善肠道炎症；该菌株能够耐受人工胃液和肠液，在胃、肠内的存活率高，能够在肠道内定植，恢复肠道菌群稳态；并且，该菌株能够减少肠道干细胞在辐射条件下的损伤，加速肠道组织修复，进而延长患者的生存时间。另外，与传统治疗放射性肠损伤的药物相比，该发酵粘液乳杆菌菌株CYQ09对人体无明显毒副作用，安全性高。综上所述，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09具有许多优良的特性，能够用于有效预防和治疗放射性肠损伤引起的消化系统疾病，解决了现有技术中存在的无法有效治疗盆腔恶性肿瘤放疗后出现的放射性肠损伤的问题，在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的药物或对辐射危害有辅助保护功能的食品、保健品中具有巨大的应用前景。

根据本发明的第二个方面，提供上述发酵粘液乳杆菌CYQ09在制备用于预防和/或治疗消化系统疾病的药物中的应用。

优选地，上述消化系统疾病包括腹痛、腹胀、恶心、呕吐、腹泻、便秘中的至少一种。

优选地，上述消化系统疾病由肠损伤引起。

优选地，上述肠损伤为放射性肠损伤。

根据本发明的第三个方面，提供一种用于预防和/或治疗消化系统疾病的药物，该药物包括上述发酵粘液乳杆菌CYQ09或上述发酵粘液乳杆菌CYQ09的培养物。

将本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09或其培养物应用于用于预防和/或治疗放射性肠损伤引起的消化系统疾病的药物的制备中，制备得到的药物能够有效预防和/或治疗放射性肠损伤，解决了现有技术中存在的无法有效治疗盆腔恶性肿瘤放疗后出现的放射性肠损伤的问题。

优选地，上述消化系统疾病包括腹痛、腹胀、恶心、呕吐、腹泻、便秘中的至少一种。

优选地，上述消化系统疾病由肠损伤引起。

优选地，上述肠损伤为放射性肠损伤。

优选地，上述药物还包括药学上可接受的辅剂：药学上可接受的辅剂包括稳定剂、湿润剂、乳化剂、粘合剂、等渗剂中的至少一种。

优选地，上述药物呈片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、冻干剂中的至少一种。

根据本发明的第四个方面，提供上述发酵粘液乳杆菌CYQ09在制备对辐射危害有辅助保护功能的食品或保健品中的应用。

根据本发明的第五个方面，提供一种对辐射危害有辅助保护功能的食品，该食品包括上述发酵粘液乳杆菌CYQ09或上述发酵粘液乳杆菌CYQ09的培养物。

将本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09或其培养物应用于对辐射危害有辅助保护功能的食品或保健品的制备中，制备得到的食品或保健品能够对辐射危害起到一定的辅助保护功能。

根据本发明的第六个方面，提供一种可特异性识别上述发酵粘液乳杆菌CYQ09的核苷酸序列，该核苷酸序列如SEQ ID：1所示。

本方案提供的核苷酸序列能够将本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09与其他发酵粘液乳杆菌分离株进行有效区分。

根据本发明的第七个方面，提供一种可特异性识别上述发酵粘液乳杆菌CYQ09的引物组，该引物组包括如SEQ ID：2和SEQ ID：3所示的核苷酸序列。

本方案提供的引物组能够对待测菌的DNA进行PCR反应扩增，如果扩增出384bp的产物，则说明待测菌为发酵粘液乳杆菌CYQ09，如果没有扩增出384bp的产物，则说明待测菌不是发酵粘液乳杆菌CYQ09。

根据本发明的第八个方面，提供一种鉴别上述发酵粘液乳杆菌CYQ09的方法，以上述引物组作为特异性扩增引物，以待测发酵粘液乳杆菌的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，获得PCR产物，利用测序或电泳对PCR产物进行鉴定。

附图说明

图1为实施例1分离培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09的菌落形态图。

图2为实施例1分离培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09的菌体革兰染色结果图。

图3是实施例2对发酵粘液乳杆菌CYQ09进行鉴定时构建得到的16S rDNA系统进化发育树。

图4为实施例2对发酵粘液乳杆菌CYQ09进行鉴定时的糖酵解生化试验结果图。

图5为实施例3对发酵粘液乳杆菌CYQ09的全基因组测序图和基因组圈图。

图6为实施例4对发酵粘液乳杆菌CYQ09的小鼠体内安全性评估结果图。

图7为实施例7利用气相色谱—质谱对发酵粘液乳杆菌CYQ09产短链脂肪酸含量检测结果图。

图8为实施例8中发酵粘液乳杆菌CYQ09体外减轻小肠类器官辐射损伤的实验结果图。

图9为实施例9中发酵粘液乳杆菌CYQ09治疗放射性肠损伤小鼠后的生存曲线图。

图10为实施例9中发酵粘液乳杆菌CYQ09治疗放射性肠损伤小鼠后肠组织的HE染色图(100×)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1发酵粘液乳杆菌CYQ09的分离

本实施例从来源于广东省广州市的健康成年人的鲜粪便中分离得到一株新的发酵粘液乳杆菌，利用形态学特征、培养性状和生理生化特征及遗传特性16SrDNA将该乳杆菌鉴定为发酵粘液乳杆菌CYQ09，该发酵粘液乳杆菌菌株于2022年4月1日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号广东省微生物研究所，分类命名为Limosilactobacillus fermentum CYQ09，保藏编号为GDMCC 62346。

本实施例收集来源于广东省广州市的健康成年人鲜粪便后，按照固液比为1：1000(g/mL)的比例向鲜粪便中加入PBS缓冲液进行稀释。取5μL上述经过稀释后的鲜粪便样本接种于MRS培养基中，于37℃恒温厌氧培养48小时，然后挑取单菌落并接种至MRS液体培养基中进行增菌培养。

其中，上述培养过程中所涉及的MRS培养基配方为：蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2g，琼脂15～17g，水1000mL，pH调至6.12～6.2。

本实施例经过分离和培养后得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09的形态学特征如下：

(1)菌落特征

本实施例将经过分离和培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09在平板上划线分离，于37℃恒温厌氧培养48小时，其菌落形态如图1所示。由图1可知，发酵粘液乳杆菌CYQ09生长状态良好，菌落为乳白色，圆型，凸起，边缘整齐。

(2)菌体特征

本实施例对经过分离和培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09的菌体形态进行观察，同时利用革兰氏染色法对其进行染色，结果如图2所示。由图2可知，发酵粘液乳杆菌CYQ09呈短小的杆状，不运动，无芽孢，兼性厌氧，革兰氏染色阳性。

实施例2发酵粘液乳杆菌CYQ09的鉴定

本实施例利用细菌基因组DNA试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)提取实施例1分离培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09的细菌总DNA，提取方法步骤根据试剂盒说明书进行。使用乳杆菌16S rDNA的通用引物对提取的DNA进行PCR扩增。

16S rDNA的通用引物对核苷酸序列为：

正向引物27f：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

反向引物1492r：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；

引物由北京擎科生物有限公司合成。

PCR扩增反应体系共20μL，模板2μL，TaKaRa Premix TaqTM 10μL，正向引物、反向引物各1μL，双蒸水6μL。同时设置阴性对照(control)，在阴性对照反应体系中，模板以双蒸水代替，其余成分一样。

PCR扩增反应条件：94℃5min；94℃60s，60℃60s，72℃90s，30个循环；72℃10min；4℃保存。

PCR电泳后进行切胶，回收目的条带凝胶并由上海生工生物有限公司测序(核苷酸序列如SEQ ID：4所示)。在美国NCBI数据库，应用BLAST软件工具对发酵粘液乳杆菌CYQ0916S rDNA基因序列进行比对，并用MEGA X构建系统发育树，结果如图3所示。

由图3可知，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09的测序结果，与发酵粘液乳杆菌的16S rDNA序列同源性达到99％，鉴定CYQ09菌株为发酵粘液乳杆菌，命名为CYQ09，即本发明经过分离和培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09。

另外，本实施例利用糖发酵实验对发酵粘液乳杆菌CYQ09进行进一步鉴定：

根据新型微生物微量生化系列鉴定管说明书进行操作，检测分离所得的待选菌株CYQ09的生化代谢物，结果如图4和表1所示。结合伯杰细菌鉴定手册数据以及图4和表1可知，该菌种的生理生化特征与发酵粘液乳杆菌标准株ATCC14931的生理生化性质基本一致。

表1发酵粘液乳杆菌CYQ09生化鉴定结果

注：“+”为反应阳性，“-”为反应阴性。

实施例3发酵粘液乳杆菌CYQ09的全基因组测序

提取实施例1分离培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09的基因组DNA，利用Nanodrop、Qubit和0.35％琼脂糖凝胶电泳进行纯度、浓度和完整性质检。然后，利用BluePippin全自动核酸回收系统回收大片段DNA，并使用SQK-LSK109连接试剂盒进行文库构建，上机测序，对下机后的原始数据进行质控，过滤低质量和长度过短的reads；随后进行基因组组装，对过滤后的reads进行从头组装，并对组装后的draft基因组进行纠错。然后进行基因组组分分析，以及基因组功能注释，包括PHI-base、CARD、TCDB数据库注释。同时，还进行基因组分析和基因组图谱分析。发酵粘液乳杆菌CYQ09的全基因组测序结果如图5所示。

由图5的基因组测序图和基因组圈图可知，发酵粘液乳杆菌CYQ09的基因组大小为2.06Mb，GC比为51.83％，其基因组含有2012个CDS区、2138bp的重复序列、58个tRNA和15个rRNA。基因组功能注释提示发酵粘液乳杆菌CYQ09含有1个潜在的耐药基因poxtA，但不含水平基因转移获得的毒力基因。

实施例4发酵粘液乳杆菌CYQ09的安全性评估

本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09是从健康成人鲜粪便中分离得到的益生菌，从细菌来源上保证其安全性和有效性。另外，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09在人类肠道环境中定殖和繁殖后，仅仅是依附于宿主的肠上皮细胞，能够成为肠道粘膜的一层生物屏障，提升宿主肠道粘膜屏障能力，并且可以活菌形式直接作用于人体，保证了安全性。

本实施例根据中国食品科学技术学会发布的《食品用益生菌通则》，使用微量肉汤稀释法检测发酵粘液乳杆菌CYQ09对8种抗生素的敏感性。该8种抗生素为：四环素、链霉素、盐酸环丙沙星、克林霉素、万古霉素、氯霉素、氨苄西林和庆大霉素。将生长至对数生长期的乳杆菌悬液调整至1×10

表2发酵粘液乳杆菌CYQ09对不同抗生素的药敏情况

由表2可知，发酵粘液乳杆菌CYQ09对四环素、链霉素、盐酸环丙沙星、克林霉素、万古霉素、氯霉素、氨苄西林和庆大霉素的MIC依次为：8mg/L、32mg/L、256mg/L、4mg/L、256mg/L、4mg/L、1mg/L和16mg/L，即该菌对通则规定的6种抗生素菌敏感。

另外，为了进一步评估发酵粘液乳杆菌CYQ09的安全性，本实施例选用3只6～8周龄的C57BL/6小鼠进行实验。实验前动物在动物房适应性喂养5天。实验动物及实验动物房符合国家规定，选用标准配合饲料，饮食饮水不受限制。对小鼠进行发酵粘液乳杆菌CYQ09灌胃，每天灌胃吸光度OD＝1的CYQ09菌液0.2mL。饲养结束后，断颈处死实验动物，采用手术刀解剖取出器官，并对小鼠重要器官进行观察，结果如图6所示。

由图6可知，小鼠重要器官肾、肝、脾、胃、盲肠、大肠未见异常，这说明本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09在小鼠体内应用安全。

实施例5发酵粘液乳杆菌CYQ09对人工胃液具有较好的耐受作用

分别配制pH值为2.0，3.0，4.0的人工胃液。取实施例1分离培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09，用无菌PBS缓冲液稀释为10

由表3可知，与发酵粘液乳杆菌标准株ATCC 14931相比，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09表现出较好的耐人工胃液能力。

表3 CYQ09与ATCC14931耐受人工胃液性能比较

实施例6发酵粘液乳杆菌CYQ09对人工肠液具有较好的耐受作用

配制含pH值为6.8含胆盐的人工肠液。取实施例1分离培养得到的发酵粘液乳杆菌CYQ09，用无菌PBS缓冲液稀释为10

表4 CYQ09与ATCC14931耐受人工肠液性能比较

由表4可知，与发酵粘杆菌标准株ATCC14931相比，发酵粘液乳杆菌CYQ09表现出较好的耐人工肠液能力。

实施例7发酵粘液乳杆菌CYQ09具有较强产短链脂肪酸能力

取吸光度调至OD

配制随行空白样本：取100μL生理盐水，加入5μL内标(IS)，5μL去离子水，150μL甲醇，40μL 2.5％ H

配制质控样本：取100μL生理盐水，加入5μL内标(IS)，5μL STD-4(已稀释1000倍的标准品)，150μL甲醇，40μL 2.5％ H

利用气相色谱—质谱测定上清中短链脂肪酸含量，即对待测样本中的短链脂肪酸含量进行检测，结果如图7所示。

由图7可知，与发酵粘液乳杆菌标准株ATCC14931相比，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09表现出更好的产短链脂肪酸能力，短链脂肪酸总量更高，尤其乙酸、丙酸、丁酸产量较ATCC14931高。

实施例8发酵粘液乳杆菌CYQ09可增加小肠类器官对辐射损伤耐受作用

提取小鼠小肠隐窝进行培养获得小肠类器官，对于培养第7天类器官进行如下操作：Control组于37℃、5％CO

由图8可知，与发酵粘液乳杆菌标准株ATCC14931相比，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09上清培养条件下的类器官能维持较好形态，说明发酵粘液乳杆菌CYQ09对辐射性损伤具有治疗作用。

实施例9发酵粘液乳杆菌CYQ09可减少腺体损伤

选取4周龄C57BL/6小鼠24只，正常饲养一周后随机分成4组：Control组(n＝6)，全腹照射组(n＝6)，全腹照射+ATCC14931组(n＝6)，全腹照射+CYQ09组(n＝6)，按照如下步骤进行处理：

第1～7天，Control组小鼠采用0.2mL PBS缓冲液进行灌胃，全腹照射+ATCC14931组、全腹照射+CYQ09组分别采用0.2mL吸光度OD＝1的ATCC14931、CYQ09菌液进行灌胃；

第8天，各组小鼠禁食禁水2小时后，麻醉小鼠，除control组外均利用6MeV X射线进行全腹照射，剂量为12Gy，然后解除禁食禁水；

第9～11天，Control组小鼠采用0.2mL PBS缓冲液进行灌胃，全腹照射+ATCC14931组、全腹照射+CYQ09组分别采用0.2mL OD＝1的ATCC14931、CYQ09菌液进行灌胃；

第32天对小鼠进行解剖以检测各项指标。

各组小鼠生存时间进行Kaplan Meier生存分析，结果如图9所示。由图9可知，Control组小鼠全部存活，全腹照射组小鼠在实验结束前均已全部死亡，全腹照射+ATCC14931组和全腹照射+CYQ09组小鼠在实验终止时均有小鼠存活，且与全腹照射+ATCC14931组相比，全腹照射+CYQ09组小鼠存活数目更多，存活时间更长。上述结果说明本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09在放射性损伤小鼠体内能够显著改善生存，且效果较标准株ATCC14931要好。

利用苏木精-伊红对经过上述处理的各组小鼠进行染色(HE染色)，结果如图10所示。由图10可知，全腹照射组出现腺体组织破坏，炎症浸润等肠组织病理损伤，而全腹照射+CYQ09组腺体结构损伤减少，炎症细胞浸润显著减少。上述结果说明本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09能够减轻放射性肠损伤。

实施例10发酵粘液乳杆菌CYQ09的特异性分子靶标挖掘

下载NCBI数据库中其他155株发酵粘液乳杆菌的全基因组数据，利用Prokka(v1.11)、Roary(v3.11.2)软件针对上述155株发酵粘液乳杆菌和本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09进行泛基因组分析。获得核心基因后，利用MEGA X(v10.2.2)识别碱基取代密度较高的基因。基于上述分析流程获得发酵粘液乳杆菌CYQ09不同于其他发酵粘液乳杆菌的特异性序列。采用Primer Premier 5软件针对特异性序列进行引物设计，获得可特异性识别发酵粘液乳杆菌CYQ09的特异性分子靶标序列SEQ ID：1。

采用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)验证本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09的特异分子识别靶标序列的有效性。检测模板为细菌的DNA，DNA提取方法参考天根细菌基因组DNA提取试剂盒，扩增引物序列如表5所示。本实施例的PCR反应体系与PCR反应条件均与实施例1所涉及的PCR反应体系与PCR反应条件相同。PCR结束后送生工公司进行测序，分析其产物长度为384bp，且如SEQ ID：1所示。

表5扩增引物序列

综上所述，本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09能够通过产生大量短链脂肪酸，以抑制射线诱发的炎症反应，减少肠道干细胞在辐射条件下的损伤，加速肠道组织修复，延长患者的生存时间，且具有耐受人体的胃液和肠液的特性，在胃、肠内的存活率高，能够在肠道内定植，恢复肠道菌群稳态。另外，与传统放射性肠损伤的药物相比，该发酵粘液乳杆菌菌株CYQ09对人体无明显毒副作用，安全性高，可以减少药物带来的不良反应以及克服药物治疗有效率低的问题。将本发明提供的发酵粘液乳杆菌CYQ09或其培养物应用于预防和/或治疗放射性肠损伤的药物或食品的制备中，能够用于有效预防和/或治疗放射性肠损伤引起的消化系统疾病，解决了现有技术中存在的无法有效治疗盆腔恶性肿瘤放疗后出现的放射性肠损伤的问题，在制备预防和/或治疗放射性肠损伤的药物或食品中具有巨大的应用前景。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。